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Methodenartikel

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

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DOI:

10.3791/52114

⸱

5. November 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

PAD4 ist ein Enzym, das für die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in Peptidyl-Citrullin verantwortlich ist. Eine Dysregulation von PAD4 wurde mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Es wird ein einfacher und hochdurchsatzkompatibler fluoreszenzbasierter PAD4-Assay beschrieben.

Zusammenfassung

Posttranslationale Modifikationen können zu veränderten Proteinfunktionszuständen führen, indem sie die kovalenten Variationen an den Seitenketten vieler Proteinsubstrate erhöhen. Die Histonschwänze stellen eine der am stärksten modifizierten Strecken innerhalb aller menschlichen Proteine dar. Es wurde gezeigt, dass Peptidyl-Arginin-Deiminase 4 (PAD4) Argininreste in den nicht genetisch kodierten Citrullinrest umwandelt. Nur wenige der bisher beschriebenen Assays waren operativ einfach und mit zufriedenstellender Sensitivität. Daher hat der Mangel an adäquaten Assays wahrscheinlich zum Fehlen wirksamer nicht-kovalenter PAD4-Inhibitoren beigetragen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger fluoreszenzbasierter Assay beschrieben, der die Überwachung der PAD4-Aktivität ermöglicht. Ein pro-fluoreszierendes Substratanalogon wurde entwickelt, um die enzymatische Aktivität von PAD4 mit der Fluoreszenzfreisetzung nach Zugabe der Protease Trypsin zu verknüpfen. Es konnte gezeigt werden, dass der Assay mit Hochdurchsatz-Screening-Bedingungen kompatibel ist und ein starkes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist. Darüber hinaus kann der Assay auch mit rohen Zelllysaten durchgeführt werden, die überexprimiertes PAD4 enthalten.

Einleitung

Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine ​​sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen 1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen 4 unterzogen. Histon-Proteine ​​sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) 5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung 8 beobachtet werden.

Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. 9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine ​​und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz 11 lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk 14 ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen 15,16.

Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose 17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis 18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs 19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein 22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel 17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest 26 zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen 27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken.

Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika 28 erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat 27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige 31 zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay 32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin 33 und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt 34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen 32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.

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Protokoll

1. PAD4 Transformation, Expression und Reinigung

  1. Für PAD4 Transformation, verwandeln den pGEX-Plasmid, das PAD4 GST-Fusions in chemisch kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) Zellen zur Proteinexpression unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Bereiten chemisch kompetente (Calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3) Zellen) nach Standardprotokollen.
    1. Tau 50 & mgr; l eines zuvor hergestellten chemisch kompetente BL21 (DE3) Zellen auf Eis und mit 1 & mgr; l der Plasmid pGEX enthält PAD4 Gens in einer 5 ml-Kulturröhrchen gemischt. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min unter leichtem Schütteln alle 2 min.
    2. Hitzeschock der Zellen, indem die Mischung in einem 42 ° C Wasserbad für 40 sec. Unmittelbar danach ist die Zell-Plasmid-Gemisch wieder auf Eis für 2 min, damit die Zellen sich zu erholen. 1 ml steriles LB-Medium zu der Mischung und auf Eis für 1 min.
    3. Inkubiere die Zellen einem Hitzeschock bei 37 ° C, unter Schütteln bei 250 rpm für 1hr. Je 75 ul der transformierten Zellen auf einer Ampicillin-resistenten Agarplatte und bei 37 ° C für 15 Stunden. Store Platte bei 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Wählen 1 Kolonie von BL21 (DE3) Zellen aus dem Ampicillin-Agar-Platte und in 5 ml LB aus 1x Ampicillin. Platz in Inkubator und schütteln O / N bei 37 ° C.
    2. Übertragen Sie die 5 ml LB (Starter) in 1 l sterilem LB aus 1x Ampicillintrihydrat (MW 403,45 g / mol). Ort Wachstum in einem 37 ° C Schüttelinkubator. Überwachen Sie die OD 600 des Wachstums. Wenn das Wachstum einer OD 600 von 0,3 erreicht, bewegen Wachstum in 16 ° C Schüttelinkubator.
    3. Bei Erreichen einer OD 600 von 0,6 induziert, die Zellen mit 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Sodass die Zellen 15 h bei 16 ° C geschüttelt.
    4. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 min bei 0 ° C. Überstand abgießen und speichern Pellet bei -80 ° C.
  3. PAD4 Reinigung
    1. Re-suspendieren des Pellets, welches das exprimierte PAD4 in BL21 (DE3) Zellen in einem Puffer von 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Folgende Beschallung, zentrifugieren Zelllysat bei 20000 × g für 20 min bei 0 ° C. Abgießen und den Überstand. Batch der Überstand mit Glutathion (GSH) Agaroseperlen für 30 min bei RT.
    3. Ablassen Stand von GST Perlen / Kolonne über die Schwerkraft. Mit 4 x 25 ml 1x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH = 8,0) bei RT Waschen Perlen.
    4. Eluieren PAD4 mit 2 x 10 ml Elutionspuffer, 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM Glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Konzentrieren PAD4 mit 100k MW cut-off Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 4.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Aliquot Protein in 200 ul Volumen in 1,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.

2. Vorbereiten Lizenzlösungen für Puffer

  1. Abwiegen Natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
  2. Abwiegen Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung, pH = 8,0. Mix-Lösung, bis sie klar.
  3. Abwiegen Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) und bereiten eine 500 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
  4. Abwiegen Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) und bereiten eine 200 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C.
  5. Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) und bereiten eine 1 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C.
  6. Vorbereiteneine 0,5% ige Lösung von Triton X-100.
  7. Abwiegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, MW 292,24 g / mol) und bereiten eine 100 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
  8. Abwiegen Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin Hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) und bereiten eine 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO).

3. PAD4 Assay bei 37 ° C

  1. Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein
  2. Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
  3. Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, und 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
  4. Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20° C. Dies wird Lösung D. sein
  5. Besorgen Sie sich eine 96-Well-Platte und Benennung einer Anzahl von Vertiefungen für die Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4).
  6. Pipette 160 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 160 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Inkubation für 15 min bei 37 ° C.
  7. Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 45 min.
  8. Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Auf die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen Pipette 10 ul Lösung D. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
  9. Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.

4. PAD4 Assay bei RT

  1. Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 50 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 50 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
  2. Bereiten Sie einen Puffer von 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
  3. Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
  4. Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung D. sein
  5. Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4).
  6. Je 25 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 25 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert.
  7. Je 25 ul der Lösung C in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT.
  8. Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Um die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen, pipettE 10 ul Lösung D. Inkubation bei RT für 10 min.
  9. Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.

5. PAD4 Zeitverlauf Assays bei 37 ° C und RT

  1. Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein
  2. Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
  3. Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen
  4. Wobei 2 Platten mit 96 Vertiefungen und einer Pipette 160 ul der Lösung B in # Menge von Vertiefungen (# Vertiefungen wird, wie viele Zeitpunkten abhängen).
  5. Inkubieren einer 96-Well-Platte bei 37 ° C. Inkubieren Sie die anderen 96-Well-Platte bei RT.
  6. Pipette 40 ul der Lösung A in alle Vertiefungen in beiden 96-Well-Platten und sofort Pipette 10 ul Lösung C in die t = 0 min Brunnen. Fügen Sie weitere 10 ul Lösung C zu bestimmten Zeitpunkten, bis alle Vertiefungen wurden abgeschreckt.
  7. Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.

6. PAD4 Inhibitionsassay bei RT

  1. Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 83 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 83 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
  2. Abwiegen Cl-Amidin (MW 424,8 g / mol) und bereiten eine 100 uM Stammlösung. Dies wird Lösung B sein
  3. Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
  4. Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thist wird Lösung D. sein
  5. Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung E. sein
  6. Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4), Testbohrungen (+ PAD4) und Hemmung Brunnen (PAD4 + Cl-Amidin).
  7. Je 25 ul der Lösung C in die Testbohrungen und Pipette 25 ul Lösung D in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert.
  8. Je 10 ul der Lösung B in Hemmung Vertiefungen pipettieren und für 20 min bei RTE.
  9. Pipette 15 ul Lösung A in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT.
  10. Je 10 ul Lösung E in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min.
  11. Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.

7. Rohzelllysat Assaybei RT

  1. Nach Ernten der Zellen aus PAD4 1 L Wachstum, Zellen in 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 20.000 × g für 20 min bei 0 ° C. Konzentrieren des klaren Überstandes auf das halbe Volumen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm bei 4 ° C unter Verwendung von 100K MW cut-off-Zentrifugenröhrchen.
  3. Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 250 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 250 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
  4. Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2 und 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
  5. Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen
  6. Besorgen Sie sich einen schwarzen 384-Well-Platte und Designaß Vertiefungen für Kontrollen (kein Zelllysat) und Aufschlussbohrungen (+ Zelllysat).
  7. Je 100 ul der Lösung B in alle Vertiefungen und Pipetten 60 ul Zelllysat in Testbohrungen. Inkubation für 20 min bei RT.
  8. Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei RT.
  9. Je 10 ul der Lösung C in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min.
  10. Besorgen Sie sich eine Fluoreszenz Lesen auf multimodale Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.

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Ergebnisse

Ursprünglich wurde gezeigt, dass ZRcoum kann auf die Aktivität des PAD4 in einer 96-Well-Plattenformat melden. Vertiefungen wurden mit dem Substrat ZRcoum und in der Gegenwart / Abwesenheit von PAD4 inkubiert. 475/15 nm-Filter (2A) - Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei 37 ° C wurde die Fluoreszenz mit einem 340/40 gemessen. Wie erwartet, werden die Fluoreszenzniveaus niedrig blieb als Fluorophor innerhalb ZRcoum (oder der citrullinated ZRc...

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Diskussion

In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein fluoreszenzbasierter Assay entwickelt, der die Aktivität von PAD4 überwacht. Der Assay hat sich unter einer Reihe von Hochdurchsatzbedingungen als unglaublich robust erwiesen und ist auch mit Ganzzelllysaten37 kompatibel.

Die Affinität zwischen den Histonproteinen und den sie umgebenden DNA-Strängen löst sich durch die Neutralisation der positiven Ladung an der Arginin-Seitenkette bei der Citrullinierung. Es wurde angenommen, dass die Neutralis...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Start-up-Paket der Lehigh University unterstützt. Wir danken Dr. Walter Fast für die Bereitstellung des GST-PAD4-Plasmids für die Proteinexpression.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGa href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicillin-Trihydrat (cremefarbenes Pulver), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG)Life Technogolies15529-019<a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com
Alle Puffersalze Fisher ScientificKann bei Fisher Scieintifc kaufen; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathion (GSH) agarose Machery-Nagel745500.10Store at 4 ° C; http://www.mn-net.com/
Chloramidin Kaiman-Chemie10599Bei -20 &° lagern; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell Platten (96 und 384)Bei Corning kaufen; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control Mikroplatten-Reader-Softwarewww.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com
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