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Methodenartikel

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von Wnt5a Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

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DOI:

10.3791/52156

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2. Dezember 2014

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1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung eines möglichen Zebrafischmodells der polyzystischen Nierenerkrankung. Wir verwendeten Tg(wt1b:GFP)-Fische, um die Nierenstruktur sichtbar zu machen. Der Knockdown von wnt5a erfolgte durch Morpholino-Injektion. Die Bildung pronephrischer Zysten nach wnt5a-Knockdown wurde bei diesem GFP-transgenen Zebrafisch beobachtet.

Zusammenfassung

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der häufigsten Ursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium, eine verheerende Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Die molekularen Mechanismen, die zur Zystenbildung bei PKD führen, sind noch etwas unklar, aber es wird angenommen, dass viele Gene beteiligt sind. Wnt5a ist ein nicht-kanonisches Glykoprotein, das eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen reguliert. Wnt5a wirkt über den planaren Zellpolaritätsweg (PCP), der die orientierte Zellteilung während der renalen tubulären Zellverlängerung reguliert. Es wurde festgestellt, dass Defekte des PCP-Signalwegs die Bildung von Nierenzysten verursachen. Unsere Arbeit beschreibt eine Methode zur Entwicklung eines Modells für zystische Nierenerkrankungen im Zebrafisch durch Knockdown des wnt5a-Gens mit wnt5a-Antisense-Morpholino (MO)-Oligonukleotiden. Tg(wt1b:GFP) transgene Zebrafische wurden verwendet, um die Nierenstruktur und Nierenzysten nach dem wnt5a-Knockdown sichtbar zu machen. Es wurden zwei unterschiedliche Antisense-MOs (AUG - und Spleißstelle) verwendet, die beide zu einem Curly Tail Down-Phänotyp und zur Zystenbildung nach wnt5a-Knockdown führten. Die Injektion von Maus-Wnt5a-mRNA, die aufgrund eines Unterschieds in der primären Basenpaarstruktur resistent gegen die MOs ist, rettete den abnormalen Phänotyp und zeigte, dass der Phänotyp nicht auf "Off-Target"-Effekte des Morpholino zurückzuführen war. Diese Arbeit unterstützt die Validität der Verwendung eines Zebrafischmodells zur Untersuchung der wnt5a-Funktion in der Niere.

Einleitung

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen wurden allgemein als Modell für die Untersuchung der Nierenentwicklung und polyzystische Nierenerkrankung verwendet. Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell: Die Durchführbarkeit Studium genetischen Wechselwirkungen, die Fähigkeit, Antisense-Morpholino (MO) für die Proteinzuschlags verwenden, die Möglichkeit, schnell zu testen große Anzahl von Embryos und die Betrachtung Organ Phänotypen lebenden Larven 1. Die Vorniere ist die erste Niere bei Wirbeltieren entwickeln und ist funktional in Zebrafisch-Larven 2. Die Struktur der Zebrafisch pronephros ist relativ einfach im Vergleich zu den Säuger Metanephros, um die dritte und letzte Niere in Säugetieren zu entwickeln. Nephronanalog ist die Arbeitseinheit der Niere, wobei jede humane Nieren enthaltend zwischen 500.000-1.000.000 Nephronen 3,4 und jeder Maus Niere mit ungefähr 13.000 Nephronen 5, was es schwierig macht, einzelne Nephron Struktur beobachten in Mensch oder Maus Nieren. Der Zebrafisch besitzt nur zwei Nephronen und jedes Zebrabärbling Nephron enthält alle Hauptkomponenten im Glomerulus und Tubuli von Mäusen und Menschen und 6 ähnlich speziellen Nierenzelltypen gefunden. Im Vergleich zu anderen Wirbeltiermodellen wie Xenopus, Zebrafisch Nephron mehr ähnelt die Säuger Nephron weil es ein geschlossenes System 7 hat.

In den letzten Jahren hat sich die Zebrafisch wurde sequenziert, was die breite Einführung von genetischen Werkzeugen umfangreichen Mutanten Ressourcen und Sammlungen von transgenen Reporterlinien in Zebrafisch-Modelle. Die Zebrafisch Vorniere bildet sich zwischen 12 bis 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und kann leicht in den durchsichtigen Embryos visualisiert werden. Die Wilms-Tumor Protein WT1 ist ein wesentlicher Faktor für die Nierenentwicklung. Transgenic Zebrafischlinien grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Promotors wt1b Tg Ausdruck (wt1b: GFP) zeigen GFP expression speziell in pronephric Regionen in Zebrafischembryonen, ab 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), eine autosomal-rezessive zystischen Nierenerkrankungen, wird durch Mutationen der Gene NPHP 9 verursacht. NPHP4 durch Morpholino Knockdown verursacht Zystenbildung in der Tg (wt1b: GFP). Fisch 10 Daher ist dieser transgene Fische ein geeignetes Modell zur Beobachtung Nieren Strukturen und Zystenbildung während der Nierenentwicklung. Wichtig ist, dass der Einfluss von Modulatoren der Nierenentwicklung Verwendung dieses Stammes in einer Zeit und Arbeit effizient untersucht werden.

Unser Papier beschreibt die Verwendung von Tg (wt1b: GFP) Fisch als Vorbild zu Nierenzystenbildung nach Genmodulation visualisieren. Wir benutzten Start- und Spleißstellen Antisense-MOs um knock down der Wnt5a Gen in Zebrafisch. Wnt5a ist eine nicht-kanonische sekretierte Glykoprotein des Wnt-Familie, die in der Entwicklung von verschiedenen Organen und postnatalen zellulären eine wichtige Rolle spielt,Funktion 11. Wnt5a wirkt durch nicht-kanonischen Wnt-Signalwege, einschließlich der planaren Zellpolarität (PCP) Weg, die gefunden wurde, um eine Rolle in orientierte Zellteilung während der Nierentubuli Dehnung zu spielen. Wnt5a regelt die Wnt / PCP-Weg, indem ein Komplex mit dem Rezeptor ähnliche Tyrosinkinase (Ryk), die weiter transduziert Wnt5a Signalisierung durch Bildung eines Komplexes mit dem VANGL planaren Zellpolarität protein 2 (Vangl2), wodurch Vangl2 Stabilität 12 fördern. Defekte in der PCP-Weg kann in zufälliger Zellteilung verursachen und eine Nierenzystenbildung. Wir nutzten die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch Linie zu Nierenzystenbildung folgenden Wnt5a Zuschlags beobachten. Die Tg (wt1b: GFP) Zebrafisch-Modell ermöglicht die Live-Darstellung und zeitnahe Beobachtung der Nierenstruktur. Nach Wnt5a Zuschlags wurde Nierenzystenbildung gefunden, beginnend bei 24 HPF; bei 72 HPF, könnte Zysten in den Glomeruli und den proximalen Tubuli gefunden werden. Diese Methode könnte auch zu s verwendet werdencreen andere Gene, die Nierenzystenbildung verursachen könnten.

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Protokoll

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Zebrafisch-Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Eastern Virginia Medical School zugelassen.

1. Morpholino Vorbereitung

  1. Design und Synthese Übersetzung blockier (Aug-) und Spleiß-Hemmung (Spleiß-) Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotide für das Gen von Interesse nach Herstellerangaben (1A). Bitte lesen Sie Informationen des Herstellers, die in Tabelle 1.
    HINWEIS: MOs werden als lyophilisierte Aktien in Glasflaschen geliefert.
  2. Hinzufügen hochwertigen sterilem Wasser auf die Glasflasche zu resuspendieren MOs zu einer Endkonzentration von 25 ug / ul. Stellen Sie sicher, dass das Oligonukleotid vollständig gelöst ist. Wenn einige solide bleibt, heizen das Fläschchen mit dem Lager Oligonukleotid-Lösung bei 65 ° C für 5 bis 10 Minuten und kurz vortexen.
  3. Bewahren Sie die MO-Stammlösung bei RT. Lagern Sie diese nicht bei 4 ° C oder -20 °; C, weil geringere Temperaturen können dazu führen, die MO-Oligonukleotids an der Behälterwand zu binden. Messen Sie die Konzentration der Stammlösung mit einem Spektralphotometer jedes Mal eine neue MO-Stammlösung hergestellt wird (siehe Tabelle 1 beziehen).
  4. Bereiten Sie die MO-Arbeitslösung am Tag der Injektion durch Verdünnung der Stammlösung mit hochgradigen sterilem Wasser auf die gewünschte Dosis. Mit 0,5% Phenol-Rot zu einer Konzentration von 0,05% zu erreichen. Wenn Sie beispielsweise 5 ul Arbeitslösung mit einer Konzentration von 15 ng / nL, fügen 3 ul MO Stammlösung und 0,5 ul 0,5% Phenol-rot bis 1,5 ul Wasser.
    HINWEIS: Mit dieser Arbeitskonzentration, jeder Tropfen (500 pl) der Injektion enthält 7,5 ng MO und zwei Tropfen enthalten 15 ng von MO.

2. Herstellung der Einspritzvorrichtung

  1. Kauf Glas vorgezogen Nadeln (siehe Tabelle 1 für weitere Informationen). Alternativ ziehen Sie das Glas Injektionsnadel with eine Nadel Magnet.
  2. Schalten Sie den Kompressor und stellen Sie die Druckeinstellung auf 50 psi. Schalten Sie den Binokular-Lichtquelle und Pico Mikroeinspritzpumpe und passen Sie die Einstellungen wie folgt: Halten Druck 20 psi, werfen Druck 10 psi, Zeit-Wert von 2,5 und 100 & mgr; s Palette von Gating.
  3. Legen Sie das Glas vor, zog Nadel mit 5 ul der Injektionslösung und setzen Sie die Nadel in vertikaler Position mit der Spitze nach unten. Warten Sie, bis die gesamte Lösung der Nadelspitze ohne sichtbare Luftblasen erreicht. Setzen Sie den Nadelhalter in einer passenden Position neben dem Mikroskop und legen Sie die Glasnadel in die Halterung. Ist der Einspritzwinkel um 45 Grad.
  4. Bringen Sie die Nadelspitze in Sicht unter dem Mikroskop, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnsten Bereich der Spitze. Brechen Sie die Nadelspitze mit feinen Spitze Pinzette.
  5. Legen Sie ein Lineal und ein Rohr oder Schlauch mit Innendurchmesser von 0,15 mm nebeneinander unter dem Mikroskop;Injizieren der Lösung in ein Ende des Kapillarröhrchens einen Flüssigkeitssäule bilden. Stellen Sie die Auswurfzeit alle 17 Tropfen je 1 mm Länge Flüssigkeitssäule zu erreichen, wird das Volumen jeder Tropfen ist 1 nl (Tropfenvolumen = π x Radius 2 x Länge (der Flüssigkeitssäule) / count (Tropfen).
    HINWEIS: Ein Tropfen mit einem Durchmesser von 0,1 mm ergibt einen Injektionsvolumen von etwa 500 pl (Tropfenvolumen = 4/3 x π x Radius 3).

3. Herstellung der befruchteten Zebrafischembryonen und Injektion mit Morpholinos

  1. Transgenen Zebrafisch Zuchtpaare nach den veröffentlichten Protokollen für Standard Zebrafischhaltung und Wartung: bis Tg (GFP wt1b) ein. Sammeln Embryonen nach Naturbrut, und halten sie in einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser gefüllt (5 mM NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Starten MO Injektion sofort 13. Überwachen Embryo Morphologie unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, MO Injektion ist im Ein-Zell-Stadium, oder spätestens am Vierzellstadium.
    1. Transfer der Embryonen in einen 10-cm-Petrischale mit Agar Tröge keilförmig. Saugen Sie das zusätzliche E3 Wasser und drücken Sie vorsichtig die Embryonen in die Tröge.
    2. Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette 1-Zell-Stadium Embryos unter dem Binokular visualisieren. Durchdringen die Chorion und dann das Eigelb, ein oder zwei Tropfen MO in den Dotter (1 Tropfen = 500 pl) zu injizieren. Übertragen Sie die injizierten Embryonen zu einer 10 cm Petrischale mit E3 Wasser und Inkubation bei 28,5 ° C.
  2. Nach den Injektionen, entfernen Sie die toten Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie die E3 Wasser in der Schale alle 24 bis 48 Stunden.

4. Phänotyp Rettungsversuche

  1. Auszuwählen, die ein Ortholog von einer anderen Spezies, die eine andere primäre Basispaarstruktur (üblicherweise 3-7 Basenpaar Mismatches) aufweist und daher beständig gegen das MO, zur Rettung. Beispielsweise wird in diesem Experiment haben wir unsMaus weil die Maus Wnt5a mRNA-Sequenz unterscheidet sich von der Zebrafisch-Sequenz.
  2. Entwerfen eines Primers mit der Vorwärtsprimer beginnend beim Translationsstelle und der Reverse-Primer in der Nähe des Endes der mRNA codierende Region eingestellt. Hinzufügen eines T7-Promotorsequenz am 5'-Ende des Vorwärtsprimer-Sequenz. In diesem Experiment verwendeten wir die folgenden Primersequenzen; vorwärts: 5'-taa tac gac tca cta Tag GGA cta tga tgc tgc tga agc tga a- 3 'und umgekehrt: 5'-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3'.
  3. Durchführen einer 50 ul Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Primersatz (0,5 & mgr; M von jedem Primer) vorstehend ausgebildet und 0,1 & mgr; g Matrizen-DNA, die das Maus Wnt5a cDNA-Sequenz mit der folgenden PCR-Programm: 1 Zyklus bei 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen von 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); und abschließende Extension bei 72 ° C für 7 min.
  4. Nach Abschluss ter Zyklus ausführen 2 ul des PCR-Produkts auf 1% Agarosegel, um sicherzustellen, dass die Band die richtige Größe. Man reinige das PCR-Produkt mit einem PCR-Purification-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Überprüfen DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Speicherung des gereinigten PCR-Produkts bei -20 ° C oder direkt in verkappter RNA Transkription Verwendung im nächsten Schritt.
  5. Synthetisieren in vitro mRNA mit Cap mit einem verkappten RNA-Synthese-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie die mRNA in 20 ul RNase freies Wasser und Bestimmung der Konzentration. Aliquot der RNA und bei -80 ° C.
  6. Am Tag der Injektion, bereiten eine Arbeitslösung der mRNA mit RNase frei sterilem Wasser. Man beachte, daß 40 pg ist im allgemeinen die höchste RNA Dosis, bei der unspezifische oder toxische Wirkung des RNA treten nicht auf. Halten Sie die Arbeitslösung auf Eis. Spritzen Sie die Embryos mit MO und dann die Rettung mRNA, oder Co-spritzen beide zusammen. Wenn beispielsweise die Konzentration der mRNA prepared in Schritt 4.5 ist 0,6 ug / ul, fügen 0,67 ul mRNA (0,4 ug) bis 4,33 & mgr; l RNase-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 0,08 ug / ul zu ergeben, und ein Tropfen (500 pl) jeder Injektion enthält 40 pg mRNA. Bereiten MO, wie in Schritt 3 beschrieben.

5. Vorbereitung der injizierten Embryonen für Fluorescent Imaging

  1. Nach der Inkubation bei 28,5 ° CO / N, fügen Sie 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem E3 Wasser Melanisierung, die Beobachtung der Vorniere Struktur mittels Fluoreszenzmikroskopie wirkt verhindern. Allerdings PTU nicht vor Gastrulation abgeben, weil es die frühe embryonale Entwicklung betrifft.
  2. Bei 48 HPF, manuell dechorionate die Embryonen mit feinen Pinzette. Nehmen Sie Bilder von 48 und 72 HPF Embryonen unter einem Licht Dissektionsmikroskop.
    Hinweis: Diese Bilder sind ohne Narkose entnommen werden.
  3. Etwa 10 Minuten vor der unter dem Fluoreszenzmikroskop Bildgebung, betäuben die Embryonen, indem Sie sie in10 cm Petrischale mit 160 ug / ml gepufferte Tricaine. Warten Sie 5-10 Minuten, und dann locker am Zebrafisch zu bestätigen, dass sie sich nicht bewegen und damit die Narkose wirkt.
  4. Nachdem die Embryos betäubt werden, montieren sie in 3% Methylcellulose und orientieren sie in Bauchlage unter einem Binokular (siehe Tabelle 1).
  5. Beachten Sie die Vorniere Struktur unter einem Fluoreszenzmikroskop (siehe auch Tabelle 1) und nehmen Sie Bilder mit unterschiedlicher Vergrößerung (10X und 20X).

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Ergebnisse

Wnt5a niederschlagen wurde durch die Einführung Übersetzung blockieren MO erreicht (August-MO) oder Exon / Intron-Grenze Splice-MO (Splice-MO) auf Zebrafischembryonen an dem einen Zellstadium. Die August-MO zielt auf das Start-Codon und daher hemmt sowohl von Müttern und zygotischen Wnt5a Nachricht. Der Spleiß-MO zielt die dritte Spleißdonorstelle und hemmt nur die zygotischen Transkript Wnt5a (1A). Die Aug- und Spleiß- morphants phenocopied seitig mit mehreren Mängeln, darunter Ringel...

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Diskussion

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der führenden Ursachen für end-stage renal Krankheit beim Menschen und wird durch fortschreitende Zysten, Nieren Erweiterung und abnorme Entwicklung Röhrchen 14 aus. Autosomal dominante PKD (ADPKD) ist eine Erbkrankheit, bei der die Mutation von entweder PKD1 kodiert Polycystin-1 (PC1) oder PKD2, Polycystin-2 (PC2) kodiert, führt zu Zystennieren. Viele andere Gene, vor allem Proteine, die in der primären Zilien gefunden codiert, wird angenommen, dass bei der Entwi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die NIH (DK093625 an LH und DK069909 und DK047757 zu JHL) und die VA (Merit Award I01BX000820 zu JHL). Wir möchten Dr. Michael Pack und Dr. Jie er für die Bereitstellung wesentlicher Unterstützung danken an der Universität von Pennsylvania Zebrafisch-Core.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5% Phenol-RotSigma P0290Farbindikator für die Injektion
MorpholinoGenn Tools, LLC(kundenspezifisch)Kundenspezifisch entwickelt für das Gen von Interesse
Vorgezogene NadelTritech Research MINJ-PPWenn eine große Menge an Nadel benötigt wird, können Sie auch einen Nadelabzieher erwerben und die Nadel im Labor
vorbereiten T7 mMessage KitAmbion1344Für die In-vitro-Transkription zur Herstellung von gekapselter mRNA für das Rettungsexperiment
N-PhenylthioharnstoffSigmaP7629Zur Vorbeugung der Melanisierung
TricainSigmaA5040Auch Ethyl-3-aminobenzoat genannt, für die Anästhesie von Zebrafischen
MethylcelluloseSigmaM-0387Für die Position des Zebrafisches 
QIAquick PCR-Aufreinigungskit Qiagen28104Zur Aufreinigung von PCR-Produkten für die Kappen-RNA-Synthese.
dNTP-MischungPromegaU1511Für PCR
Tag DNA-PolymeraseInvitrogen10342-053Für PCR
NanoDrop-SpektralphotometerThermo ScientificND-1000Zur Messung der Morpholino- und RNA-Konzentration
LuftkompressorWerther International, Inc.Panther Compact 106Luftquelle für die Injektion
Pico MikroinjektionspumpeWorld Precision Instruments IncPV830 Pnematic PicoPumpAndere Arten von Mikroinjektionssystemen können verwendet werden.
MikroherstellerWorld Precision Instruments IncMMJRRechtshänder (MMJL für Linkshänder)
NadelhalterWorld Precision Instruments Inc5430-ALLZum Halten der Nadel für die Mikromanipulation
Dumont PinzetteFeine chirurgische Werkzeuge11253-20Zum Abbrechen der Nadelspitze
PräpariermikroskopLeica M205C Zur Beobachtung und Bildgebung von Zebrafischembryonen
FluoreszenzmikroskopZeiss Axio Obserer D1m  Für die Bildgebung von Zebrafisch-Pronephros
Kapillarrohr (I.D. 0,15 mm)VitroComCV1525Q-100Zur Messung des Volumens jedes injizierten Tropfens

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Wnt5a KnockdownMorpholino InjektionTg wt1b GFP transgenFluoreszenzmikroskopieRescue ExperimentMaus Wnt5a mRNAZystenbildungNierenstruktur
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