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Methodenartikel

Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

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DOI:

10.3791/52119

⸱

14. Oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen der Maus können in vitro mit dem OP9-DL1 Co-Kultursystem zu T-Zellen differenziert werden. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert eine sorgfältige Beachtung der Reagenzien-/Zellpflege und der wichtigsten technikabhängigen Schritte. Hier diskutieren wir diese kritischen Parameter und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Einführung dieser Technologie zu fördern.

Zusammenfassung

Das OP9/OP9-DL1 Co-Kultursystem ist zu einer etablierten Methode geworden, um differenzierte Blutzelltypen aus embryonalen und hämatopoetischen Vorläuferzellen sowohl mausischen als auch menschlichen Ursprungs zu gewinnen. Es wird heute eingesetzt, um eine wachsende Vielfalt komplexer genetischer, zellulärer und molekularer Fragen im Zusammenhang mit der Hämatopoese zu beantworten, und steht an der Spitze der Bemühungen, diese grundlegenden Erkenntnisse in therapeutische Anwendungen zu überführen. Die Verfahren sind unkompliziert und führen routinemäßig zu robusten Ergebnissen. Um eine erfolgreiche hämatopoetische Differenzierung in vitro zu erreichen, ist jedoch ein besonderes Augenmerk auf die Details der Reagenzien- und Zellkulturpflege erforderlich. Darüber hinaus enthält das Protokoll technikabhängige Schritte, die zwar nicht schwierig sind, aber sorgfältig und übbar zu beherrschen sind. Hier konzentrieren wir uns auf die Verfahren zur Differenzierung von T-Lymphozyten aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESC). Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, in dem die kritischen Schritte und Parameter erläutert werden, die eine reproduzierbar robuste zelluläre Differenzierung in vitro ermöglichen. Es liegt im Interesse des Feldes, eine breitere Einführung dieser Technologie in Betracht zu ziehen, da sie das Potenzial hat, den Einsatz von Tieren zu reduzieren, die Kosten zu senken und die Zeiträume sowohl für grundlegende als auch für translationale Experimente zu verkürzen.

Einleitung

Es wurde ein Zellkultursystem eingerichtet, in dem embryonale Stammzellen (mESC) der Maus in vitro zu T-Zellen differenziert werden.1 Dieses System nutzt die Fähigkeit des Notch-Signalwegs, die T-Zell-Differenzierung voranzutreiben. 2 Die OP9-DL1-Zelllinie wurde durch Transduzieren von aus dem Knochenmark stammenden OP9-Zellen3 mit einem Notch-Liganden, Delta-like 1 (DL1), hergestellt. 4 Die Aktivierung der Notch-Signalkaskade in vitro erleichtert die Entwicklung von T-Zellen unter Ausschluss anderer Zelllinien. Unter Einbeziehung geeigneter Zytokine bietet dieses System eine "Mikroumgebung" der Zellkultur, die die sequentielle Weiterentwicklung von mESC in Richtung hämatopoetischer und letztendlich T-Zell-Linien unterstützt. Dieses System unterstützt die durchflusszytometrische Identifizierung von T-Zellen in den verschiedenen Entwicklungsstadien, die während der normalen T-Zell-Ontogenese im Thymus beobachtet werden. Für die Untersuchung ausgewählter Fragestellungen im Zusammenhang mit der T-Zell-Entwicklung hat sich dieses Verfahren zu einer attraktiven Alternative zu in vivo Ganzmausmodellen5 und in vitro fetalen Thymus-Organkulturmethoden entwickelt, die zur Hervorrufung der T-Zell-Entwicklung aus embryonalen Stammzell-Vorläufern der Maus verwendet werden. 6 Der Hauptvorteil des OP9-Co-Kultursystems besteht darin, dass es sich um standardisierte und unkomplizierte Zellkulturtechniken handelt und nicht auf den kontinuierlichen Einsatz von Versuchstieren angewiesen ist.

Wir folgen in unseren Experimenten mit diesem Ansatz einem detaillierten, zuvor veröffentlichten Protokoll. 7 Wir haben diese Technologie genutzt, um die hämatopoetischen Differenzierungsprodukte von nicht manipulierten mES-Klonen, hochwertigen mESC-Klonen, die handverlesen wurden, um chimäre Embryonenherzustellen 8, und stabil transfizierten ES-Klonen, die direkt aus der Wirkstoffauswahl stammen, zu untersuchen. 9 Wir haben festgestellt, dass die zeitliche Kinetik der anfänglichen in vitro Differenzierung von mESC zu mesodermähnlichen Kolonien in diesem Modell zwischen einzelnen Klonen variabel sein kann. Die mESC-OP9-Cokulturen können visuell auf das Fortschreiten zum Mesoderm untersucht werden. Während dies in der Regel bis zum fünften Tag der Co-Kultur abgeschlossen ist, kann sich die Fertigstellung bei einzelnen Klonen um ein oder zwei Tage verzögern. Vor dem Transfer muss eine quantitative (~80-90%) Mesodermbildung erreicht werden, um eine optimale Bildung hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPC) und eine robuste Lymphopoese zu erreichen. Wenn also mit mehreren mESC-Klonen gearbeitet wird, wird diese "Tag 5"-Passage am besten verzögert, bis alle Klone den Übergang zu mesodermähnlichen Kolonien abgeschlossen haben. Dies ermöglicht die Synchronität der nachfolgenden Entwicklung zwischen den Klonen nach ihrem Transfer in hämatopoetische Differenzierungsbedingungen. Drei Tage nach der Passage der 80-90% mesodermalen Formationen werden HPCs aus den OP9-Monolayern entnommen. HPCs können auf neuen OP9-Zellen ausgesät werden, um die Differenzierung von monozytären, erythroiden und B-Zelllinien zu ermöglichen. Alternativ können HPCs auf OP9-DL1-Zellen ausgesät und zur T-Zell-Entwicklung getrieben werden. Alle in vitro Differenzierungskulturen erhalten Flt-3L ab Tag 5, mit weiterer Zugabe von IL-7 ab Tag 8. Durchflusszytometrische Analysen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments durchgeführt werden, ermöglichen die Überwachung des Fortschritts in den Stadien und Linien der hämatopoetischen Differenzierung und der T-Zell-Entwicklung. CD4/CD8 doppeltpositive (DP) T-Zellen beginnen ab dem 16. Tag der Co-Kultur zu schlüpfen, und sowohl DP- als auch CD8-einfach-positive (SP) Zellen sind am 20. Tag reichlich vorhanden. Das allgemeine Ergebnis und die Robustheit der Co-Kultur hängen stark von der Fähigkeit ab, den Abschluss der signifikanten Entwicklungswendepunkte, die auftreten, visuell zu ermitteln. Dieses Protokoll soll ein Leitfaden für die Erkennung dieser Meilensteine sowie der anderen kritischen Parameter sein, die für eine erfolgreiche Differenzierung entscheidend sind.

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Protokoll

1. Herstellung von Kulturmedien, Zytokine und Gelatinierte Platten

  1. Bereiten ES-Zell-Medien mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Natrium Pyruvat. Fügen Sie 20% ESC qualifiziert Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% HEPES-Puffer, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Gentamicin (50 mg / ml) und 0,1% ( 55 uM) β-Mercaptoethanol. Sterilisieren ES-Zellmedium durch Filtration.
  2. Vorbereitung OP9 Medien, indem 1 l Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aus Pulver nach den Anweisungen des Herstellers. Mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kehren Sie zu mischen. Sterilisieren durch Filtration in zwei 500 ml-Aliquots.
    HINWEIS: Die Verwendung von Medien aus Pulver hergestellt wird empfohlen und wahrscheinlich verbessert OP9 Zelle Wartung und In-vitro-Differenzierung Ergebnisse. Dieser Ansatz hat sich zu unserem Standardverfahren. Beachten Sie jedoch, wir auch that wir manchmal verwendet vorgefertigten flüssigen α-MEM mit ausreichenden Erfolg.
  3. Vorbereitung Gefriermedien durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90% FBS. Vorsichtig schwenken und zu sterilisieren durch Filtration. Lagerung bei 4 ° C.
  4. Vorbereitung 2,000x Flt-3-Ligand (10 ug / ml) durch Lösen humanen rekombinanten Flt-3-Ligand (Flt-3L) in komplettem Medium OP9 bis 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen des Lieferanten Empfehlungen bezüglich Stabilität und Lagerung.
    HINWEIS: Die Stabilität von Flt-3L ist kurz (1 Monat bei 4 ° C oder 3 Monate bei -80 ° C).
  5. Vorbereitung 1,000x IL-7 (1 ug / ml) unter Verwendung von vollständigen OP9 Medien. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen Sie den Empfehlungen des Lieferanten, die auf Stabilität und Lagerung (IL-7 ist bei -80 ° C für bis zu 12 Monate haltbar).
  6. Vorbereitung 1,000x Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10 ug / ml) durch eine 1:10 Verdünnung von 10 7 Einheiten LIF in ES-Zell-Medien. Speicher Aliquots bei 4 ° C ist. Notieren Sie die vom Hersteller auf den aliquoten Fläschchen vorgesehen Ablaufdatum.
    HINWEIS: Das Produkt ist in konzentrierter oder verdünnter Form mindestens 18 Monate ab dem Datum der Herstellung stabil.
  7. Bereiten gelatinisierten 6-Well-Platten von 1,5 ml von 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Teller in den sterilen Abzug bei Raumtemperatur mit Deckel auf, so dass mindestens 30 min für die Beschichtung. Die Schalen können auch in einem befeuchteten Inkubator über Nacht stehen gelassen werden. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gelatinelösung direkt vor Zellaussaat. Lassen Sie sich nicht die Gelatinelösung vollständig trocknen im gut.

2. Vorbereitung und Wartung von Feeder-Zellen und embryonalen Stammzellen der Maus (MESC)

Hinweis: Alle Zellen inkubiert in einer befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2.

  1. Auftauen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)
    1. Quick-tauen eine gefrorene Fläschchen (~ 5 x 10 6 Zellen / Flasche) von Mitomycin C-behandelten (oder anderweitig mitotisch verhaftet) MEFs und sie auf einem 15-ml-Tube.
    2. 8 ml ES-Zell-Medien, um den aufgetauten Zellen in einem Dropdown-weise Mode allmählich verdünnen das DMSO aus dem Gefriermedium.
    3. Zentrifuge Zellen bei 400 x g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 3 ml ES-Zellmedium.
    4. Vorbereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 33 ml vorgewärmten ES-Zellmedium. Fügen Sie die 3 ml resuspendiertes MEFs, um das Endvolumen auf 36 ml zu bringen.
    5. Verteilen 3 ml der resuspendierten MEFs in jede Vertiefung zwei gelatinierte 6-Well-Platten. Legen Sie die Platten in den Brutschrank für mindestens sechs Stunden, um damit die Zellen anlagern und ausbreiten vor der Aussaat die mESCs auf sie. Diese mitotisch verhaftet Feeder-Schichten kann für mehrere Tage nach der ersten Aussaat verwendbar sein, wenn ihre Medien wird alle 2-3 Tage gewechselt.
      HINWEIS: Frisch verhaftet MEFs können ebenfalls verwendet werden.
    6. Seeding mESCs
      1. Quick-tauen ein Fläschchen mit einem gefrorenen MESC Klon in der 37 ° C-Wasserbad und bereiten Zellen, wie in 2.1.1-2.1.3 beschrieben.
        HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von MESC aus einer konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte.
      2. Entfernen Sie das Medium aus einer gut (pro MESC Klon) der 6-Well-Platte mit MEF verhaftet Monoschichten (in Schritt 2.1.5 vorbereitet) und Samen der 3 ml mESCs auf dem MEF-Monoschicht. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF (10 ng / ml). Zurück Gerichte in den Brutschrank.
    7. ES-Zell-Wartung und Trypsin-vermittelte Durchgang
      HINWEIS: Medienwechsel täglich, oder Split basierend auf Zusammenfluss von MESC. Optimal, Ernte und Split / re-Platte die Zellen jeden zweiten Tag.
      1. ES-Zell-Medien entfernen und waschen mESCs mit 2 ml PBS. PBS zu entfernen. 1 ml 0,25% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 3-5 min.
      2. Sammeln trypsiniert Zellen und übertragen sie in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Kräftig pipettieren die Zellsuspension zu brechen Klumpen von mWSR. 2 ml des vollständigen ES-Zellmedium zu der Zellsuspension, um das Trypsin zu neutralisieren.
      3. Spin-Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 3 ml ES-Zellmedium.
      4. Entfernen Sie das Medium aus 6-Well-Platten, die bereit verhaftet MEF-Monoschichten. Die geeignete Menge der Zellsuspension (basierend auf dem gewünschten Aufteilungsverhältnis) in 3 ml ES-Zellmedium in jede Vertiefung ausgesät zu werden. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF. Eine konfluente MESC gut aufgeteilt 1: 6 bereit für den Durchgang in 2 Tagen sein.
    8. OP9 / OP9-DL1 Zelle Instandhaltung
      1. Tauwetter ein Fläschchen OP9 Zellen (befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 mit OP9 Medien)
      2. 7 ml OP9 Medien bis 10 cm Gewebekulturschale. Fügen Sie die 3 ml resuspendierten Zellen in einem Dropdown-weise Weise, Verteilung Zellen im ganzen Platte. Legen Sie die Zellen über Nacht im Brutschrank.
      3. Prüfen Sie am nächsten Tag den Zusammenfluss der OP9 Zellen. Wenn das Gericht viele tote Zellen enthält schwimm Remove die Medien und die 10 ml frischem OP9 Medien. Gibt die Schale in den Inkubator, wenn fast voll Fluss nicht beachtet wird. Split (unter Verwendung von Trypsin) 1: 4 in der Nähe der konfluenten Monolayer OP9.
        HINWEIS: Die Platten sollten gleiche Ebene Zusammenfluss wieder in ca. 2 Tagen zu erreichen. Achten Sie darauf, OP9 Zellen über-konfluent werden zu lassen.
      4. Einfrieren der frühen Passagen der OP9 Zellen als Erweiterung Aktien.
        HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von OP9 Zellen von einem in der Nähe von konfluenten 10 cm Schüssel. Jedes Fläschchen der Expansion Lager weiter propagiert werden, um Arbeitsvorräte, die später in MESC Co-Kultur-Experimente verwendet werden zu erstellen. Bewahren Sie alle OP9 Bestände in flüssigem Stickstoff eingefroren und nicht in der -80 ° C-Gefrierschrank, da Temperaturschwankungen können sich negativ auf die Qualität der friert.

    3. OP9-DL1 Co-Kultur-Verfahren

    1. Co-Kultur-Zubereitungen
      1. Etwa eine Woche vor dem Beginn der Ko-Kultur, auftauen MEFs, mESCs und OP9 Zelle arbeiten stocks. Seit OP9-DL1 Zellen nicht bis Co-Kultur-Tag 8 erforderlich ist, tauen die OP9-DL1 Zellen während der ersten drei Tage nach der Co-Kultur-Initiation. Erhalten oder zu frieren alle Zellen, wie gebraucht.
      2. Bestimmen die Anfangszahl von 10 cm-Platten mit OP9 Zellmonoschichten zu 80% Konfluenz auf Co-Kultur Tag 0, basierend auf dem Ausmaß des Experiments zu erreichen (zB Anzahl der MESC Klone unterschieden werden und die Anzahl der Co-Kultur-Zeitpunkte analysiert werden). Um nach einer Co-Kultur vorzubereiten, teilen nahezu konfluenten Gericht OP9 Zellen zwischen 1: 4 und 1: 6 zwei Tage vor, wenn die Monoschichten benötigt werden.
        HINWEIS: Man wird zumindest eine Platte pro ESC-Klon müssen. Typischerweise ausgesät eine einzige ESC-Klon auf einer einzigen Platte am Tag 0 (wie unten beschrieben) sollte genügend Zellen liefern zu sechs Platten am Tag 5 Gang Samen. Jeder Tag 5 Platte ermöglicht eine anschließende Analyse Zeitpunkt.
      3. Seit OP9 Monoschichten kontinuierlich für die Co-Kulturpassage erforderlich sein, achten Sie darauf, immer maintain einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen OP9 Kulturplatten parallel mit der Co-Kultur.
    2. Tag 0: Einleitung der Co-Kultur
      1. Sammeln MESC wie in 2.3.1-2.3.4. Zählen Sie die Zellen.
      2. Für jeden Klon MESC vorbereiten 5 x 10 4 MESC in 10 ml OP9 Medien pro Platte.
        Hinweis: Obwohl wir es nicht verwendet wird, stellen wir fest, dass ein alternatives Medium, das aus α-MEM, 10% FBS und 5 × 10 -5 M β-Mercaptoethanol wurde auch zur Verwendung bei der Differenzierung Co-Kulturen 10 gemeldet.
      3. Entfernen Sie alte Medien aus OP9 Gerichte und fügen Sie die 10 ml MESC Suspension auf die Gerichte kümmern, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Die Schalen werden in der 37 ° C-Inkubator.
    3. Tag 3: Medienwechsel
      1. Gerichte zu entfernen aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Kolonien sollten anfangen, Glanz verlieren und erscheinen abgeflacht.
      2. Entfernen Sie das Medium aus Speisen und schonend 10 ml frischem OP9Medien.
      3. Bringen Sie die Co-Kulturschalen in den Inkubator. Mesoderm-wie Koloniebildung täglich visuell zu überwachen, um den Zeitpunkt der Zuführung OP9 Mono Vorbereitung für den nächsten Durchgang (Tag 5), die nicht bis ~ 80-90% der Kolonien visuell Mesoderm-ähnliche Morphologie Anzeige durchgeführt werden sollte informieren. Maximale Verschiebung des Tag 5 Zelltransfer Schritt 2 Tage.
    4. Tag 5: Trypsin-vermittelte Durchgang mit Pre-Beschichtung.
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 10 cm-Schalen mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen. Fahren Sie mit den nächsten Schritten nur, wenn die Co-Kulturen visuell die in Schritt 3.3.3 beschriebenen Funktionen anzuzeigen (siehe auch Repräsentative Ergebnisse).
      1. Entfernen Sie das Medium aus den Co-Kulturschalen. 4 ml PBS zu waschen. Schwenken Sie die PBS und entfernen. 4 ml 0,25% Trypsin und die Schalen in Inkubator für ~ 5 min.
      2. Stören die Schicht von Zellen durch Trypsin heftiges Pipettieren, dabei nicht zu hohe Luftblasen einzuführen, bis einehomogenen, überwiegend Einzelzellsuspension erreicht.
      3. 4 ml komplette OP9 Medien und mischen durch Pipettieren. Transferzellen in eine neue, leere Schüssel 10 cm und in den Brutschrank für 30 Minuten, damit sich die Zellen zu OP9 an der Schale haften. Diese "Pre-plating" Schritt reduziert die Anzahl von Zellen OP9 zum nächsten Schritt der Co-Kultur überführt.
      4. Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Zellsiebe.
      5. Sammeln nicht-adhärenten Zellen von der vorgalvanisierten Gericht und leiten sie durch die Zelle Sieb in die Röhre. Vorsichtig waschen die Schale mit 6 ml PBS und geben es durch den gleichen Filter, so dass die Zellen angebracht OP9 hinter sich.
      6. Zentrifuge Zellen bei 400 x g 5 Minuten bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml vollständigem OP9 Medien. Zählen Sie die Zellen.
      7. Entfernen Sie die Medien aus 10 cm-Platten mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen.
      8. Für jedes Analysezeitpunkt, Samen 5 x 10 5 Zellen auf dem OP9 monoSchicht in 10 ml Endvolumen.
      9. Mit 5 ng / ml humanes rekombinantes Flt-3L und die Schalen in Inkubator.
    5. Tag 8: hämatopoetischen Vorläuferzelle (HPC) Sammlung
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellmonoschichten, so dass sie in der ~ 80% konfluent in der Zeit für diesen Schritt.
      1. Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe.
      2. Entfernen Sie die Gerichte aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Shiny Cluster HPC sollte locker an die OP9 Monolage befestigt werden. Sammeln, wie viele dieser Zellen wie möglich durch Waschen (aber nicht übermäßig zu stören) die OP9 Monoschicht mit einer Pipette und die vorhandenen Medien auf dem Teller. Um Schaumbildung zu verhindern, zumindest 1 ml des Mediums in der Spitze der Pipette in dieser Sammlung HPC / Waschschritt immer verlassen.
      3. Führen Sie die Zellen durch die 40 um Sieb in einem Rohr. 8 ml PBS auf die gleiche Platte und überprüfen unter dem Mikroskop, wenn alle HPC wirwieder gesammelt. Wiederholen des Wasch / Sammelschritt mit PBS und (falls erforderlich) mit kräftiger Waschen. Belastung der Zellen in das Rohr bereits die Zellen von der gleichen Platte enthält.
      4. Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist.
      5. Bereiten Sie ein Master-Mix von 3 ml (pro Platte ausgesät am Tag 5) des OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
      6. Überstand entfernen und Pellet in OP9 Medien mit Flt-3L + IL-7-Master-Mix (3 ml pro 10 cm Schale verarbeitet). Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit OP9 Zellen.
        1. Um Zellen zu Monozyten-, B-Zell-Linien fahren oder Erythrozyten-, Saatgut die gesammelten Zellen auf OP9 Zellen. T-Zellen stammen, Saatgut der Zellen auf OP9-DL1 Zellmonoschichten.
      7. Legen Sie die 6-Well-Platten in Inkubator.
    6. Tag 10: Medienwechsel
      1. Bereiten Sie eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen für jede einzelne MESC Klon-Feeder-Zelltyp Combination in Co-Kultur.
      2. Bereiten Sie eine Mischung aus Master OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. Bereiten Sie 3 ml für jeden gut.
      3. Sanft sammeln Medien aus jedem Well der 6-Well-Platte kombiniert Medien von mehreren Brunnen die gleiche ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
      4. 2 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) in jedes Well.
      5. Zentrifuge die gesammelten Medien bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und jedes Pellet resuspendieren (sehr klein, wenn sichtbar) in 1 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) pro Vertiefung ursprünglich in Schritt 3.6.3 gesammelt.
      6. Verteilen Sie 1 ml der Zellen wieder in jede Vertiefung, von dem die Medien ursprünglich erhoben bringt die Lautstärke in jedem gut 3 ml. Bringen Sie die Gerichte in den Inkubator.
    7. Tag 12: Kein Durchgang Trypsin
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellen, so dass sie optimal in der Zeit konfluent für dieses s werdenTEP. Tag 12 ist ideal für die Durchflusszytometrie Analysen der Entwicklung von Erythrozyten-, Monozyten-und T-Zellen frühzeitig.
      1. Bereiten Sie ein Master-Mix (3 ml für jede Vertiefung, die in Co-Kultur fortsetzen wird) von OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
      2. Vorbereitung 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe (eine für jeden Klon ESC-Feeder-Zelltyp in Kombination Co-Kultur).
      3. Kräftig pipettieren die vorhandenen Medien in jede Vertiefung, um alle Zellen (einschließlich der Monoschicht) in der gut zu zerlegen. Fahren Sie mit kraftvollen Pipettieren bis ein Zustand ähnlich einer Einzelzellsuspension erreicht.
      4. Die gesammelten Zellen passieren durch das Sieb in das Rohr. 3 ml PBS in jedes Well zu waschen und zu sammeln alle übrigen Zellen. Pass-Zellen durch die gleiche Sieb. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus dem gleichen Brunnen ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
      5. Entsorgen Sie die Zelle Sieb und entfernen einen aliquoten entspricht einem gut (~ 6 ml) für jede gewünschteDurchflusszytometrie (oder andere) analysiert, um aus an diesem Tag durchgeführt werden. Bewahren Sie diese Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch.
      6. Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen. Das Pellet aus den 50 ml-Zentrifugenröhrchen in 3 ml pro Vertiefung Master-Mix neu ausgesät werden. 3 ml pro Vertiefung jeder Zellsuspension auf die entsprechende Feeder-Zelltyp und die Schalen in den Brutschrank.
    8. Tag 14: Medienwechsel
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
    9. Tag 16: Kein Durchgang Trypsin
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus 6-Well-Schalen optimal zusammenfließenden OP9 oder OP9-DL1 Zellen für diesen Schritt.
      HINWEIS: Tag 16 ist ideal für die Durchflusszytometrie-Analysen der B-Lymphozyten und T-Zellen mittlere Stufe.
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert.
    10. Tag 18: Medienwechsel
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
    11. Tag 20: Kein Durchgang Trypsin
      HINWEIS: Tag 20 is ideal für die Durchflusszytometrie analysiert der Mitte bis späten Stadium der Entwicklung T-Zellen.
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert. Falls gewünscht, tragen differenzierenden Zellen vergangenen Tag 20 Wechselmedienwechsel und kein Trypsin Gänge alle zwei Tage, mit täglichen Überwachung der Lymphozyten-Expansionsrate.

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Ergebnisse

Wenn auf MEFs in Gegenwart von LIF wachsen kann mESCs in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden. Unter idealen Bedingungen als kompakte Kolonien von Zellen durch ein leuchtender Ring im Phasenkontrast-Mikroskopie umgeben (Abbildung 1) erscheinen sie. Diese Kulturen muss täglich überwacht werden. Je nach dem Zusammenfluss der Zellen, können Medien verändert oder Zellen können geteilt werden. Benachbarte MESC Kolonien nicht bis zur Berührung miteinander kommen. Eine normale, gesunde Kultu...

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Diskussion

Die OP9-DL1 Co-Kultursystem wurde verwendet, um die Rolle der verschiedenen Genprodukte bei der Entwicklung von Blutzelltypen aus Stammzellen zu untersuchen. 8,12,13 Es wurde auch ein effektives Modell, um die Funktion des Gens regulatorischen DNA zu untersuchen erwiesen während der zellulären Differenzierung. 9,14 Mit diesem Ansatz als Alternative zum gesamten Mausmodelle können erhebliche Einsparungen an Zeit und Kosten für die Experimente, die viele grundlegende Fragen der Hämatopoese-Adresse zu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Joon Kim für die fachkundige Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Die Forschung in den Labors der Autoren wird durch das SCORE-Programm der National Institutes of Health (Stipendium SC1-GM095402 an B.D.O) und der Canadian Institutes of Health Research (an J.C.Z.P.) unterstützt. J.C.Z.P. wird von einem kanadischen Forschungslehrstuhl für Entwicklungsimmunologie unterstützt. Die biomedizinische Forschungsinfrastruktur des Hunter College wird teilweise durch das Programm NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) über Zuschüsse MD007599 unterstützt. Wir danken auch dem New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) für seine Unterstützung der Initiierung der Stammzellforschung am Hunter College durch Zuschüsse C023048.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMCorning15-013-CV
Stammzell-qualifiziert FBSGemini100-125Hitzeinaktiviertes
Penicillin/StreptomycinCorning30-002-CI
L-Alanyl L-GlutaminCorning25-015-CI
HEPES PufferMilliporeTMS-003-C
Nicht-essentielle AminosäurenThermoScientificSH30853.01
Gentamicin Regent Lösung (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-Mercaptoethanol (55 mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
FiltereinheitMilliporeSCGPU05RE0,22 μ m PES-Membran
Wasser in ZellkulturqualitätCorning25-055-CM&
alpha;-MEM Life Technologies 12000-022Pulver, rekonstituiert gemäß Herstellerempfehlung
Natriumbicarbonat SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Prüfung einzelner Chargen erforderlich 
Dimethylsulfoxid SigmaD2650
Rekombinanter humaner Flt-3-LigandR& D Systems308-FK
Rekombinante Maus IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
Utrapure-Wasser mit 0,1 % GelatineMilliporeES-006-B
MEFs Mitomycin C behandeltMilliporePMEF-CFAlle mitotisch arretierten MEFs können verwendet werden
DPBSCorning21-031-CV
Zellsieb (40 μ m)Fisher22363547
Gewebekulturschale 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon 353046
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500
15 ml ZentrifugenröhrchenBD Falcon352096
50 ml ZentrifugenröhrchenBD Falcon352070
5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeBD Falcon352235Röhrchen für FACS 
ES R1-ZellenATCCSCRC-1011
OP9-ZellenZellen können aus dem Riken Laboratory Cell Repository (Japan) bezogen werden.
OP9-DL1 Zellen       Zellen können bei der Zú ñ iga-Pflü CKER-Laboratorium.
FlowJo Software Tree StarFACS Datenanalysen
DurchflusszytometerBDFACScan, FACSCalibur und FACSVantage eingesetzt
In unserem Labor wurden

Referenzen

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

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