Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.
Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों व्यापक और अधिक सुलभ हो गए हैं, अब प्रतिलेखन कारक की खोज के लिए सक्षम बनाता है जो NGS का पता लगाने (चिप seq के), द्वारा पीछा immunoprecipitation chromatin है प्रोटीन डीएनए बातचीत के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए प्राथमिक विधि हिस्टोन संशोधनों की साइटों या पैटर्न बाध्यकारी। चिप seq के समृद्ध डीएनए टुकड़े की माप के द्वारा प्रोटीन डीएनए बातचीत की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पूरे जीनोम के उच्च throughput डेटा प्रदान करने में लाभदायक है। हालांकि, इस तरह के एक अनुक्रमण पुस्तकालय बनाने के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने में कठिनाई के रूप में मानक चिप seq के प्रयोगों में कुछ नुकसान कर रहे हैं।
चिप प्रयोगों, सेल और immunocomplexes के sonication द्वारा क्रोमेटिन बाल काटना, 3) के गठन शामिल है, जो 2) नमूना तैयार 1) crosslinking प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी क्षेत्रों सहित छह बुनियादी कदम में बांटा जाता हैImmunocomplexes की 4) वर्षा, immunocomplexes की 5) धोने, और qPCR और NGS से समृद्ध सामग्री और विश्लेषण के 6) क्षालन।
अपने आत्मीय प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी का एक अच्छा क्रोमेटिन तैयारी, मूल नमूने में प्रतिजन की राशि है, और विशिष्टता और आत्मीयता: एक चिप परख की सफलता के तीन मुख्य कारकों पर निर्भर है। एक प्रमुख सीमा एक अनुक्रमण पुस्तकालय बनाने के लिए पर्याप्त समृद्ध डीएनए को प्राप्त करने के क्रम में सेल नंबर शुरू करने की उच्च मात्रा के लिए आवश्यकता है। ऐसे बायोप्सी नमूने या सेल उप आबादी के रूप में सीमित नमूना मात्रा में है, के साथ काम करने वाले वैज्ञानिकों के लिए, चिप-seq के प्रयोगों बहुत चुनौती दे रहे हैं। कोशिकाओं एक की एक कम राशि, 2 के साथ काम कर रहा है जब हाल के अध्ययनों से चिप seq के assays के प्रदर्शन किया जा सकता है कि पता चला है। Diagenode कोशिकाओं की एक सीमित संख्या के साथ शुरू जब पूरी तरह से चिप seq के प्रयोगों को स्वचालित कर सकते हैं कि एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली विकसित की है।
स्वचालन प्रदान करता हैचिप seq के नमूनों की पुस्तिका तैयार करने पर कई फायदे है कि यह मानव त्रुटि घटता है, के रूप में परिवर्तनशीलता को कम कर देता है, और प्रयोगात्मक लागत कम कर देता है। Chromatin immunoprecipitation और पुस्तकालय तैयारी के लिए अर्द्ध स्वचालित प्रोटोकॉल सूचना दी गई है, लेकिन कम सेल नंबर 3, 4, 5, 6 का उपयोग करते समय इन अध्ययनों से कोई डेटा से पता चला है।
इस पत्र में एक पूर्ण स्वचालित कार्यप्रवाह चुंबकीय मनका आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है और कहा कि प्रोटोकॉल अनुकूलन में एकाधिक मापदंडों पता कर सकते हैं कि एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली में chromatin immunoprecipitation और पुस्तकालय तैयारी assays के लिए दोनों में वर्णित है। यहाँ, स्वचालित चिप seq के प्रयोगों को सफलतापूर्वक, सरल बनाने के मानकीकरण, और छोटे सेल आबादी में epigenetic प्रोफाइल के अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय समाधान प्रदान करने के लक्ष्य के साथ कोशिकाओं की एक सीमित संख्या पर प्रदर्शन किया गया। इस पत्र में वर्णित स्वचालित चिप प्रोटोकॉल विशिष्ट हिस्टोन एंटीबॉडी और अभिकर्मकों बी का उपयोग कर हेला कोशिकाओं पर अनुकूलित किया गया हैकार्यप्रवाह ut प्रयोगात्मक अनुकूलन इसी के साथ अन्य सेल लाइनों और एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
अनुक्रमण द्वारा पीछा chromatin immunoprecipitation अब एक मानक प्रक्रिया है। यहाँ सामग्री शुरू करने के रूप में कुछ के रूप में 10,000 कोशिकाओं के साथ क्रोमेटिन epigenetic प्रोफाइल को उत्पन्न कर सकते हैं कि एक स्वचालित चिप seq के प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।
चिप और पुस्तकालय तैयारी assays के स्वचालित चिप अनुकूलन प्रक्रिया का मानकीकरण और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने की अनुमति देता है। यहाँ प्रस्तुत तरल हैंडलिंग प्रणाली, समय पर करने के लिए सिर्फ 30 मिनट के हाथों को कम करने के चिप के साथ जुड़े मैनुअल प्रक्रियाओं के कई समाप्त नमूना नुकसान को कम करता है, और पुस्तकालय इनपुट के बस कुछ ही picograms के साथ सटीक चिप seq के लिए सक्षम बनाता है। सफल स्वचालित चिप seq के प्रयोगों को प्राप्त करने के क्रम में, यह भी एक प्रयोग प्रणाली में उच्च गुणवत्ता sheared क्रोमेटिन तैयारी और चिप seq के ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है चुंबकीय मनका आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है और इस तरह के ऊष्मायन के रूप में मुख्य प्रयोगात्मक मापदंडों को बदलने के लिए लचीलापन प्रदान करता है एंटीबॉडी कोट के लिए समयimmunoprecipitation के चरणों या चिप-seq के अनुकूलन के लिए सभी आवश्यक प्रयोगों का संचालन करने के अनुसंधानकर्ता की इजाजत दी धोने शर्तों के संशोधन आईएनजी और। स्वचालित प्रणाली भी प्रत्येक व्यक्ति के सेल लाइन और एंटीबॉडी के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए समानांतर में कई अभिकर्मकों की तुलना की अनुमति देता है और विभिन्न प्रकार के और chromatin की सांद्रता, अलग एंटीबॉडी और चुंबकीय के भी विभिन्न प्रकार के प्रत्यक्ष तुलना में सक्षम बनाता है कि एक "खुला" मंच है मोती।
स्वचालित प्रणाली की सीमाओं में से एक 5 μl से 200 μl करने के लिए सीमा है कि खंडों में सभी प्रोटोकॉल स्वचालित की जरूरत होती है। हालांकि, इस स्वचालित मंच में प्रयोगों के miniaturization भी अभिकर्मकों में लागत बचत सक्षम बनाता है।
इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के अलावा, प्रणाली अनुकूलनीय है और भी ऐसे immunoprecipitation के एक के रूप में अन्य चुंबकीय मनका आधारित आवेदनों की एक किस्म automatesएन डी डीएनए methylated (MeDIP और MethylCap टेक्नोलॉजीज), hydroxylmethylated डीएनए (hMEDIP), अनुक्रमिक chromatin immunoprecipitation (ReChIP), आरएनए immunoprecipitation (आरएनए आईपी), bisulfite रूपांतरण की immunoprecipitation, और डीएनए शुद्धि assays के कब्जा।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT – A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.
Product Description | Company | Catalogue number | Comments |
PBS | Life technologies | 14190-094 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-100ML | |
Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | |
1,25M Glycine Solution | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Lysis Buffer iL1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Lysis Buffer iL2 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Shearing Buffer iS1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Protease Inhibitors Mix (200x) | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Life technologies | 14175-053 | |
Lysis Buffer tL1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
ChIP Buffer tC1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
ideal ChIP-seq kit | Diagneode | C01010051 | |
ChIP-Buffer H | Diagenode | C01010020 | Component of the Auto Histone ChIP-seq kit |
Auto Histone ChIP-seq kit | Diagenode | C01010020 | |
Auto True Micro ChIP kit | Diagenode | C01010130 | |
H3K79me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15310068 | |
H3K27me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410069 | |
H3K4me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410030 | |
H3K4me2 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410035 | |
H3K9ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410004 | |
H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410200 | |
H3K36me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410058 | |
H3K9me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410193 | |
Rabbit IgG | Diagenode | C15410206 | |
Protein-A coated paramagnetic beads | Diagenode | C01010020 | |
Auto IPure | Diagenode | C03010010 | |
MicroChIP DiaPure columns | Diagenode | C03040001 | |
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml | Diagenode | DMMLD2D100 | |
Quant-IT dsDNA | Invitrogen | Q32854 | |
Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA | Illumina | FC-121-3001 | |
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit | Illumina | IP-202-1012 | |
MicroPlex Library Preparation Kit | Diagenode | C05010010 | |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Illumina Library prep Quantification kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | |
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
Bioruptor Pico | Diagenode | B01060001 | |
Qubit system | Invitrogen | Q32857 | |
Illumina Hiseq systems | Illumina |