In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

Zusammenfassung

Zwei auf Durchflusszytometrie basierende Methoden – ein in vitro T-Zell-Priming-Assay und intrazelluläre Zytokinfärbung – wurden verwendet, um die Antigenpräsentationskapazität von dendritischen Zellen und antigenspezifische T-Zell-Antworten auf eine West-Nil-Virus-mutierte Infektion bei Mäusen zu messen.

Zusammenfassung

Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren - eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) - wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 ⁺ T-Zellen von OTII transgenen Mäusen - im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 ⁺ T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.

Einleitung

West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch ¹ zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm ² induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für ei....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Animal Care und Verwenden Committee an der Universität Texas der medizinischen Niederlassung zugelassen.

1. Isolierung von DCs, die aus Nicht-Infizierte und WNV-infizierten Mäuse

1. Alters- und geschlechts Spiel 6-10 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6 (B6) und MyD88 ^{- / -} Mäusen. Inokulieren intraperitoneal (ip) mit 500 plaquebildenden Einheit (PFU) von WNV NS4B- P38G Mutante. Am Tag 3 nach der Infektion einschläfern B6 und MyD88 ^{- / -} Mäuse mit CO _2. Verwendung von nicht-infizierten Mäusen beider Gruppen als Kontrollen. Verwenden Sie drei Mäuse aus jeder Gruppe.
2. Nasses Fell auf d....

Ergebnisse

In der T-Zell-Priming-Assay wurden CFSE markierten CD4 ⁺ T-Zellen mit gereinigtem DCs aus der NS4B-P38G Mutante infizierten Wildtyp-MyD88 und kultiviert ^{- / -} Mäusen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptide. Markierten T-Zellen alleine mit oder ohne OVA kultiviert für 5 Tage wurden als negative Kontrollen verwendet. Wie in 1A gezeigt ist, wurden die gesamten T-Zellen für die Analyse der Fluoreszenzintensität von der FL1-Kanal torge. Die Markierung wurde auf der Grundlage.......

Diskussion

WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion ⁵ untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisierung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI 1640	Invitrogen	11875	warmes Aufwärmen bei 37 > C
Anti-CD11c Magnetkügelchen	Miltenyi Biotec	130-052-001	folgen Sie dem Hersteller'
Anti-CD4-Magnetkügelchen	Miltenyi Biotec	130-095-248	folgen Sie dem Hersteller' Anweisungen
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA-Rückstand 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptide	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A-Lösung	BD Bioscience	555029
Maus Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-konjugiertes CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-konjugiertes CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Fixierungs-/Permeabilisierungslösung	BD-Bioscience	554722
Permeabilisierungs-/Waschpuffer	BD-Bioscience	554723
Anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri Durchflusszytometer	BD Bioscience