Abstract
La mayoría de todas las enfermedades conocidas se acompañan de trastornos del sistema cardiovascular. Los estudios sobre la complejidad de las vías que interactúan activados durante patologías cardiovasculares son, sin embargo, limitadas por la falta de métodos robustos y fisiológicamente relevantes. Con el fin de modelar eventos vasculares patológicas hemos desarrollado un ensayo in vitro para el estudio de la interacción entre el endotelio y la sangre entera. El ensayo consiste en células endoteliales humanas primarias, que se colocan en contacto con sangre humana entera. El método utiliza la sangre nativa con muy poco o ningún anticoagulante, que permite el estudio de las interacciones entre los delicados componentes moleculares y celulares presentes en un vaso sanguíneo.
Hemos investigado la funcionalidad del ensayo mediante la comparación de activación de la coagulación por diferentes volúmenes de sangre incubadas con o sin células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Mientras que un volumen de sangre mayor contribuyó aun aumento en la formación de complejos de antitrombina trombina (TAT), la presencia de HUVEC dio como resultado reducción de la activación de la coagulación. Además, se aplicó análisis de imagen de unión de leucocitos a HUVEC estimuladas con factor de necrosis tumoral (TNF) y se encontró la presencia de células CD16 + a ser significativamente mayor en las células estimuladas TNF en comparación con células no estimuladas después de contacto con la sangre. En conclusión, el ensayo se puede aplicar para estudiar patologías vasculares, donde se perturban las interacciones entre el endotelio y el compartimiento de sangre.
Introduction
Métodos para el análisis de las interacciones de la sangre vascular en la enfermedad cardiovascular generalmente implican experimentos de investigación animal. Resultados creados en modelos animales experimentales de investigación pueden, sin embargo, tienen poca o ninguna incidencia en las enfermedades humanas. 1,2 Como tal, hay una necesidad de una buena y fiable en modelos in vitro para investigar las interacciones celulares entre el compartimiento de la sangre y las células endoteliales vasculares en un sistema similar a la humana. Por ello, hemos establecido un modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. Esto se basa en un modelo descrito previamente utilizado para investigar las interacciones entre los biomateriales y sangre humana entera. 3 Contrariamente a otras configuraciones in vitro, donde por lo general un número limitado de componentes purificados, es decir, trombocitos, leucocitos o células endoteliales están disponibles, el actual modelo incorpora todos los componentes presentes en un vaso sanguíneo.
La configuración del endotelio arterial cmodelo de cámara de ell está diseñado para permitir el uso de la sangre humana recién extraída con poco o ningún anticoagulante añadido. La sangre almacenada durante períodos de tiempo más largos adquirir los llamados lesiones de almacenamiento donde ruptura de los eritrocitos puede interferir con delicadas interacciones entre la sangre y las células endoteliales. 4
Para evitar la formación de coágulos durante la manipulación de sangre entera ex vivo o bien requiere altas dosis de anticoagulante o que todo el material en contacto con la sangre tiene que ser no activante. Como superficies no activadoras son raros en el entorno de laboratorio, materiales, alternativamente, pueden estar equipados con una capa protectora de heparina inmovilizada. Una capa protectora de heparina inmovilizada (denominado en lo sucesivo como superficie de heparina Corline (CHS)) que se puede aplicar a la mayoría de los materiales de la creación de una superficie donde puede producirse contacto con la sangre sin causar una activación de la cascada de la coagulación. 5 Por lo tanto, mediante el suministro de las cámaras con CHS, el ce endotelial arterialll modelo de cámara permite el uso de concentraciones muy bajas de anticoagulante en la sangre. Evitar la adición de altas concentraciones de anticoagulante en el modelo de cámara endotelial sangre hace que sea posible estudiar interacciones sensibles dentro de un vaso sanguíneo que de otro modo podrían ser enmascarado. 6
El modelo de cámara de las células endoteliales de la sangre se compone de dos cámaras formadas uniendo cilindros de plástico (altura: 8 mm; radio: 9 mm) a un portaobjetos de plástico. Los bordes hacia arriba en los cilindros están equipadas con ranuras que están equipados con juntas tóricas de caucho utilizadas para el sellado de las cámaras contra el portaobjetos de cultivo celular. Las cámaras están sólo parcialmente llenos de sangre como el aire que queda en la cámara mantiene la sangre en movimiento cuando las cámaras se hacen girar posteriormente en una posición vertical (Figura 1).
Con el fin de evaluar la funcionalidad del modelo, hemos realizado experimentos con ya sea un CHS recubierto completamentecámara o de vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC). Dos volúmenes de sangre separadas se analizaron y la formación de trombina antitrombina (TAT) complejos (un marcador indirecto de la coagulación) se midió con ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). A continuación, se evaluó el efecto de los volúmenes de sangre y factor de necrosis tumoral (TNF) estimulado las células endoteliales en el reclutamiento de leucocitos por análisis de imagen.
Figura 1. Configuración del modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. (A) Vista superior dibujo esquemático de la cámara de sangre realizado en PMMA. (B) las células endoteliales humanas primarias son cultivadas en portaobjetos de cámara 1 pocillos. Sangre completa humana fresca se añade a dos cámaras en un portaobjetos de microscopio. Las cámaras y todo el material utilizado para la manipulación de la sangre se tratan con un recubrimiento de protección HS. Después de la eliminación de las paredes de la cell cultura de diapositivas, las células se colocan frente a la sangre y el sistema se sujeta cerrada. cámaras celulares (C) El endotelial sangre se incuban a continuación en virtud de la rotación en 37 ° C. Después, las reacciones en el compartimento de la sangre pueden ser analizadas por ELISA y las células endoteliales pueden ser analizados por microscopía.
Protocol
NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos por venopunción sistema abierto en señal de aprobación ante la Junta de Revisión Ética en Uppsala (Permit No. 2008/264).
1. Las células Siembra
- Células de cultivo primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) a 37 ° C en 5% de CO 2 en matraces T75 recubiertos con gelatina al 1% en PBS pH 7,4.
- Retire el medio de cultivo de un frasco T75 que contiene HUVEC (u otro tipo de células endoteliales humanas primarias) y lavar las células con EDTA 2,1 mM en PBS pH 7,4. Separar las células mediante la adición de 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA y se incubó durante 2 - 3 minutos en 37 ° C.
- Recoger las células por lavado el matraz con 9 ml 10% de FBS en PBS pH 7,4 y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 735 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular cuidadosamente en medio de crecimiento celular endotelial microvascular (CE GMMV) y contar las células en una cámara de Bürker. Semillas 21.000 cells / cm 2 en las diapositivas de cultivo de células de 1 pocillo e incubar a 37 ° C. El HUVEC se confluente después de 1 - 2 días de cultivo. Monitorear la morfología celular y la confluencia diariamente bajo un microscopio de luz.
2. Preparación de sangre entera
- Preparar todas las superficies artificiales que estarán en contacto con la sangre con una doble capa de heparina inmovilizada (CHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Materiales recubiertos CHS protegido del polvo se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses sin pérdida de la función.
- Utilice venopunción sistema abierto para extraer la sangre de un donante sano en breve (<30 min) antes de comenzar el experimento endotelial cámara de sangre. Pareja de una aguja hipodérmica (18 G x 50 mm) a CHS tubo de silicona recubierto (diámetro interno: 2 mm) antes de recoger cuidadosamente la sangre en un tubo de 50 ml recubiertos CHS. Suplemento de sangre con heparina no fraccionada para llegar a una concentración final de 0,75 UI / ml. Mezclar suavemente la sangre por inverting el tubo de 2 - 3 veces.
Modelo 3. Sangre Cámara endotelial
- Fabrique cámaras de sangre (Figura 1A; vista superior) en acrílico polimetilmetacrilato (PMMA) que consta de dos cilindros (altura 8 mm y el radio de 9 mm) que se pegan a una diapositiva de PMMA (25 x 75 mm). Coloque los bordes de los cilindros hacia arriba con juntas tóricas de goma para sellar la cámara de sangre contra los portaobjetos de vidrio con las células endoteliales en cultivo (Figura 1B). Girar las cámaras de sangre conectados a la diapositiva cultivo con células endoteliales a partir de entonces en una posición vertical (Figura 1C).
- Utilice una punta de pipeta CHS recubierto de transferir 1,5 ml de sangre en cada CHS recubiertos cámara teniendo cuidado de no activar la sangre.
- Transferir 1 ml de sangre en tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA para la determinación de las concentraciones de proteína de plasma inicial utilizandoun ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Mezclar con cuidado la sangre y mantener los tubos en hielo.
- Retire las paredes de plástico del cultivo celular portaobjetos de vidrio de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuidadosamente lavar las células en PBS pH 7,4. Asegúrese de eliminar posteriormente tanto líquido como sea posible de las diapositivas. No dejes que las células se sequen.
- Posicionar el cursor en la parte superior de las cámaras de sangre, con células que se enfrenta la sangre. Fije la corredera mediante la colocación de una abrazadera alrededor de la cámara de células endoteliales de sangre. Utilice un portaobjetos de plástico para soporte adicional para evitar la rotura de la lámina de vidrio de cultivo celular al colocar la abrazadera.
- Fijar la cámara de células endoteliales de la sangre en una rueda giratoria (40 cm de diámetro) en lugar de un baño de agua a 37 ° C. Girar cada cámara en la rueda en 0,5 xg durante 30 min.
- Después de la incubación, desmantelar la cámara de células endoteliales en la sangre. Lavar los portaobjetos de cultivo de células en PBS pH 7,4 y fijar las células en hielo frío 1% de paraformaldehído (PFA) fo 10 min. Transferir 1 ml de sangre de cada cámara a tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA y mezclar suavemente los tubos. Mantener los tubos en hielo.
- Centrifugar los tubos a 4.560 xg durante 10 minutos en 4 ° C. Transferir el plasma de la sangre a los nuevos tubos de microcentrífuga y tienda en -70 ° C hasta su posterior análisis.
4. Análisis de sangre endotelial Interacciones
- Lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia con el ratón anti-CD16 humano seguido de cabra secundario anti-ratón Alexa 488 y phalloidin-TexasRed. Realizar cada etapa de tinción durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar los portaobjetos en PBS pH 7,4 entre cada paso. Contratinción los núcleos con DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analizar los componentes sanguíneos unidos a las células endoteliales por microscopía de fluorescencia en combinación con análisis de imagen usando el software de análisis de imagen adecuado tal como CellProfiler.
- Quantify las reacciones en el compartimento de la sangre con trombina-antitrombina (TAT) ELISA según las instrucciones del fabricante de las muestras de plasma.
- Usar herramientas estadísticas adecuadas, por ejemplo., Una prueba t no pareada, para analizar los datos.
Representative Results
La necesidad de la CHS Recubrimiento
Para medir reacciones en sangre entera específicas para los provocados por las células endoteliales, todos los materiales utilizados para la cámara de células endoteliales de sangre deben estar provistas de un revestimiento CHS antes de su uso. Figura 2A (izquierda) muestra una cámara sin recubrimiento después de 30 min de contacto de la sangre con un coágulo claramente visible presente. El tratamiento de la cámara con CHS (Figura 2A, derecha) en el otro lado protege la sangre de activación incontrolada, asegurándose de que los resultados son debido a las interacciones de células endoteliales de sangre.
El efecto del volumen de sangre en la Cámara
La activación de la coagulación es más probable en sangre estancada medida que se incrementa la probabilidad de interacción entre los factores de coagulación activados. En el modelo de cámara de células endoteliales de sangre, la sangre se mantiene en movimiento debido a la circulación de una burbuja de aire dentro de la cámara. En Order para determinar el efecto de los cambios en el volumen de sangre, y por lo tanto también el tamaño de burbuja de aire, una cámara de CHS recubierto se conecta a un portaobjetos de vidrio recubierto de CHS que fue probado con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre entera para 30 min. El volumen de sangre sin ningún movimiento por la burbuja de aire es 2,5 veces más grandes cuando se añade 1,75 ml de sangre a la cámara en comparación a cuando se utiliza 1,5 ml de sangre (Figura 2B). Los TAT-valores medidos sugirieron aumentaron TAT-formación con un mayor volumen de sangre (Figura 2D). Cuando HUVEC (Figura 2C) se incubaron con 1,5 o 1,75 ml de sangre entera, no se observó ninguna diferencia entre los dos grupos, lo que sugiere que las células endoteliales pueden modular la activación de la coagulación (Figura 2D).
El efecto de TNF en el reclutamiento de células de la sangre y la activación de la coagulación
Con el fin de estudiar el efecto de TNF en el reclutamiento de leucocitos, HUVEC fueron treated con 20 ng / ml TNF 4 h antes de contacto con la sangre. Se continuó durante 30 min después de lo cual los portaobjetos de cultivo fueron teñidos para CD16 (Figura 2F), la imagen y el número de células CD16 + se cuantificó - contacto de la sangre - ya sea con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre. El reclutamiento de células CD16 + se incrementó significativamente con el tratamiento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + células / mm 2 (p <0,0001) con 1,5 ml de sangre y 172 a 378 (P <0,0001) con 1,75 ml de sangre. La formación de complejos TAT se midió en las muestras de plasma correspondientes de la sangre incubadas con células ya sea TNF tratado o no tratado (Figura 2G). Células TNF estimulada indujeron una duplicación aproximada de complejos TAT en comparación con las células no tratadas.
HigoUre 2: Funcionalidad del modelo de cámara de células endoteliales de sangre. (A) Cámaras con o sin CHS se incubaron con sangre completa. Sin CHS, se formó un coágulo después de 30 minutos. Medición de la trombina antitrombina (TAT-) complejos, un marcador indirecto de la coagulación en la sangre, incubadas sin CHS era> 6.000 mg / ml. (B) El volumen de sangre no siguió moviéndose por la burbuja de aire que gira variará con diferentes volúmenes de sangre. Con la adición de 1,5 ml de sangre, este volumen será 0,3 ml, mientras que se incrementará a 0,74 ml con la adición de 1,75 ml. (C) HUVEC con imagen formada con microscopía de contraste de fase muestran la morfología típica de células endoteliales de una monocapa confluente antes de contacto con la sangre. (D) los valores de TAT para cámaras completamente CHS recubiertos muestran una ligera diferencia cuando se añaden diferentes volúmenes de sangre. La adición de 1,5 ml de sangre resultó en 35 ± 11 g / ml (n = 7) en comparación con 1,75 ml, lo que resultó en el 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Esta diferencia ya no está presente cuando HUVEC se incuban con los mismos volúmenes de sangre; 66 ± 55 mg / ml de 1,5 ml (n = 5) y 66 ± 29 mg / ml de 1,75 ml (n = 7). (E) Cuantificación del número de células CD16 + presentes en ambos no estimulada o TNF estimulada después de HUVECs contacto con la sangre. El número de células CD16 + se incrementa significativamente con TNFa estimula las células incubadas ya sea con 1,5 ml (basal: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) o 1,75 ml (basal: 172 ± 67 células / mm; TNFa: 378 ± 185 células / mm) de sangre completa (F) Imágenes representativas de no estimulada y TNFa estimulado HUVEC teñidas para phalloidin (rojo), CD16 (verde) y DAPI (azul).. Barra de escala = 250 m (G) La formación de complejos TAT se duplicó aproximadamente por TNFa células estimuladas en comparación con las células no tratadas se incubaron con sangre (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 veces más TAT, n = 3; 1.75 ml: 1,7 ± 1,0 veces más TAT, n = 4). Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar; los valores de p se calcularon mediante pruebas t no apareados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Discussion
Múltiples interacciones entre la sangre y la pared del vaso se mantienen normalmente en un estado de reposo debido a la naturaleza no adhesiva y anti-trombótica del endotelio. 7 Durante condiciones patológicas que implican inflamación, el endotelio se activa con un aumento resultante en la expresión del receptor de adhesión y 8 una capacidad reducida para inhibir la hemostasia. 9 La activación de los sistemas de cascada en la sangre a su vez amplifica la trombogenicidad del endotelio causando más la trombosis y el reclutamiento de leucocitos. 10 Para obtener una mejor comprensión de este delicado interacciones entre las células endoteliales y la sangre entera, tenemos desarrollado un nuevo método in vitro donde las células endoteliales cultivadas se colocan en contacto con la sangre entera. Para nuestro conocimiento, nuestra configuración es el primero en mostrar las células endoteliales incubadas con sangre humana entera con ninguna o muy poca anticoagulante durante períodos de tiempo más largos.
nt "> La sensibilidad de este sistema se activa por punción venosa sistema abierto en combinación con una capa protectora de heparina inmovilizada en todas las superficies puestas en contacto con la sangre. El uso de un sistema abierto durante la obtención de la sangre reduce la activación de los sistemas de cascada durante la punción venosa mientras que permite el uso de una cantidad autodeterminada de anticoagulante. tubos de sangre evacuados disponibles en el mercado pueden, sin embargo, ser utilizados en función de los criterios de valoración previstos del estudio. La concentración final de anticoagulante añadido a los tubos del sistema cerrado más disponibles en el mercado pueden inhibir sensible , y de otra manera difícil de estudiar, las interacciones en la configuración. 6 una superficie protectora heparina elimina la activación adicional de sangre a través de la superficie de contacto por cualquier superficies que no sean las células endoteliales. 5 De hecho, la incubación de la sangre entera suplementado con una pequeña cantidad de heparina no fraccionada en cámara sin la protección de CHS resultó en la formación de coágulos.Además, hubo un aumento de 2 veces en el reclutamiento de células de la sangre hacia TNF activa HUVEC en combinación con una formación de TAT duplicado independientemente del volumen de sangre. Esto verifica la estabilidad del sistema de modelo y también muestra la posibilidad de utilizar un endotelio activado en combinación con la sangre entera. Future en, la cámara de células endoteliales de sangre se puede utilizar para investigar el reclutamiento de células de la sangre hacia las células endoteliales activadas por una variedad de marcadores expresados en las células en diversas condiciones y etapas de activación. Además, el modelo se puede usar en combinación con agentes farmacológicos con el fin de evaluar los efectos sobre las condiciones inflamatorias.
En resumen, mostramos el gran beneficio de la combinación de un modelo de cámara con las células sanguíneas y vasculares humanas para crear un humano completo sistema in vitro para llevar a cabo investigaciones relevantes de la enfermedad vascular.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación (90293501, A0290401, A0290402), del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en virtud de acuerdo de subvención n ° 602699 (DIREKT), la Fundación NovoNordisk, la Fundación Gurli y Edward Brunnberg, Tallo Terapia, Vleugel Fundación y Fundación Åke Wiberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
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