Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

Martina Kučerová-Levisohn; Jordana Lovett; Armin Lahiji; Roxanne Holmes; Juan Carlos Zúñiga-Pflücker; Benjamin D. Ortiz

doi:10.3791/52119

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Methodenartikel

Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

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DOI:

10.3791/52119

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14. Oktober 2014

Martina Kučerová-Levisohn¹ , Jordana Lovett¹ , Armin Lahiji¹ , Roxanne Holmes² , Juan Carlos Zúñiga-Pflücker² , Benjamin D. Ortiz¹

¹Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, ²Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen der Maus können in vitro mit dem OP9-DL1 Co-Kultursystem zu T-Zellen differenziert werden. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert eine sorgfältige Beachtung der Reagenzien-/Zellpflege und der wichtigsten technikabhängigen Schritte. Hier diskutieren wir diese kritischen Parameter und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Einführung dieser Technologie zu fördern.

Zusammenfassung

Das OP9/OP9-DL1 Co-Kultursystem ist zu einer etablierten Methode geworden, um differenzierte Blutzelltypen aus embryonalen und hämatopoetischen Vorläuferzellen sowohl mausischen als auch menschlichen Ursprungs zu gewinnen. Es wird heute eingesetzt, um eine wachsende Vielfalt komplexer genetischer, zellulärer und molekularer Fragen im Zusammenhang mit der Hämatopoese zu beantworten, und steht an der Spitze der Bemühungen, diese grundlegenden Erkenntnisse in therapeutische Anwendungen zu überführen. Die Verfahren sind unkompliziert und führen routinemäßig zu robusten Ergebnissen. Um eine erfolgreiche hämatopoetische Differenzierung in vitro zu erreichen, ist jedoch ein besonderes Augenmerk auf die Details der Reagenzien- und Zellkulturpflege erforderlich. Darüber hinaus enthält das Protokoll technikabhängige Schritte, die zwar nicht schwierig sind, aber sorgfältig und übbar zu beherrschen sind. Hier konzentrieren wir uns auf die Verfahren zur Differenzierung von T-Lymphozyten aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESC). Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, in dem die kritischen Schritte und Parameter erläutert werden, die eine reproduzierbar robuste zelluläre Differenzierung in vitro ermöglichen. Es liegt im Interesse des Feldes, eine breitere Einführung dieser Technologie in Betracht zu ziehen, da sie das Potenzial hat, den Einsatz von Tieren zu reduzieren, die Kosten zu senken und die Zeiträume sowohl für grundlegende als auch für translationale Experimente zu verkürzen.

Einleitung

Es wurde ein Zellkultursystem eingerichtet, in dem embryonale Stammzellen (mESC) der Maus in vitro zu T-Zellen differenziert werden.¹ Dieses System nutzt die Fähigkeit des Notch-Signalwegs, die T-Zell-Differenzierung voranzutreiben. ² Die OP9-DL1-Zelllinie wurde durch Transduzieren von aus dem Knochenmark stammenden OP9-Zellen³ mit einem Notch-Liganden, Delta-like 1 (DL1), hergestellt. ⁴ Die Aktivierung der Notch-Signalkaskade in vitro erleichtert die Entwicklung von T-Zellen unter Ausschluss anderer Zelllinien. Unter Einbeziehung geeigneter Zytokine bietet dieses System eine "Mikroumgebung" der Zellkultur,....