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Methodenartikel

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

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DOI:

10.3791/52121

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27. November 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Immunology, The University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, The University of Texas Medical Branch, 3Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Sealy Center for Vaccine Development, The University of Texas Medical Branch

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zwei auf Durchflusszytometrie basierende Methoden – ein in vitro T-Zell-Priming-Assay und intrazelluläre Zytokinfärbung – wurden verwendet, um die Antigenpräsentationskapazität von dendritischen Zellen und antigenspezifische T-Zell-Antworten auf eine West-Nil-Virus-mutierte Infektion bei Mäusen zu messen.

Zusammenfassung

Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren - eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) - wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 + T-Zellen von OTII transgenen Mäusen - im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.

Einleitung

West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch 1 zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm 2 induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für einen optimalen Impfstoffkandidaten. Die Mechanismen, mit denen die NS4B-P38G Mutante induziert hohe Schutz adaptiven Immunität noch nicht genau geklärt. Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular patterns erkennen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der angeborenen Immunität zu Virusinfektion. Der Kern TLR-Signalweges nutzt myeloische Differenzierung primäre Antwort gene 88 (MyD88) als primärer Adapter 3,4. In einer neueren Studie wurde MyD88 Signalisierungs gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von zellvermittelter Immunität während WNV NS4B- P38G Mutante Infektion bei Mäusen 5 zu spielen. Dendritische Zellen (DCs) sind eines der wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen die einzigartige Fähigkeit, primären T-Zell-Reaktionen während der viralen Infektion zu initiieren 6,7 aufweist. CD4 + und CD8 + T-Zellen sowohl für langanhaltende schützende Immunität bei und sind wichtig für die Host-Überlebensrate nach Wildtyp WNV Infektion 8,9. Zwei immunologischen Assays wurden in dieser Studie verwendet, um die Funktionen dieser Zellen in der NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen zu beurteilen.

Zunächst wurde ein in vitro-T-Zell-Priming-Assay verwendet, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der DCs von WNV-infizierten Wildtyp-MyD88 und Vergleichen - / - Mäusen. Um die Empfindlichkeit des Assays, naive CD4 + T-Zellen wurden aus OTII transgenen Mäusen, die eine Vα2 / Vβ5 TCR spezifisch für das Hühner-Ovalbumin (OVA) Peptid exprimieren 323 isoliert - 339. DCs von WNV infizierten Mäusen wurden aufgereinigt und co-kultiviert mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ostern (CFSE ) -markierten CD4 + T-Zellen in Gegenwart von OVA-Peptid. Nach 5 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Proliferationsassays wurden traditionell durch Einbau von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) oder tritiiertem Thymin desoxyribosid (3 HTdR) 10 durchgeführt. Dennoch sind diese Assays entweder radioaktive und / oder benötigen spezielle Ausrüstungen der Sicherheitsstufe (BL) 3 Anlagen, wo WNV Studien durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten-Proliferation durch serielle Halbierung der Fluoreszenzintensität des Vitalfarbstoffs CFSE geworden üblicherweise in immunologischen Assays verwendet werden, wie der Farbstoff stabilerund gleichmäßig in Zellen eingebaut, leicht durch Flusszytometrie nachgewiesen und ist nicht-radioaktiven 11. Der Test hat auch die Fähigkeit, die Anzahl der Zellteilungen zu beurteilen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser Assays in WNV Studien ist, dass die Fixierung der infizierten Zellen mit 1-2% PFA könnte WNV 12, die Probennahme mit einem Durchflußzytometer in einen BL2 Labor ermöglichen inaktivieren.

Als nächstes wurde ein modifiziertes intrazellulärem Zytokinfärbung (ICS) Verfahren verwendet, um die Rolle von MyD88 Signalisierung in der Regulation der WNV spezifische T-Zellantworten in NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen untersucht. In diesem Test wurden Splenozyten aus infizierten Mäusen isoliert in vitro mit WNV spezifischen Peptiden behandelt. Brefeldin A wurde zugegeben, um die Cytokine in der Zelle zurückzuhalten. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, gewaschen und für die T-Zell-Subpopulationen gefärbt. Die Zellen wurden dann in PFA fixiert, permeabilisiert und für Interferon (IFN) -γ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Wie bei anderen auf Basis der Durchflusszytometrie-Assay, nachdem die Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Puffer mit PFA behandelten, infizierten Proben können auf eine BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung und Analyse übertragen. In mehreren veröffentlichten Studien haben wir ICS verwendet, um T-Zell-Effektorfunktionen in WNV-infizierten Mäusen 13,14 messen. Obwohl es gut etabliert ist, ist einen großen Nachteil dieses Tests, dass das Verfahren ist sehr langwierig und könnte mehr Zeit in Anspruch, wenn sie innerhalb BL3 Einrichtungen durchgeführt werden. Hier wurde ein Mikrozentrifugenröhrchen Basis ICS Verfahren gezeigt, dass mehr möglich ist, leichter zu gehen und weniger zeitaufwendig, wenn sie innerhalb einer BL3 Labor.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Animal Care und Verwenden Committee an der Universität Texas der medizinischen Niederlassung zugelassen.

1. Isolierung von DCs, die aus Nicht-Infizierte und WNV-infizierten Mäuse

  1. Alters- und geschlechts Spiel 6-10 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6 (B6) und MyD88 - / - Mäusen. Inokulieren intraperitoneal (ip) mit 500 plaquebildenden Einheit (PFU) von WNV NS4B- P38G Mutante. Am Tag 3 nach der Infektion einschläfern B6 und MyD88 - / - Mäuse mit CO 2. Verwendung von nicht-infizierten Mäusen beider Gruppen als Kontrollen. Verwenden Sie drei Mäuse aus jeder Gruppe.
  2. Nasses Fell auf der linken Seite geopfert Maus mit 70% Ethanol und das Fell weggeschnitten an der linken Seite der Maus, etwa auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine. Schneiden Sie die Körperhöhle. Entfernen Sie die Milz mit Hilfe der Pinzette. Legen Sie die Milz in einer Petrischale mit RPMI.
  3. Isolieren Milz DCs durch die Verwendung anti-CD11c magnetische Kügelchen nachAnweisungen des Herstellers.

2. Reinigung und Kennzeichnung von T-Zellen von OTII transgenen Mäusen

  1. Ernte eine Milz aus einer naiven OTII Maus, wie in Schritt 1.2 oben beschrieben und Homogenisierung der Milz zwischen den mattierten Enden von zwei Folien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, fügen RPMI-Medium bis zu 14 ml. Lassen die Suspension 5 min stehen und übertragen 13 ml in ein neues 15 ml konischen Röhrchen.
  2. Isolieren Milz CD4 + T-Zellen unter Verwendung eines CD4 + T-Zell-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers.
  3. Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen zweimal mit PBS waschen. Zellen in PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 x 10 6 Zellen pro ml und mit 0,5 & mgr; mol / ml CFSE. Bei 37 ° C für 10 min, vor Licht geschützt.
  4. 5 ml kalter Vollmedium (RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1/100 VolAntibiotika / Antimykotika, 1/100 Vol L-Glutamin und 1 / 1.000 Vol 1000 · 2-Mercaptoethanol).
  5. Inkubieren auf Eis für 5 min. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fix 0,2 x 10 6 beschriftet CD4 + T-Zellen in 2% PFA und erwerben mit einem Durchflusszytometer. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Grundniveau der CFSE bestimmen. Resuspendieren den Rest der markierten Zellen in Vollmedium.

3. Co-Kultur OTII T-Zellen mit DCs von WNV-infizierten Mäuse

  1. Kultur 2 x 10 5 gereinigten CD4 + T-Zellen von Mäusen OTII allein oder mit gereinigtem DCs von Wildtyp- oder MyD88 - / - Mäusen (2 x 10 4) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit oder ohne OVA 323-339 Rückstand (1 g / ml) in 1 ml Vollmedium pro Vertiefung.
  2. Zellen bei 37 ° C für 5 Tage. Ernten Sie die Zellen, waschen zweimal in FACS-Puffer (PBS mit 1% FBS) und befestigen Sie in 0,25 ml 2% PFA. Vortex sofort.

4. Durchflusszytometrie Analyse der In-vitro-</ Em> T-Zell-Priming

  1. Zur Erfassung, doppelklicken Sie auf die Durchflusszytometrie Software-Symbol. Bei einer Dichte von linearen Plot FSC-A vs. lineare SSC-A, wählen Sie die Kanäle 0 bis 200.000 auf FSC-A und 0 bis 200.000 auf SSC-A. Erstellen Sie dann ein Tor an lebenden Zellen (P2, siehe 1A).
  2. Um die Fluoreszenzintensität von CFSE analysieren, öffnen Sie das Histogramm für die FL1-Kanal und erhalten 20.000 Events auf der gated Bevölkerung. Eine Markierung auf Samples für OTII Zellen alleine kultiviert (1A).
  3. Erwerben Sie Proben für OTII Zellen co-kultiviert mit Wildtyp-DC (1B) oder MyD88 - / - DCs (1C) in ähnlicher Weise.

5. Isolierung und Stimulation von Splenozyten für Zytokin-Assays

  1. Infect B6 und MyD88 - / - Mäuse mit WNV NS4B-P38G Mutante mit dem gleichen Verfahren wie in ste beschriebenp 1,1. Am Tag 30 nach der Infektion erneut Herausforderung überlebenden Mäuse mit 2000 PFU des Wildtyp-Stamms WNV ip An den Tagen 8 und 21 nach der primären WNV-Infektion oder am Tag 4 nach Sekundärinfektion, einschläfern Mäuse mit CO 2 für die Sammlung von Milz .
    HINWEIS: Es wird verwendet, 2-3 Mäuse pro Gruppe für jeden Zeitpunkt.
  2. Einen Einzelzellsuspension von Milzzellen wie oben in Schritt 1.2 & Schritt 2.2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer und resuspendieren sie in 10 ml Vollmedium.
  3. Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. 1 ml der Splenozyten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Um CD8 + -T-Zellen zu simulieren, verdünnter WNV spezifischen NS4B und E Peptide (SSVWNATTA und IALTFLAV) auf 1 mg / ml in DMSO. Zur Stimulation von CD4 + T-Zellen, verdünnter WNV spezifischen NS3 und E Peptide (RRWCFDGPRTNTILE und PVGRLVTVNPFVSVA) auf 1 mg / ml in DMSO. Zugabe von 10 ul der Peptide an die Zellen followed von 1 ul Brefeldin A-Lösung. Verwenden Zellen ohne Peptide Behandlung als Kontrolle. Mischen Sie die Zellen.
  5. Stanzen zwei Löcher mit einem 18 G-Nadel in die Kappe der Röhre. Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden.

6. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung

  1. Übertragungszellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. 1 ml FACS-Puffer, Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen durch Pipettieren mit 120 ul FACS-Puffer.
  2. Add 2 ul Fc-Blocker und inkubieren Zellen bei Raumtemperatur für 10 min. 1 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin 5 min bei 300 bis 400 x g.
  3. Resuspendieren Zellen in 300 & mgr; l FACS-Puffer und unterteilt sie in drei Rohre (etwa 0,8 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, behalten die erste Röhre jeder Kulturbedingung für Ratten-IgG-PE-Färbung. Der zweiten Röhre, werden 3 ul anti-CD4 APC an CD4-Peptiden behandelten Zellen, 3 μl anti-CD8-FITC an CD8 Peptiden behandelten Zellen oder beide Antikörper zu Zellen ohne Peptide Behandlung. Verwenden Sie die dritte Röhre auf Ersatz Färbung. Für jede Kulturbedingungen, verwenden Sie drei Röhren von Zellen mit APC-konjugiertem CD4 FITC-konjugiertem CD8 oder PE-markierten CD3-Antikörper allein (3 ul pro Röhrchen) als Entschädigung Steuerungen für FL1, FL2 und FL4 Kanäle gefärbt.
  4. Wirbelzellen kurz. Lassen Sie auf Eis für 20 Minuten und vor Licht schützen. Fügen Sie 1,4 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand.
  5. Geschwenkt, um den Zellpellet (oder kurz Vortex) zu stören. Re-suspend Zellpellet in 250 ul Fixierung / Permeabilisierung solutionby Pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten und vor Licht schützen.
  6. Fügen Sie 1,2 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 300 ul FACS-Puffer.
    HINWEIS: An diesem Punkt können die Zellen an einen BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung in einem Kühlschrank vor Licht u übertragen oder gespeichert und geschütztp bis drei Tage.
  7. Fügen Sie 500 ul FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 500 ul 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 & times; g.
  8. Re-suspend Zellen in 100 ul 1x Perm / Wash, fügen 3,5 ul anti-IFN-PE auf das Rohr zuvor mit Antikörpern für CD4 und / oder CD8-T-Zellmarker in Schritt 6.3 und 3.5 ul Ratten-IgG-PE in der Röhre vorbehalten hinzugefügt IgG-Steuerung für 25 Minuten auf Eis und vor Licht schützen. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 & times; g. Wiederholen Sie den Waschvorgang durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer.
  9. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und dekantieren Stand. Wash-Zellen durch Zugabe von 1,4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 400 & mgr; l FACS-Puffer für die endgültige Übernahme.

7. Durchflusszytometrie Analyse der intrazellulären Zytokin-Färbung

  1. Verwenden Sie die gleichen Erfassungseinstellungen wie in Schritt 4.1. Create ein Gatter an lebenden Zellen (P2, siehe 2A). Stellen Sie die Spannung über die Entschädigung Rohre für jede Gruppe.
  2. Öffnen Sie zwei neue Dot-Plots, ein, um Daten für FL1 vs gesammelt anzuzeigen. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), und die andere ist, um Daten für FL4 vs gesammelt wurden. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erwerben 50.000 Veranstaltungen für die geschlossene Bevölkerung von jeder Probe.

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Ergebnisse

In der T-Zell-Priming-Assay wurden CFSE markierten CD4 + T-Zellen mit gereinigtem DCs aus der NS4B-P38G Mutante infizierten Wildtyp-MyD88 und kultiviert - / - Mäusen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptide. Markierten T-Zellen alleine mit oder ohne OVA kultiviert für 5 Tage wurden als negative Kontrollen verwendet. Wie in 1A gezeigt ist, wurden die gesamten T-Zellen für die Analyse der Fluoreszenzintensität von der FL1-Kanal torge. Die Markierung wurde auf der Grundlage...

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Diskussion

WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion 5 untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisierung...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse an T.W. (R01AI072060 und R01AI099123) unterstützt. G. Xie wurde durch ein Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) und Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) für die Bereitstellung der MyD88–/– Mäuse und Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) für die Bereitstellung von OTII transgenen Mäusen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMI 1640Invitrogen11875warmes Aufwärmen bei 37 > C
Anti-CD11c MagnetkügelchenMiltenyi Biotec130-052-001folgen Sie dem Hersteller'
Anti-CD4-MagnetkügelchenMiltenyi Biotec130-095-248folgen Sie dem Hersteller' Anweisungen
CFSEInvitrogenC34554
OVA-Rückstand 323-339Genscript CorporationRP10610
PeptideProimmunePC0AD-D
Brefeldin A-LösungBD Bioscience555029
Maus Fc Blockere-Bioscience14-0161-85
APC-konjugiertes CD4e-Bioscience17-0041-81
FITC-konjugiertes CD8e-Bioscience11-0081-82
Fixierungs-/PermeabilisierungslösungBD-Bioscience554722
Permeabilisierungs-/WaschpufferBD-Bioscience554723
Anti-IFNγ-PEe-Bioscience12-7311-82
Accuri DurchflusszytometerBD Bioscience

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Myd88 SignalisierungT Zell PrimingDurchflusszytometrieintrazellul re Zytokinf rbungIsolation dendritischer ZellenCFSE MarkierungBiosicherheitsstufe 2Mikrozentrifugenr hrchen SystemCD4 positive T Zellen
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