Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Zusammenfassung

Jüngste Verbesserungen bei organotypischen Hirnschnittpräparaten haben ihre Nutzung für biotechnologische Anwendungen ermöglicht. Organotypische Schnitte behalten lokale strukturelle Eigenschaften der in vivo-Biologie bei, einschließlich funktioneller synaptischer Verbindungen. Hier stellen wir eine regioselektive biolistische Verabreichungsmethode vor, um diese Scheiben zu markieren und genetisch zu manipulieren.

Zusammenfassung

Transfektion von DNA ist von unschätzbarem Wert für die biologische Wissenschaften und mit der jüngsten Fortschritte auf organotypischen Hirnschnittpräparaten, könnte die Wirkung von verschiedenen heterologen Genen somit leicht untersucht werden, während viele Aspekte der in-vivo-Biologie. Gab es eine wachsende Interesse terminal differenzierten Neuronen, bei denen konventionelle Methoden der Transfektion wurden mit Schwierigkeiten wie niedrige Renditen und erhebliche Verluste der Lebensfähigkeit transfizieren. Biolistischen Transfektion umgehen viele dieser Schwierigkeiten noch vor kurzem wurde diese Technik so modifiziert, dass sie zugänglich sind für die Verwendung in Säugetiergeweben.

Neue Modifikationen an der Beschleunigerkammer haben Brenn Genauigkeit der Gen-Kanone verbessert und erhöhte seine Eindringtiefen aber auch die Verwendung von niedrigeren Gasdruck (50 psi) ohne Verlust der Effizienz der Transfektion ermöglicht sowie Genehmigungs eine fokussierte regioselektive Ausbreitung der paRTIKELN innerhalb 3 mm. Darüber hinaus ist diese Technik geradlinig und schneller durchzuführen als mühsame Mikroinjektionen. Sowohl transiente und stabile Expression mit Nanopartikeln Beschuss möglich, wo die episomale Expression innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen werden, und das Überleben der Zellen wurde gezeigt, besser als oder zumindest gleich zu herkömmlichen Methoden. Diese Technik hat allerdings einen entscheidenden Vorteil: Es ist die Transfektion innerhalb eines einzigen zurückhaltend Radius lokalisiert werden somit dem Benutzer ermöglicht, Auswirkungen der heterologen Gens anatomisch isolieren lässt. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche Protokoll, um lebensfähige Erwachsene organotypischen Scheiben und legt diese der Transfektion regioselektive Verwendung eines verbesserten Gen-Kanone.

Einleitung

Ursprünglich wurde für Partikel-vermittelten Gentransfer in Pflanzenzellen ¹ das biolistische Technik, eine Turn-of-Phrase für "biologische Ballistik", etabliert. Diese physikalische Methode der Zelltransformation beschleunigt Mikro-oder Nanopartikel mit hoher Geschwindigkeit, um die physischen Barrieren der undurchlässigen Zellmembran, um Ladungen wie DNA-oder Farbstoffe liefern zu überwinden. Weil es nicht auf spezifische Liganden-Rezeptoren und / oder biochemischen Eigenschaften an den Zelloberflächenmembranen abhängen, können Teilchen-vermittelten Gentransfer ohne weiteres auf eine Vielzahl von biologischen Systemen angewandt werden, wie organotypischen Hirnschnitten.

Mit organotypischen Scheiben haben Vorteile gegenüber anderen In-vitro-Plattformen, da sie viele anatomische und biochemische Eigenschaften, die relevant für in vivo Biologie ^2-4 zu halten. Die Scheiben meist zur Erhaltung der lokalen architektonischen Merkmale, von wo sie ihren Ursprung haben und preserve neurochemische Aktivität und Konnektivität der Synapsen. Die Verwendung von Gehirnscheiben für Grundlagenforschung, und in pharmazeutischen bemüht hat, die gleichzeitig mit der Anzahl der möglichen biotechnologische Manipulation zu messen und zu überwachen, die neurobiologischen Verhalten des Gehirns in einem in vivo-Kontext wie ^3,5-7 erhöht. Die wesentlichen Vorteile für die Verwendung von organotypischen basierenden Assay-Systemen ist, dass es einfach experimentelle Kontrolle und ermöglicht eine präzise Manipulation der extrazellulären Umgebung.

Fruchtbar sind organotypischen Kultursystemen aus einer Vielzahl von Hirnregionen, wie festgestellt wurde, jedoch nicht beschränkt auf, den Kortex, das Rückenmark und Kleinhirn ^8-10 beschränkt. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Co-Kulturen nachgewiesen worden, die die Bewertung der interzellulären Kommunikation über distalen Hirnregionen sowie zwischen Neuronen und pathologische Zellen ^11,12 ermöglichen. Viele Protokolle haben bereits zu s etabliertuccessfully Kultur organotypischen Slices und kann langfristige Lebensfähigkeit zu erhalten und viele neuere Studien jetzt nutzen die Membran Interface-Methoden und verschiedene Modifikationen, um es ^13. Dieses Prinzip hält die organotypische Scheiben an der Grenzfläche zwischen dem Medium und feuchten Atmosphäre des Inkubators, indem die Scheiben auf einem porösen Membranfilter. Das Medium kann somit genügend Nährstoffe, um die organ Scheiben über Kapillare Bewegung zu ernähren. (; - 9 - 9 Tage alt P3 3) in der Regel Scheiben wurden aus der frühen postnatalen Tieren erstellt. , Hirngewebe von diesen Scheiben zeigen jedoch eine hohe zelluläre Plastizität und eine inhärente Widerstandsfähigkeit gegen mechanische Belastungen, die hilfreich ist, um lebensfähige Kulturen zu erhalten, noch nicht ausgereift Synapsen und neuroanatomische Schaltungen sind noch nicht vollständig in vivo bis 2 bis 3 Wochen alt entwickelt ^14. Zum Beispiel hatten frühere Beobachtungen, dass Hippocampus von P0 erhalten gezeigt - 1 Neugeborenen, obwohl hoch VIABle nach der Herstellung, nach und nach verloren einige morphologische Merkmale. Im Wesentlichen haben sie gezeigt wurden für Langzeitkulturen hindeutet unreifen Zellen ungeeignet waren eher dedifferenzieren Vergleich zu organotypischen Kulturen von älteren Tieren ^15,16. Aus diesem Grund hat unsere Methode für erwachsene organotypischen Hirnschnitten, bei der Reifung und architektonische Entwicklung haben ihren Endstadien ^13,17-21 erreicht optimiert. Dennoch ist dieses Verfahren auch geeignet für Neugeborene und juvenile organotypischen Slices.

Sobald die lebensfähigen organotypischen Scheiben hergestellt worden die gesamte Platte mit den Slices können dem biolistischer Halterung gebracht und vorgelegt und Transfektion regioselektive werden. Ordnungsgemäße Montage der Genkanone (wie in Figur 1 beschrieben), die um 90 ° in einem Abstand von 10 mm direkt über die Scheiben (von der Öffnung zu dem Gewebe) ermöglicht die schnelle biolistische Abgabe der 40 nm gehenld Partikelladungen beschichtet. Diese Ladungen, wie Farbstoffe und fluoreszierende DNA-Vektoren, wie auch ein beliebiges Gen von Interesse sind, leicht in die lebensfähigen Schichten mit Leichtigkeit geliefert werden. Diese Methode beschreibt somit das Protokoll notwendig, um zu liefern, in einer regioselektive Weise, Fracht beschichteten Gold-Nanopartikel in lebensfähige organotypischen Hirnschnitten. Das Gen Gewehrlauf und optimale Montage ist in Abbildung 1 zu sehen ist. Für weitere Informationen zu den verbesserten Lauf und Nanopartikel-Ballistik, finden Sie O'Brien, et al. ^17.

Nachfolgende Verfeinerungen sind ebenfalls angegeben, dass der Benutzer Bedingungen, wie die richtige Menge an Gold pro Zielgebiet geliefert, definiert als Mikro Wird geladen (MLQ) zu optimieren und die Menge an DNA pro mg Gold beladen, definiert als DNA-Loading-Verhältnis zu bestimmen (DLR). Vor der Fällung DNA auf Goldpartikel und dem Einlegen in den Tefzel Schläuche, die die eigentlichen Gen-Kanone "Patronen umfasst9 ;, ist es notwendig, die Menge an DNA und Gold für jede Transfektion benötigt, die unter Gewebebedingungen leicht abweichen kann berechnet (Verhältnis sollte zwischen 1 mg Gold und 1 ug DNA erhalten werden, 1: 5). Es ist wichtig, die richtige Anteil der MLQ vorbereiten, DLR, da sonst DNA beschichteten Goldpartikel könnten aneinander haften Bildung größer als erwartet Agglomeration, die die Homogenität des Gesamt biolistischer Verbreitung zu erhöhen sowie Gewebeschäden und Zytotoxizität reduzieren könnte.

Diese Methode zeigt die jüngsten Verbesserungen in biolistischer Lieferung, die als Test zugänglich für Neugeborene, jugendlichen und erwachsenen organotypischen Hirnschnitten zu sein. Ferner kann durch Nutzung der Genkanone Fasses verringert biolistische Ausbreitung ist der Benutzer nun in der Lage, eine punktuelle Bereich selektiv zu transfizieren im Gehirn. Nach der entsprechenden Inkubationszeit wurde die Expression von fluoreszierenden Proteinen, die ihre Maximalwerte zwischen 24 und 48 erreicht,hr, kann durch Epifluoreszenz und konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Diese Fluorophore erlauben die morphologische Analyse und Lokalisierung von einzelnen Zellen innerhalb biologisch relevanten Strukturen. Jedoch kann die regioselektive Modulation der organotypischen Scheiben durch andere heterologe Gene auch durch andere Tests zugänglich dieser Präparate beobachtet werden. Mögliche Arbeits Strategien zur lokalisierten Genübertragung sind in Abbildung 2 dargestellt.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren und tierischen Geweben sollten strikt Ethikkommission Genehmigung nach lokalen Regeln und Vorschriften einhalten. Alle Gewebe während dieser Studie zu Tierversuchen Richtlinien des MRC-LMB halten erhalten.

1. Herstellung der Werkstoffe & Kultur, Medien

1. Bereiten Sie alle Lösungen mit Millipore-Wasser; nur analytischer Qualität Reagenzien. Vorzubereiten und alle Reagenzien speichern bei RT (wenn nicht anders angegeben).
2. Machen 500 ml HEPES-gepufferter Salzlösung (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtriert durch ein 0,2 um Sterilfiltereinheit. Lagerung bei 4 ° C.
3. Machen 500 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Durch Autoklavieren sterilisieren.
4. Bereiten neuronalen Medium durch Ergänzung DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) mit 25 mM HEPES, 10% fetales Kälberserum, 30 mM Glucose, 1: 100 N2 supplement, Penicillin-Streptomycin 1.100 U / ml; pH-Wert 7,2. Filter mit 0,2 um Sterilfiltereinheit. Lagerung bei 4 ° C.
5. Machen Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Stammlösung mit 20 mg PVP in 1 ml 100% Ethanol. Aliquoten diese in 1 ml-Mengen, einfrieren und bei -20 ° C. Arbeitslösung beträgt 0,05 mg / ml, also fügen Sie 10 ul von PVP-Stammlösung zu je 4 ml 100% Ethanol.
6. Bereiten Sie eine 0,05 M Spermidin Stammlösung in Millipore-Wasser; den pH-Wert auf 7,2.
7. Machen Sie eine 2% igen Lösung in DMEM (2 g Agarose-Elektrophorese Grad in 100 ml DMEM in einem sterilisierten Schraubverschluss-Flasche). Mikrowelle dies, bis die Agarose gelöst hat. Speichern in der 4 ° C-Kühlschrank für mehrere Wochen, falls erforderlich.

2. Herstellung der Scheiben Organotypische

1. Einschläfern C57 Schwarz 6 Mäuse der gewünschte Alter von CO ₂ Ersticken gefolgt durch Enthauptung. Entfernen Sie das Gehirn mit lateralen Schädelsenkungen ab dem Foramen magnum und endet andie Riechlappen. Heben Sie den Schädel von hinten, das Gehirn zu schützen.
2. Zwischen den Riechlappen und dem frontalen Kortex, und rostral des Kleinhirns zu schneiden. Heben Sie die rostralen Teil des Gehirns, und schneiden Sie die Sehnerven. Schließlich entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einer Petrischale mit eiskaltem HEPES-gepufferte Kochsalzlösung auf Eis gefüllt.
3. Mit Hilfe eines Binokular, abziehen der pia mit feinen Pinzetten; entfernen Sie vorsichtig die Blutgefäße und Hirnhäute, die das Gehirn.
4. Legen Sie den frischen Gehirn in einen kleinen Empfänger Form und decken Sie es mit der Agarose-Lösung gekühlt, um etwas über RT. Dann rasch Abkühlen des Form bis 4 ° C, indem es auf Eis.
   HINWEIS: Verarbeiten Sie die Scheiben so schnell wie möglich, um den Verlust der Lebensfähigkeit zu vermeiden.
5. Wenn die Agarose-Set (5 - 10 min), entfernen Sie die Agarose eingebettete Gehirn aus der Form (ggf. schneiden) und dann kleben Sie es auf der vibroslicer Plattform. Legen Sie diesen in eine Kammer, die sterile vibroslicer eiskaltem PBS. Disinfect die vibroslicer Kammer, bevor sie mit 70% Ethanol verwendet, um nachfolgende Kontamination zu minimieren.
6. Schneiden Sie das Gehirn mit Hilfe eines speziell angefertigten vibroslicer oder kommerzielle gleichwertig. Das Modellkonzept war, um eine Gewebeschneidemaschine, die mit großer Amplitude und hoher Frequenz Bewegungen horizontal an den Rand der Klinge zu erzeugen, könnte bei Minimierung vertikale Schwingungen zu entwerfen.
7. Verwenden der Schwingungsfrequenz von 90 Hz bei einer Amplitude von 1,5 - 2,0 mm, und die Schneidklinge in einem Winkel von 15 ° zur Horizontalebene angeordnet ist; stellen Sie den Montageblock hält die Agarose-embedded Gehirn bei 1,7 mm / min zur Klinge hin zu bewegen. Sammeln Abschnitte (150 um) in eine Kammer mit eiskaltem Kulturmedium (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Ansicht Schneiden und Manipulation der Gewebeschnitte als ergänzende Video in Arsenault und O'Brien ^13.
8. Ganz sanft die Scheiben in Zellkultur-Einsätze (0,4 um, Durchmesser 30 mm) in einer 6-Well-Multischale mit Kultur media auf der Außenseite des Einsatzes, und Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO _2.
   HINWEIS: Für die richtige Lebensfähigkeit des Gewebes, extrem sanft während der Übertragung und Manipulation der Scheiben. Außerdem wird zu viel Flüssigkeit die organotypische Scheiben von an die Membran des Filtereinsatzes anhaftet. Wenn dies der Fall, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit oder wieder zu plattieren.
9. Obwohl organotypischen Scheiben können für ein paar Wochen kultiviert werden, fahren Sie mit der Transfektion nicht später als 4 Tage nach der Beschichtung für besten Transfektion Erträge.
   HINWEIS: Um Gliazellen Wucherung in der Langzeitkulturbedingungen, Verwendung AraC oder Serum freien Medium ² zu vermeiden.

3. Herstellung von DNA-beschichteten Mikro-und Nano-Geschosse

1. Bereiten Nano-Geschosse mit 40 nm Durchmesser Goldpartikel. Kurz gesagt, werden 50 ul 0,05 M Spermidin und 10 ul DNA in 1 mg / ml (pEYFP-N1) zu 10 mg Goldpartikel.
   1. Zusatz von Calcium und Spermidin in der Lösung Mixratur während der DNA-Goldmikropartikeln Vorbereitung, um bei der Bindung von DNA-Molekülen an die Gold-Nanopartikel zu unterstützen.
      HINWEIS: Die DNA-Menge pro mg Goldträger (DLR) verwendet wird, sollte zwischen 1 und 5 g DNA pro 1 mg Gold reichen. Weiterhin ist die Menge an Gold, die Trägerpartikel pro Kassette (MLQ) geschossen wird, sollte sich im Bereich von 0,1 bis 0,5 mg Gold. Der DLR und MLQ sollte versucht und für jeden Benutzer in Abhängigkeit von der jeweiligen untersuchten System als auch die Art der Teilchen und Genkanone optimiert werden.
2. Mischen unter Verwendung eines Vortex während langsam 50 ul 1 M CaCl ₂ in Anteilen von 10 bis 15 ul. Nach 5 min von gelegentlichen Wirbeln, Zentrifuge bei 1000 g für 30 Sekunden, dann entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Goldpartikel-Pellet in 3,5 ml 0,075 M PVP.
3. Zeichnen Sie diese Suspension in Schlauch (2,36 mm Innendurchmesser) mit einer Spritze. Das Rohr in der Rohrvorbereitungsstation. Lassen Sie dieGoldpartikel absetzen und den Überstand durch Absaugen mit einer Spritze. Drehen Sie den Schlauch an gleichmäßig verteilt die Goldpartikel, die dann unter einem konstanten Stickstoffstrom bei 5 l pro min getrocknet wurden.
4. Um DNA-Kugeln zu erzeugen, schneiden Sie den Schlauch mit einem Rohrschneider in 1 cm Länge. Entweder legen Sie sofort in die Gen-Kanone Patrone oder halten trockneten (4 ° C), bis sie benötigt.

4. Biolistic Transfektion auf Organotypische Scheiben

1. Führen Sie die folgenden Schritte innerhalb einer sterilen Laminar-Flow-Haube.
2. Legen Sie eine 9-V-Batterie und eine leere Patronenhalter in die Helios Gene Gun.
3. Befestigen Sie die Gen-Kanone auf den Heliumtank mit dem Helium-Schlauch. Feuer 2 - 3 Rohlinge (leeren Slots) bei 50 psi, um das Helium-Schlauch und die Stauseen in der Pistole Druck zu setzen.
4. Legen Sie die Kartuschen mit den DNA-beschichteten Gold in den Patronenhalter, und laden Sie den Halter in die Gen-Kanone.
5. Schrauben Sie die Gen-Kanone Abstandshalter und befestigendas modifizierte Gen Gewehrlauf zu der Genkanone.
6. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie einen Filtereinsatz mit dem organotypischen in eine sterile Plastikschale.
7. Entfernen Sie das Medium aus organotypischen Scheiben schneiden.
8. Stellen Sie den Gasdruck auf 50 psi.
   HINWEIS: Augenschutz ist wichtig und Gehörschutz ratsam.
9. Platzieren der Genkanone an den entsprechenden Abständen mit Hilfe des Montage gemessen, 10 mm. Sorgfältig Ziel das Zentrum des Zylinders auf den gewünschten Bereich für die genetische Lieferung.
10. Nach dem Brand, ersetzen Sie die Einsätze wieder in ihre Schale mit frischen Medien und bringt sie zu normalen Wachstumsbedingungen, dh 37 ° C mit 5% CO _2-Inkubator.
11. Sobald Sie fertig sind, schließen Sie den Heliumtank, den Druck von der Gen-Kanone und nehmen Sie die Gen-Kanone aus dem Heliumtank.
12. Entfernen Sie die Patronenhalterung auf und entsorgen Sie die Patronen und reinigen Sie die Gen-Kanone.
13. Überprüfen Sie das Gewebe für die Morphologie und für die erfolgreiche Durchdringung von VisualisierungsLizing die Scheiben mit einem inversen Mikroskop. Bei der Verwendung von Mikropartikeln, die gleichmäßig verteilen das Gold; sollte es keine dichten Bereichen der Goldpartikel auf der Scheibe zu sehen sein. Nanopartikel aufgrund ihrer geringen Größe nicht als einzelne Einheiten mit herkömmlichen Mikroskopie-Techniken gesehen werden.
14. Nach der entsprechenden Zeitintervall (in der Regel 1 - 2 Tage), fixieren Sie die Scheiben in 4% Paraformaldehyd (PFA) für die Mikroskopie Beobachtung.
    HINWEIS: Befestigung in PFA ist nicht immer erwünscht. Für Live-Cell-Imaging diesen Schritt zu vermeiden.

5. Fixieren und Visualisierung von Hirnschnitten

1. Nach biolistischer Transfektion, waschen Scheiben zweimal in PBS für 2 min.
2. Fix Scheiben durch Inkubation in frisch gemacht, eiskalt 4% PFA in PBS für 20 min.
3. Scheiben waschen zweimal in PBS für 2 min.
4. Vorsichtig schneiden rund um die Membran unterstützt mit einem Skalpell, ohne die auf ihnen befestigt Scheiben stören. Zange verwenden, um jeden Membranträger / Scheibe auf einem Mikroskop-Objektträger legen. Ruhen die organotypIC-Scheiben auf der Oberseite der Membran auf der Glasplatte.
5. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf der Oberseite der Scheibe und fügen Sie ein Deckglas sanft ohne Kraft direkt in Kontakt mit der organotypischen.
6. Sichern Sie das Deckglas mit einer dünnen Schicht von Nagellack.
7. Sehen Sie sich die Scheiben auf einem geeigneten Mikroskop.

6. Die konfokale Anwendungen

1. Visualisierung der Scheiben unter Verwendung einer aufrechten Scanning Laser konfokalen Mikroskop mit einem 60x / 1,4 numerische Apertur (NA)-Ölimmersionsobjektivlinse.
   HINWEIS: Die meisten Probleme Merkmal des konfokalen Mikroskops ist die Lochgröße (bei 1 AU gesetzt), die in der Lage ist die Isolierung und Sammeln einer Fokusebene, wodurch die außerhalb des Fokus 'Dunst' in der Regel mit einer Leuchtstoffprobe zu sehen ist. Feine Details sind oft von dieser Dunst verdeckt und in einer nichtkonfokal Mikroskop nicht entdeckt werden.
2. Stellen Sie den Argon-Laser, um eine Anregungswellenlänge von 488 nm und für die Sammlung von em optimierenitted Licht im Bereich von 500 bis 520 nm-Band. Typischerweise sammeln Bilder bei 1.024 x 1.024 Pixeln und mit Stapeln von Z-Profilen bei 0,5 um Abstand, um die volle Breite jeder Nervenzelle, die analysiert wurde, umfassen.
   1. , Um die Morphologie des Zellkerns zu beobachten, Gegenfärbung diese Zellen mit DAPI (Anregungswellenlänge bei 405 nm zwischen 420 gesammelt und Emissionslicht Set - 4 40 nm). Schließlich für die Prüfung rote Fluoreszenz, stellen Sie den Laser bei 561 nm zur Anregung und 565-620 nm für die Emission.
3. Typischerweise erwerben Bilder durch die Verwendung eines Scan-4X Zoom, der eine Fläche von 57,6 um ² fallen; Bildgrößen lagen im Bereich von 1.024 x 1.024 Pixel. Rekord Stapel von Z-Profile in 0,5 um Intervalle und Projektionen von 5-8 Frames kombiniert.

Ergebnisse

Organotypischen Lebensfähigkeit kann mit Laktat-Dehydrogenase-Aktivität, Propidiumiodid Kennzeichnung und dUTP-Färbung beobachtet werden, wie zuvor berichtet, ^13,22. Offenbar sind die Überlebensfähigkeit und die Integrität der Scheiben für die langfristige nachhaltige Ausdruck der gelieferten genetische Fracht. Folgende biolistische Abgabe in die organotypische Scheiben wurde die Expression des heterologen Gens Fluoreszenz durch konfokale Mikroskopie überwacht. Die Dichtheit des biolistischen Ausbreitung nach der modifizierten Lauf in Figur 3A gesehen werden. 3B zeigt ein repräsentatives Bild des transfizierten Hippocampus Region mit DNA-beschichteten Gold-Nanopartikel. Figur 4 zeigt repräsentative Bilder von transfizierten erwachsenen Maus organotypischen Slices. Wie in 4A, einer Purkinje Neuronen mit einer bemerkenswerten dendritischen Hafen an der Schnittstelle der Purkinje-Schicht und der Molekularschicht des cer gefunden sehenebellum zeigt deutliche Kennzeichnung folgende transiente biolistische Transfektion mit pEGFP-N1. 4B zeigt eine höhere Vergrößerung dieser Dendriten in dem Stacheln beobachtet werden. 4C zeigt eine Pyramidenzellen in der CA1-Region des Hippocampus folgenden biolistische Abgabe pDSredFP beschichteten Gold-Nanopartikel .

Farbstoffe anstelle von fluoreszierenden DNA codiert Ladungen können auch in einer ähnlichen Weise verwendet werden, um morphologische Merkmale in organotypischen Scheiben visualisieren. DiO, die die Plasmamembran markiert, kann schneller Abgrenzung einzelner Zellmorphologien oder kann in Verbindung mit einer DNA beschichtet biolistische auf dieselbe Region geliefert verwendet, um die Regioselektivität zu bestätigen. Wie in 5A gesehen werden ein Neuron mit DiO gefärbt im Hippocampus zeigt auch lange Dendriten mit zahlreichen Stacheln. Ein Pfeil zeigt die Axone, die durch die Anwesenheit von synaptischen boutons im Vergleich zum dentrit identifiziert wirdIC Stacheln auf der anderen Neuriten. 5B zeigt ein weiteres Beispiel der CA1, der zahlreiche hippokampalen Projektionen mit DAPI Gegenfärbung hebt den Kern kennzeichnen. 5C zeigt eine höhere Vergrößerung dieser Arten von Parallel Dendriten mit zahlreichen Stacheln.

Offenbar sind diese Bilder veranschaulichen morphologischen Eigenschaften folgende zellulären Kennzeichnung. Nichts hindert die gleiche Methodik aus angewandt wird, um eine beliebige Anzahl von exogenen Genen auf den Gold-Nanopartikeln beschichtet liefern. Um eine visuelle Bestätigung der erfolgreichen Transfektion erlauben kann ein einzelnes Plasmid konstruiert werden, um co-exprimieren sowohl das Gen von Interesse und ein fluoreszierendes Reporterprotein auf demselben Vektor.

Abbildung 1. Gene Kanonenrohr und Montage. (A) Die Verbesserung d Barrel von Dr. O'Brien am MRC-LMB, die eine eingeschränkte biolistischer Ausbreitung, die Gewebeschäden durch eine Senkung der erforderliche Druck für die Partikelbeschleunigung minimiert entwickelt hat. (B) Die Seitenansicht eines optimierten Gen-Kanone Montage von Dr. Henderson entwickelt und Dr. Andras Nagy an der Universität von Toronto. Die Montage enthält der Genkanone genau 90˚ senkrecht zu den organotypischen Scheiben, während es dem Benutzer, genau zu steuern, den Abstand des biolistischen Anlieferung. Für eine optimale biolistischer Bedingungen der Lauf Öffnung sollte direkt über der Region von Interesse an einem 10 mm Abstand von der organotypischen Scheiben gelegt werden. (C) Rückansicht des Gen-Kanone Montage. Die Region von Interesse transfiziert werden muss, direkt unterhalb der Trommel Öffnung platziert werden. Targeting kann mit Farbstoff (DiOLISTIC) oder fluoreszierende Protein Transfektion (biolistischer) bestätigt werden.ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Organotypischen Vorbereitung und regioselektive Targeting. (A) A DMEM eingebettet erwachsenen Gehirn der Maus für die Scheiben. (B) Die Form wurde auf die vibroslicer Montage mit der Klinge bereit, um eine Scheibe geschnitten geklebt. (C) regioselektive heterologe Genexpression Strategien für biolistischer Lieferung in koronalen organotypischen Hirnschnitten. Bilder von Bildern aus den Allen-Gehirn-Atlas anatomischen Referenz Atlas ²³ erhalten wurde. Linke Tafel zeigt zwei verschiedene Hirnregionen als Beispiel gezielt. Um die Genexpression (1) mit dem kortikalen Bereich der linken Hemisphäre beschränken. Um die heterologe Genexpression (2) an den Hypothalamus-Region des Gehirns zu beschränken. Mitteltafel zeigt that die Expression von zwei heterologen Genen (3 und 4) kann isoliert werden und vergleicht den Hippocampus von zwei Halbkugeln in der gleichen organotypischen wesentlichen Beseitigung jeglicher Vorspannung von mit verschiedenen Abschnitte sind und / oder die Möglichkeit zum distalen Übersprechen von den Auswirkungen der Adresse diese Gene. Rechte Bild zeigt die mögliche Überschneidung von transgenen Lieferung an das erste Gen (5) in einer genauen kortikalen Bereich, während ein anderes Gen (6) in einer disparaten noch überlappenden kortikalen Bereich ausdrücken auszudrücken. Dies ermöglicht, den Effekt der genetischen Modulation jedes heterologe Gen allein und auch in Kombination innerhalb der gleichen Schicht zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Biolistic Streumuster auf filt gesehenER Papier und Bilder mit niedriger Vergrößerung. (A) Die verbesserte Zylinder wurde auf Filterpapier gebrannt, um die Ausbreitung der Goldpartikel zu bestimmen. Linken Seite zeigt die Verteilung der verbesserten Barrel, während die rechte Tafel zeigt den normalen Lauf. Schwarzer Balken: 1 cm. Bild von O'Brien et al. Genommen ^17. (B) geringer Vergrößerung Bild, das die stochastische Transfektion prasseln in den 3 mm biolistischer Streuung in der Hippocampus-Region von 6 Wochen alten Mäusen. Weiße Balken:. 100 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Biolistic Lieferung von Fluoreszenzprotein kodiert DNA in organotypischen Scheiben von 6 Wochen alten Mäusen. (A) Inverted konfokale Bilder von einem festen Organotypischen des Kleinhirns eines pEGFP-N1 beschichteten Goldpartikel transfiziert Purkinje-Zelle. Das Bild wurde bei 40-facher Vergrößerung. Schwarzer Balken:. 30 um (b) zeigt eine 60-fache Vergrößerung der dendritischen Hafen einer anderen Purkinje Zelle, um die Stacheln zu markieren. Schwarzer Balken. 5 um (c) zeigt ein konfokales Bild von festen Scheiben aus dem Hippocampus, auf 60-fache Vergrößerung von vier genommen DSredFP transfiziert Pyramidenzellen. Schwarzer Balken:. 10 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. DiOLISTIC Lieferung von Membrankennzeichnung Fluoreszenzfarbstoffe in organotypischen Slices. (A) zeigt die Echtzeit-Bildgebung des Hippocampus lmit 20-facher Vergrößerung unter DiO abeled. Die dendritischen Dornen deutlich sowie die Axon wie durch die Abwesenheit von dendritischen Dornen und die Anwesenheit von synaptischen boutons durch einen weißen Pfeil kenntlich zu beachten. Weiße Balken:. 30 um (B) ausgesprochene Färbung des Hippocampus-Region mit DiO markiert und mit DAPI gegengefärbt. Weiße Balken:. 30 um (C) Höhere Vergrößerung (60x) der dendritischen Dornen in der CA1-Region des Hippocampus gefunden. Weiße Balken:. 5 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Das Protokoll beschreibt Ansätze für Farbstoffe und genetischen Materialien in das Erwachsenen organotypischen Scheiben mittels eines erweiterten Gen-Kanone zu liefern. Im Wesentlichen machen die Arten von Farbstoffen und die Vielfalt der möglichen Gene dieses Verfahren vielfältig und offen für ein breites Spektrum an biologischen Fragen zu beantworten. Die regioselektive Liefermethode verwendet, in diesem Fall auf bestimmte Gehirnregion, eröffnet neue Wege für Experimente als heterologe Gen Modulation der lokalisierten Bereichen innerhalb einer biologisch relevanten Architektur ist nicht leicht möglich gewesen, bevor. Wir haben früher festgestellt, dass dieses Verfahren auf die Erwachsenen organotypischen Scheiben, wobei reifen Synapsen vollständig ausgebildet, wie es zeigte verbessertes Zellüberleben und die heterologe Genexpression für viele Wochen ¹³ verwendet werden. Mit dem Aufkommen von neuen und verbesserten Kulturbedingungen für Säugetier Gehirn und andere Gewebe, ist die Verwendung von regioselektive genetischen Modulationen immer nützlich für eine Vielzahl von Bioche werdenchemische Analysen.

Wie wir hier und sorgen für die Heraus zuvor von anderen ²⁴ erwähnt, könnte viele verschiedene Faktoren leicht auf die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der biolistischer Lieferung. Erstens muss die Herstellung der Goldpartikel zu Farbstoffen oder DNA verknüpft ausreichend ausgeglichen werden, um eine Aggregation zu verhindern und um die Kassette Ladung Austreibung erleichtert. Calcium und Spermidin in der DNA-Goldmikropartikel-Lösung kann die Bindung von DNA-Molekülen an die Gold-Nanopartikel zu unterstützen. Die Fähigkeit der Nanopartikel, um die Zellen unter vermindertem Druck durchdringen vorher bestimmten ¹⁷ wurde. Zweitens muss der Genkanone möglichst konstant mit der richtigen Winkel und Abstand montiert werden. Eine zuverlässige Druckanzeige ist auch die Reproduzierbarkeit erforderlich, um die Gewebeintegrität zu halten und um richtig zu beschleunigen die Goldpartikel, um ihre beabsichtigten Ziele. Tatsächlich sind auch der Abstand, die Ausrichtung und Stabilität des Gerätes eine entscheidende Faktoren für die targeting und Präzision der regioselektiven Lieferung. Da diese Gehirnstrukturen sind sehr klein, könnten kleinere Variationen in der Zündwinkel leicht machen das gesamte Verfahren weniger zuverlässig. Und schließlich haben die Vorbereitung und Wartung von lebensfähigen organotypischen Scheiben mit Schwierigkeiten für viele Jahrzehnte voller wurden noch reichlich vorhanden und zuverlässige Protokolle für verschiedene Tiere, Hirnregionen, Alter und Co-Kulturen sind derzeit ^2,4,25,26. Diese Verfahren sollten Benutzer-optimiert, bevor sie die Gewebe biolistischer Verfahren. Dies wird leichter erlauben dem Benutzer, festzustellen, unbefangen die Auswirkungen der biolistischen Teilchen und die Wirkung des heterologen Gens in ihrem eigenen Kulturen. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von Fluoreszenzgene wie EYFP und EGFP beide ermöglichen eine neue Benutzer die Zielgenauigkeit testen und zusätzlich die zelluläre Lebensfähigkeit durch heterologe Genexpression über einen längeren Zeitraum ^13. Viele der kritischen Schritte für eine zuverlässigeund reproduzierbare Verwendung dieses Protokolls sind in den folgenden drei Absätze hervorgehoben.

Für eine effiziente Transfektion, muss die DNA-Konzentration geeignet. Konzentrationen, die zu niedrig sind, würden die Transfektion Ausbeute behindern, während Konzentrationen, die zu hoch sind, können Agglomeration der Nanopartikel führen. Aggregate von Gold drastisch reduzieren können Transfektionseffizienz, zu einer ungleichmäßigen Verteilung und kann zu einer erhöhten Zytotoxizität und oxidativen Stress führen. Probleme mit Beschichtungseffizienz wahrscheinlich aufgrund des Ablaufs der Spermidin-Lösung (sollten alle 2 bis 3 Monate ersetzt werden). Für eine angemessene Verbreitung biolistischer, muss die Kennzeichnung auch sein. Eine nicht-homogene Markierung des Gold-Nanopartikel / DNA-Suspension kann durch die PVP-Lösung. Es sollte auch alle 2 bis 3 Monate ausgetauscht werden. Beschichtung der Gold-Nanopartikel können auf Agarose-Gelelektrophorese als eine Bande mit höherem Molekulargewicht ²⁷ gesehen werden.

Jedes biologische Sysem untersucht sowie jedes andere Instrument könnten kleine Änderungen in der Gasdruck erfordern optimierte Ebenen der Transfektion und biolistischer Verbreitung zu erreichen. Der kritische Parameter ist der Druck des Heliumimpuls benötigt, um die Mikro-oder Nanoträger aus dem Kunststoff Kartuschenstreifen und treiben sie in das Gewebe. Ein hoher Gasdruck wird das Überleben der Zelle zu beeinflussen, weil sie Schockwellen in dem Ziel erstellen und unterbrechen und Abbau der Gewebe von der Matrix ^17. Ziel der Genkanone Lauf und mit der Vorrichtung genau senkrecht zu dem Gewebe ist wichtig für eine genaue biolistischen Anlieferung. Der ausgewählte Bereich in der unmittelbaren Zentrum des Zylinders genau 10 mm von der äußeren Öffnung angeordnet werden. Dies führt zu einer 3 mm Durchmesser der Goldpartikelliefer um den Mittelpunkt. Das Gen Gewehrlauf sollte mit 70% Ethanol nach jeder Verwendung gereinigt werden. Um das Gewebe von großen Partikelaggregate zu schützen, enthält die Trommel auch ein Nylonnetz das ShoULD, um optimale Leistung zu erhalten regelmäßig ausgetauscht werden. Um ersetzen die Maschen schrauben Sie den Deckel legen dann eine neue Nylon-Mesh zwischen der Kappe und dem O-Ring.

2 Tage nach der Transfektion um das Epizentrum - fluoreszierend markierten Zellen sollten sichtbar mindestens 1 ist. Fehlen oder Fehlausrichtung der Markierung kann durch unzureichende Vorbereitung und Instabilität der Gen-Kanone Montage führen. Die Beobachtungen der Zellen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, hängt von einer Reihe von Faktoren ab: die Wellenlänge des Anregungs / Emissionslicht, Lochblendengröße, NA der Objektivlinse, der Brechungsindex der Komponenten in dem Lichtpfad, der Tiefe des Gewebes und der Ausrichtung das Instrument. Diese Faktoren sind für jedes untersuchte System optimiert werden.

Jüngste Fortschritte in der Biolistik wurden für den Erfolg dieser Methode ausgenutzt. Das Gen Geschützrohr in dieser Studie verwendet wurde, um den notwendigen Druck zu verringern sowie Trichter des biolistischen modifiziertenStreumuster in einer eingeschränkten und spezifischen Bereich ^17,19. Andere Fass Änderungen haben versucht, die Ausbreitung zu begrenzen und biolistischer den Abfluss Druck ²⁸ zu reduzieren noch diese kundenspezifische Gen Gewehrlauf von Dr. O'Brien entworfen ist eine einzelne Komponente der Standard Helios Gene Gun ausgestattet. Anschließend wurden Submikrometer-Goldpartikel verwendet werden, um die Invasivität der Mikropartikel, die wir zuvor bestimmt war verringern verursacht Zellschäden und letztlich Verlust der anhalt heterologe Genexpression. Diese Änderungen des biolistischen Verfahrens verbessert die allgemeine Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens ^13. Weitere Verbesserungen auf Schnittpräparat wie eingehende Fehlersuche an der Schneideverfahren mit einem DMEM-Agarose-Matrix, um das Gehirn zu erhalten, und zahlreiche andere nützliche Fortschritte in der organotypischen Hirnschnittpräparat bereits berichtet ¹³ konnten wir die Verwendung von adulten Scheiben zu erkunden, dass haben reife entwickeltsynaptischen Netzwerken.

In unserer Untersuchung haben wir hauptsächlich verwendeten Farbstoffe und fluoreszierende heterologe Gene Zellmorphologie als Auslese auf die Transfektionseffizienz und die Fähigkeit, Bild die morphologischen Eigenschaften von Neuronen im Gehirn der Maus Gewebe zu visualisieren. Das Signal-Rausch-Verhältnis des stochastischen Lieferung innerhalb eines definierten Radius konnten wir dendritischen Hafen einer einzelnen Zelle innerhalb seiner nativen Kontext vollständig zu isolieren. Zahlreiche Anstrengungen verwendet, um diese morphologischen Eigenschaften zu untersuchen, Mapping "connectomics" oder Einzelzellen für verschiedene Analysen zu markieren, kann dieses Verfahren leicht mit bestehenden Protokollen wie Elektrophysiologie und Neuriten Messungen ^29,30 kombiniert werden. Offensichtlich könnten Kombinationen von fluoreszierenden heterologen Genen eine wesentlich stabilere Abgrenzung der einzelnen Zellen der stochastischen Verteilung von fluoreszierenden Proteinen zu ermöglichen, und deren Kombination würde die Farbe der einzelnen Zellen bestimmen ^31,32. Die Verwendung von Zell-spezifische Promotoren wie Synapsin und gliale fibrilläre saure Protein stromaufwärts des heterologen Gen-Exon kann auch beschränken den Ausdruck Subpopulationen ^33. Tatsächlich ist die unendliche Vielfalt des genetischen Materials könnte auch in einer regioselektive Weise durch Gold-Nanopartikel mit dem gleichen Verfahren geliefert werden. Die Gesamt transfiziert Regionen können so mit traditionellen Methoden, wie Präparation und Einreichung dieser Region Western-Immunoblotting, um die lokale Wirkung des heterologen Gens zu analysieren analysiert werden.

Verbesserungen in organotypischen Verfahren gestatten auch breitere Verwendung von Hirngewebe für die Langzeitversuche und erlauben die Verwendung von anderen Geweben und Mischkulturen und Transfektion erleichtern würde. Lipid und Polymer-Transfektion wurde bereits berichtet, um Membran Homöostase, Internalisierung, Proteindurchlässigkeit beeinflussen ³⁴ und zeigen häufig sehr geringe Effizienz zu transfizieren terminally differenzierten Neuronen. Zellspezifischen Targeting Ladung ist auch zugänglich nur Zellen, die die Zelloberflächenrezeptoren für die Internalisierung benötigt exprimieren, und obwohl dieses Verfahren hochselektiv ist, kann sie gezielt Regioselektivität ³⁵ Lack. Virale Vektoren sind sonst oft schwierig und teuer in der Herstellung, erfordern strengere Vorschriften und haben gelegentlich demonstriert Sicherheitsbedenken. Biolistic Lieferung hat somit eine einzigartige Möglichkeit, regioselektiv Transfektion von Neuronen und anderen Zelltypen innerhalb tragfähige Gewebe. Da Gold ist nicht toxisch, weitere Fortschritte bei der Verwendung von Biolistik den Weg für biomedizinische Anwendungen, wie transdermale Arzneimittelabgabephysiologischen in vivo Gentransfer sowie lokalisierten nichtvirale Gentherapie zu ebnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Helios Genpistole	System Bio Rad	165-2431	Genpistole und Tube Prep Station
HEPES	Sigma	83264-100ML-F
NaCl	Sigma	S7653-250G
KCl	Sigma	P9333-500G
Na2HPO4	Sigma	S7907-100G
KH2PO4	Sigma	P9791-100G
0.2 µ m sterile Filtereinheit	Millipore	SCGPU05RE	zu Filtermedien
DMEM	Gibco	21885-025
Fötales Kälberserum	Gibco	10270-098
D-Glucose	Sigma	G8270-100G
N2	Life Technologies	17502-048
Penicillin/Streptomycin	Sigma	p4333
Polyvinylpyrrolidon	Sigma	856568-100G
Ethanol	Sigma	277649-100ML
Spermidin	Sigma	S2626
Agarose	Bio Rad	161-3100EDU
Vibroslicer	Laica	VT1200	Wir haben eine kundenspezifische
Genpistolenhalterung			, die im Haus an der U of T gebaut
Befeuchteter Zellkultur-Inkubator
Goldnanopartikel	Zytodiagnostik	G-40-20
pEYFP-N1	Clontech
Schlauchschneider	Bio Rad	165-2422
Tefzel Schlauch	Bio Rad	165-2441
Zylinder			Sonderanfertigung durch die LMB
Zellkultureinsatz	Millipore	PICM0RG50
Paraformaldehyd	Sigma	76240 Fluka
Präpariermikroskop			für mehr Komfort
Konfokalmikroskop			benutzerdefiniert für die Verwendung
Objektträger	VWR	2588-CA48323-185
Microcover-Glas	VWR	2448-CA48366-067-1
Vectashield Eindeckmedien	Vector Laboratorien	H-1400