Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Zusammenfassung

Mit lentiviralen basierte Umprogrammierung Methoden kann Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) erzeugt werden. Jedoch Spuren von potenziell onkogenen Gene in aktiv transkribierten Regionen des Genoms übrigen, die ihr Potenzial für den Einsatz in menschlichen therapeutischen Anwendungen ^ein. Darüber hinaus nicht-menschlichen Antigene aus Stammzellen Neuprogrammierung oder Differenzierung in therapeutisch relevanten Derivate abgeleitet ausschließen diese hiPSCs können, in den menschlichen klinischen Kontext ² verwendet. In diesem Video stellen wir ein Verfahren zur Umprogrammierung und Analyse von Faktor freie hiPSCs frei von exogenen Transgenen. Diese hiPSCs kann dann für die Genexpression Abnormalitäten im spezifischen Introns enthaltend das Lentivirus analysiert werden. Diese Analyse kann mit empfindlichen quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Vorteil gegenüber weniger empfindlich Techniken bisher verwendet, um die Genexpression Differenzen ³ zu erkennen ist durchgeführt werden. Vollständige Umwandlung inklinischem guten Herstellungspraxis (GMP) Bedingungen, können die menschliche klinische Relevanz. Unser Protokoll bietet eine weitere Methode, sofern die aktuellen Safe-Harbour-Kriterien zu erweitern und umfassen Faktor freie dadurch gekennzeichnet hiPSC basierten Derivaten für den menschlichen therapeutischen Anwendungen zur Ableitung-GMP-grade hiPSCs, die keine Immunogenität Risiko durch nicht-menschlichen Antigene zu eliminieren sollte. Dieses Protokoll ist breit anwendbar auf lentiviralen umgewandelten Zellen jeglicher Art und stellt eine reproduzierbare Methode zur Umwandlung umgewandelten Zellen in GMP-grade Bedingungen.

Einleitung

Adulte menschliche Zellen haben gezeigt, dass sie in der Lage sind, epigenetische Remodellierung und Reprogrammierung zu durchlaufen, als Ergebnis der lentiviralen basierten Expression von vier Schlüsseltranskriptionsfaktoren^4,5. Ein wichtiger Fortschritt auf dem Gebiet der Reprogrammierung war die Verwendung einer einzigen excisablen lentiviralen Stammzellkassette (STEMCCA), die alle vier Reprogrammierungstranskriptionsfaktoren enthielt, die ein präzises stöchiometrisches Verhältnis der Proteinexpression ermöglichten⁶. Darüber hinaus kann STEMCCA, wenn es in einer bestimmten Vielzahl von Infektionsbereichen transduziert wird, während des Reprogrammierungsprozesses zu überwiegend einzelnen genomischen Integrationsereignissen führen⁷. Die Einführung einer exzizierbaren Version von STEMCCA, die die Cre/loxP-Technologie verwendet, gefolgt von der Exzision des Reprogrammierungsvektors nach der Derivation der Stammzelllinie, ermöglichte die Gewinnung faktorfreier humaner induzierter pluripotenter Stammzelllinien (hiPSC)⁸. Darüber hinaus musste zur Verbesserung der therapeutischen Anwendungen von hiPS-Zellen eine neuartige, schnelle und leicht anwendbare Methodik für die Umwandlung von Zelllinien in GMP-Qualität (Good Manufacturing Practice) von xeno-haltigen zu xeno-freien Bedingungen implementiert werden. Hier diskutieren wir eine relevante Methodik, die Unterschiede in der integrierten Genexpression, insbesondere bei der Integration in ein Intron, und die Umwandlung von Zellen in klinischer Qualität in mutmaßliche GMP-Bedingungen genauer bewertet.

Frühere Forschungen haben nur relativ unempfindliche Microarray-Transkriptionsanalysen verwendet, um Genexpressionsunterschiede in integrierten Genen nach STEMCCA-Transduktion^{zu analysieren 3,9}. Hier stellen wir die Methodik der sensitiven quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse vor, um integrierte Genexpressionsunterschiede weiter zu untersuchen. Wichtig ist, dass die derzeitigen Safe-Harbor-Kriterien hiPSCs mit Genen mit viraler Integration verwerfen, wodurch die Anwendbarkeit dieser Zellen für nachgelagerte humane zelluläre Therapeutika eingeschränkt^{wird 9}. Wir schlagen vor, dass sich der Status quo durch die Verwendung von vollständig charakterisierten und transgenfreien intronikal reprogrammierten hiPSCs ändern könnte. Darüber hinaus stellen wir ein robustes Zellkonversionsprotokoll in GMP-Qualität vor, das problemlos auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen angewendet werden kann, die ursprünglich unter xeno-haltigen Bedingungen gewonnen wurden¹⁰. Dies bietet erhebliche Möglichkeiten für die Entwicklung zukünftiger Zellreprogrammierungsexperimente, die klinische Bedingungen erfordern, um die therapeutische Relevanz für den Menschen zu erhalten.

Diese Methoden bieten eine Grundlage, auf der die aktuellen Safe-Harbor-Kriterien erweitert werden können, um charakterisierte STEMCCA-reprogrammierte hiPSC-Linien einzuschließen, die nach der STEMCCA-Exzision aus dem integrierten Intron ein normales Genexpressionsprofil beibehalten. Außerdem wird die vollständige Umwandlung in klinische Bedingungen, die frei von nicht-menschlichen tierischen Antigenen sind, dazu beitragen, viel mehr Zelltypen zu integrieren, die bisher nur unter Xeno-haltigen Bedingungen reprogrammiert und charakterisiert wurden. Diese Methoden zusammen sind für die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) ein überzeugender Grund, eine Ausweitung ihrer eingeschränkten Zulassung von humanen embryonalen Stammzellen (ESC)-basierten Therapeutika auf hiPSC-basierte Therapeutika in Betracht zu ziehen¹¹.

Wir haben kürzlich die Ableitung einer faktorfreien hiPSC-Linie detailliert beschrieben, die vollständig charakterisiert und in mutmaßliche klinische Bedingungen umgewandelt wurde¹⁰. Hier beschreiben wir das Protokoll für die hiPSC-Ableitung unter Verwendung des STEMCCA-Lentivirus. Diese Stammzellen durchlaufen dann einen Exzisionsprozess, gefolgt von einer Charakterisierung der Genexpression. Schließlich werden die hiPSCs durch eine langsame Umwandlungsmethode in GMP-Qualität überführt.

Protokoll

. HINWEIS: Diese Methode wurde in der Forschung im Awe et al berichteten ¹⁰ verwendet.

1. Reprogrammierung Erwachsene menschliche Fibroblasten der Haut mit STEMCCA

1. Thaw Erwachsenen dermalen Fibroblasten (HUFS), Durchgang 4 oder niedriger, in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten, dabei nicht an die Spitze der Ampulle mit Wasser tauchen.
2. Legen Sie die 1-ml Aufschlämmung von menschlichen Fibroblasten in einen 15-ml-Erlen Fläschchen und langsam setzen 4 ml Standard HUF Medien, auf 37 ° C vorgewärmt, in einem tropfenweise Mode, zu verdünnen aus Dimethylsulfoxid (DMSO) und resuspendieren Zellen.
3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere Zellen in einem ausreichenden Volumen an Medium, um eine Suspension von 100.000 Zellen / ml zu erstellen und dann 2 ml in ein Well einer Sechs-Well-Platte für 20 Minuten mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet.
   HINWEIS: Eine Schwester auch mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Zeile und Zustand muss fo ausgesät werdenr die Zellzählung / Multiplizität der Infektion (MOI) Berechnung.
4. Rock the Platte hin und her und hin und her, um gleichmäßige Verteilung der Zellen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
5. Am Tag der Weiterleitung erhalten Zellzahl (n) von der Schwester gut (e) etwa 24 Stunden nach der ersten HUF Beschichtung.
6. Auftauen 2 x 10 ⁸ TU, oder gleichwertig, lentiviralen Konzentrat (STEMCCA) und mit Wasser auf 1 x 10 ⁸ TU / ml in HUF Medien.
7. Transduzieren Zellen bei einer 10-MOI-Verhältnis in HUF Medien mit 8 ug / ml Transfektionsagens ergänzt. Mischungs transduziert Vertiefungen gleichmäßig beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
8. Etwa 24 Stunden nach lentivirale Transduktion, schalten Sie das HUF Medien Standard humanen pluripotenten Stammzellen (PSC) Medium.
9. An den Tagen 2 bis 6, ändern Medien täglich mit menschlichen PSC Medium.
10. An Tag 6 der Platte zwei 0,2% Gelatine beschichteten 10-cm-Platten von1,5 bis 1,75 x 10 ⁶ MEFs ab CF1-Mäuse in HUF Medien ¹² abgeleitet.
11. Am Tag 7, darauf achtend, nicht mehr als 100 × g, Gebrauch Raumtemperatur Trypsin zentrifugieren, um von einem Brunnen der sechs-Well-Platte und Durchgang heben Sie den Tag ab 7 umprogrammiert Fibroblasten in einer 1.16-Verhältnis, durch Plattierung alle Zellen gleichmäßig auf zwei 10-cm-Platten, die mit frischen menschlichen PSC Medien, die am Vortag mit MEFs vergoldet wurden. Verteilen Zellaggregate im Uhrzeigersinn Spiralbewegung und in eine 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator über Nacht.
12. Etwa 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen auf neu programmiert MEFs und jeden Tag danach, ändern Sie verbrachte menschlichen PSC Medien durch frische Medien.
13. Nach 3 bis 4 Wochen, nehmen einzelne Kolonien mit typischer ESC artige Morphologie mit einer 21-Gauge-Nadel und Subklonierung in eine 24-Well-Platte durch Einbringen von etwa 8 bis 10 Einzelteile der spezifischen Kolonien in einzelne Vertiefungen in einer 0,2% Gelatine beschichtete 24-Well-Platte Vorimpfteilchened mit MEFs ab CF1-Mäuse in der menschlichen PSC Medium abgeleitet.
    HINWEIS: Nach dem Ausbau des gepickten Kolonien haben die Kolonien als pluripotent von Embryoidkörperbildung und Expressionsanalyse von Pluripotenzmarker auf Proteinebene charakterisiert werden.

2. Vektor-Integration Standortanalyse und STEMCCA Excision

1. Analysieren Sie den STEMCCA Integrationsstelle von nicht einschränkenden lineare Verstärkung PCR wie beschrieben ^10.
2. Nach Untersuchung auf eine Integration in einen gewünschten Bereich des Genoms, Verbrauch STEMCCA durch Absaugen von der alten menschlichen ESC Medium zu gewährleisten. Dann kombinieren 45 ul konzentrierter Adeno-Cre-PuroR Virus mit 8 ug / ml Transfektionsmittel in 3 ml Standard PSC Medien für 24 Stunden.
3. Nach der 24-stündigen Inkubationszeit, absaugen des gemischten Virusüberstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit menschlichen PSC Medien. Platzieren frischen menschlichen PSC Medien zusammen mit 2 & mgr; g / ml Puromycin für einen Zeitraum von 5 Tagen, wenn der Medien täglichen with frisches Medium und Antibiotikum.
4. Nach 5 Tagen Subklon verbleibenden Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel auf 0,2% Gelatine beschichtete Vertiefungen in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit MEFs aus CF1mice abgeleitet vorbeschichtet und erweitern, wie oben beschrieben.
   HINWEIS: Nach ausreichender Expansion eine gefrorene Lager zu erhalten, wird die Umwandlung in Feeder-freien Bedingungen erforderlich. Erwarten mindestens 95% der Stammzellkolonie Tod, da die meisten Zellen nicht erfolgreich transduziert werden und wird Antibiotikum über den Zeitraum von 5 Tagen Inkubation erliegen. Obwohl Adeno-Cre-PuroR integriert an einer 0,001 bis 1% Wirkungsgrad in Wirtschromosomen von infizierten Zellen, reexposing eine Stichprobe von Faktor freie Kolonien Puromycin 100% Zelltod zu gewährleisten wird bestätigen, keine Integration hat ¹³ aufgetreten.
5. Auftauen eines Fläschchens vorge aliquotierten Basalmembranmatrix auf Eis über einen Zeitraum von ca. 2 h (Empfehlungen des Herstellers), bis die Matrix eine Flüssigkeit und verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 1:30 in kaltem Basalmedium. Coauf gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer Sechs-Well-Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
6. Gitterschnitt (mit einer 18-Gauge-Nadel oder ein Glas oder Kunststoff "tip") mindestens 20 bis 30 Kolonien, die von einem gut vorher mit MEFs beschichtet. Achten Sie darauf, zu reduzieren MEF erhebend und übertragen von der Platte.
   1. Generieren Sie die Schraffur-Gerät durch eine Reihe verschiedener Ansätze, von der komplizierter Heizung, ziehen, und Veredelung von Glas Pasteurpipette in offene Flamme, die einfache Verwendung einer sterilen Kunststoffpipettenspitze oder, wie in unserem Fall, 21- und / oder 18-Gauge-Nadeln.
7. Saugen Sie die Matrix aus dem beschichteten auch nach der Inkubation.
8. Stücke der Kolonien zu entfernen durch vorsichtiges Abschaben von der alten Platte mit einem 200-ul-Pipette und vorsichtig in 3 ml frischem kombinierten Medien 1 in der Matrix beschichtete Platte zu platzieren. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator. Medienwechsel 48 h nach der Passage.
9. Extrahieren genomischer DNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs, bei mehr als 80% Konfluenz, mit kommerziellen DNA-Extraktion-Kits.
10. Analysieren Sie für die richtige Exzision mit für exogene Integrationen des STEMCCA Lentivirus Primer: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-Rückwärts, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer mit PCR-grade Wasser zu einer 10-uM Stammlösung.
11. Führen Sie einen PCR mit den folgenden fünfstufigen Protokoll: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von jeweils der folgenden: Denaturierung bei 98 ° C für 20 sec, Primer-Annealing bei 62 ° C für 15 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 15 sec; gefolgt von einem einzigen Zyklus abschließenden Extension bei 72 ° C für 3 min.
12. Machen Sie eine 3% Agarosegel durch Auswiegen 1,5 Gramm Agarose und stellen Sie es in 50 ml 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer. Mikrowelle bis Agarose aufgelöst und in DNA-Gel-Färbung bei pRoper Verdünnung mischen und verzichten richtige Volumen in Gelkassette für 1 Stunde bei Raumtemperatur verfestigen.
13. Last 12 ul PCR-Produkt mit 3 & mgr; l Ladepuffer gemischt und zu einer 3% igen Agarose-Gel. Führen Sie das Gel für 30 min bei 80 V.
14. Visualisieren Sie mit UV-Licht für die Abwesenheit einer Bande, die richtige Entfernung.

3. Die Quantifizierung der Genexpression Unterschiede mithilfe von Quantitative PCR von Pre- und Post-geschnitten hiPSCs

1. Auszug Gesamt-RNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs mit Hilfe von kommerziellen RNA-Extraktion-Kits.
2. Reverse Transkription und bis zu 1 ug Gesamt-RNA von mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden verankerten Oligo (dT) ₁₈ und Random Hexamer Primer.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PCR-Protokoll ist für die Gen-Transkripte von mehr als oder weniger als 4 kb zugeschnitten. Spezifische Primer müssen jedoch für alle Gen STEMCCA ursprünglich integriert i gemacht werdennto.
3. Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Primer PCR-grade Wasser zu einer 20 uM Stammlösung.
4. Verwenden Sie 5 ng der Probe pro 20 ul Reaktion, die von 10 uM UPL Sonde besteht, 2x LightCycler® 480 Probes Meister, und 20 & mgr; M Vorwärts- und Rückwärtsprimer.

4. Umwandlung in GMP-grade Bedingungen

1. Am ersten Tag der Umstellung der Post-geschnitten hiPSCs über den GMP-Grade-Bedingungen, machen eine Mischung aus Medien, die aus menschlichen PSC kombiniert Medien 1 (kombinierte Medien 1) und klinischer Qualität der guten Herstellungspraxis (GMP) kompatible Medien (kombinierte Medien 2 ) in einem Verhältnis von 80:20.
2. Absaugen der alten kombinierten Medien ein und legen Sie 3 ml der neuen kombinierten Medien 1 und 2 vorgewärmten, im Verhältnis von 80:20. Medien ändern sich täglich für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
3. Am Tag 4, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 50:50. Absaugen des alten Mediums und replace mit vorgewärmtem Medium, mit den zusammengeführten Medien 1 und 2 im Verhältnis 50:50. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
4. Am Tag 7, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 20:80. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmten Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 20:80 Verhältnis. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
5. Am Tag 10, stellen die kombinierten Medien 1 und 2 zu einem 0: 100 Verhältnis. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmter Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 0: 100 Verhältnis. Ändern Medien jeden Tag an diesem bestimmten Verhältnis. Die Zellen sind nun in vollständig definiert Xeno-freien Medien. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
   HINWEIS: Während dieser gesamten Umwandlungsprozess wird Routine Passagieren mit einer 18-Gauge-Nadel für eine einwandfreie Kolonie Größe und Dichte zu erhalten. Plan für passaging Zellen alle 4 bis 5 Tage auf der Grundlage der Koloniegröße, Konfluenz und Differenzierung.
6. Coat eine Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit einer definierten xeno freien Substrat, wie vom Hersteller empfohlen.
7. Mechanisch Gang ein konfluenter gut, bereits umgewandelt Xeno freien Medien Bedingungen, von einem Sechs-Well-Platte mit einer 18-Gauge-Nadel. Wichtig ist, legen Sie die neuen Medien (kombinierte Medien 2) auf die Zellen mit 1x ROCK-Hemmer für 1 Stunde, bevor Passage vor, eine Bedingung die Medien.
8. Saugen Sie das synthetische Substrat-Lösung aus der neuen Platte, dass die Zellen, die sich zu übergeben. Entfernen Sie alle Medien, die die Stammzellklumpen von der alten Platte und Transfer zum neuen Platte.
9. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator für 2 Tage bei minimalem physische Störungen (idealerweise Platten, einmal im Inneren Inkubator nicht direkt in keiner Weise berührt), um maximale Befestigung ermöglichen.
   HINWEIS: Die Zellen werden täglich Medien Änderungen erfordern. Kontinuierliche passaging alle 4 Tage wird wichtig sein. Mit einer 21-Gauge-Nadel, Durchgang nur die Teile der Kolonien mit optimalen ESC-ähnliche Morphologie (Hoch nukleozytoplasmatischen Verhältnis). Dies wird für die richtige Auswahl hiPSC Kolonien, die gut wachsen wird und schließlich ergeben homogene Kolonien zu gewährleisten. Insgesamt Zeit, Ableitung von ESC artige Kolonien zwischen 15-20 Tage nach der ersten kombinierten Medienwechsel.
10. Frieren Sie sich die GMP-Grade postgeschnitten hiPSCs vom ersten Gitterschnitt all der Kolonien mit Hilfe eines 18-Gauge-Nadel. Nehmen Sie alle Teile aus mit Hilfe eines 200 ul Pipette und übertragen alle Medien mit den Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
11. Während die Zellen zentrifugiert, einen Gefriermedien, bestehend aus gleichen Volumen kalter kombinierten Medien 2 und Gefriermediums mit einer DMSO-Endkonzentration von 7,5%.
12. Nachdem die Zellen pelletiert, absaugen alte Medium und tropfenweise resuspendieren Sie das Pellet mit den gefrierenden Medien. Unmittelbar transfer zu Einfrierröhrchen und in einem -80 ° C Gefrierschrank gelegt.

5. Charakterisierung GMP-Grade-Post-geschnitten hiPSCs

1. Um eine korrekte Ausdruck Pluripotenzmarker nach Umwandlung zu gewährleisten, verwenden QPCR um die Expression von Schlüssel Pluripotenzmarker (SOX2, OCT4 und NANOG) unter Verwendung der in Tabelle 1 mit den gleichen Schritten aufgeführten Primer quantifizieren wie in Schritt 3 QPCR Methoden erwähnt folgen der gleichen Schritte wie in Schritt 3 aufgeführt.
2. Verwendung der Durchflusszytometrie, um die nicht-menschlichen Sialinsäure Neu5Gc (N -glycolylneuraminic Säure) in Übereinstimmung mit in dem Kit enthalten sind, wie zuvor veröffentlicht am ^10. Standardbedingungen zu erfassen.
3. Wäsche leicht die Zellkulturplatten mit Zellen unter Verwendung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
4. Distanzieren Kolonien durch Verwendung 1x Dissoziation Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur.
5. Während der 5-min Inkubationszeit von Schritt 5.4, bereiten Sie die Blockierungslösung (in bereitgestelltKit), indem sie eine 0,5% Blockierungsmittel in eiskaltem PBS.
6. Beschriften Sie den folgenden Satz von Rohren für die Durchflusszytometrie-Analyse: Ungefärbte; 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) DAPI; Kontroll-Antikörper 1: 200; Primärer Antikörper 1: 200; Sekundäre Antikörper 1: 200 Esel Anti-Huhn-IgG (H + L); Beispiel MEFs; Beispielpostgeschnitten Zellen auf Matrix; und Sample Postgeschnitten Zellen auf synthetische Substrat.
7. Sanft verdrängen Zellaggregate von Schritt 5.4 durch Zugabe von 2 ml Blockierungslösung und Transfer Inhalt in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 80 × g für 5 min bei 4 ° C.
8. Mit Blockierlösung und zentrifugiert wie in Schritt 5.7 fest Waschen Sie die Zellen zweimal.
9. Vorsichtig resuspendieren etwa 1 x 10 ⁶ Zellen in 100 & mgr; l Blockierlösung mit dem entsprechenden Verdünnungsvolumen von jedem Antikörper. Inkubiere unter leichtem Schütteln bei 4 ° C für 1 Stunde.
10. Wiederholen wäscht dreimal wie in Schritt 5.8.
11. Resuspendieren das Zellpellet in 400 ul Verdünnungspuffer Buffer (aus Kit) mit 1: 100 von DAPI für Rohre 2, 6, 7 und 8 wie unter Punkt 5.6 aufgeführt.
12. Stamm Zellen durch ein 40 & mgr; M Sieb und Durchfluss-Zytometer laufen.

Ergebnisse

Wir präsentieren ein Protokoll zur Ableitung klinischem Faktor freie hiPSCs mit der STEMCCA lentiviralen basierte Umprogrammierung. 1A zeigt ein repräsentatives Bild der drei vorgeschnitten hiPSC Linien nach Neuprogrammierung mit dem STEMCCA Ansatz auf einer Schicht aus MEFs. Der Hauptvorteil der STEMCCA Umprogrammierung Ansatzes liegt in der konsequenten Neuprogrammierung Erfolg von mehreren Wissenschaftlern erreicht, in verschiedenen Forschungsgruppen und Standorte. 1B stellt die Post...

Diskussion

Wir beschreiben eine Methode zur Ableitung Faktor freie hiPSCs und macht sie durch die Umwandlung dieser Zellen in GMP-grade Bedingungen für Downstream-Zelldifferenzierung in Zukunft Humantherapeutika klinisch relevant. Obwohl dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Zelltypen, wählten wir humane dermale Fibroblasten umprogrammieren, aufgrund der Einfachheit der Entnahme aus dem Patienten und ihre Anwendbarkeit auf personalisierten menschliche Therapeutika. Sobald Einschränkungen soweit vollständig...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Medien und Reagenzien
DMEM/F12 (Basalmedium)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fötales Rinderserum	Invitrogen	16000044
Minimum essentielles Medium (MEM) nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, Penicillin-Streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Auftauen bei 4 > C, aliquotieren und bei &minus lagern; 20 &Grad; C
Knockout-Serumersatz	Invitrogen	10828028	Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquotieren und bei &minus lagern; 20 &Grad; C
Trypsin/EDTA, 0,5 %	Invitrogen	15400-054	Verdünnen Sie den Rohbestand auf 0,05 % in 1x PBS
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Rekonstitution zu 10 &; Mikro; g/ml Bestand an 0,1 % Rinderserumalbumin, gelöst in 1x PBS und gelagert bei − 80°; C
β-Mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (Basalmembranmatrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Verdünnen Sie das Matrigel-Fläschchen mit 10 ml DMEM/F12 auf Eis für eine 1:2-Verdünnung. Aliquotieren und speichern bei − 20 °C.
CELLstart (Synthetisches Substrat)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Sonden Master	Roche (Basel, Schweiz)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/Gefriermedium	Lonza (Basel, Schweiz)	12-769E
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatine, aus Schweinehaut	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Zu 0,2 % PBS lagern, autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Supplement 5x mit dem Basismedium kombinieren, aliquotieren und bei 4 ° lagern; C für bis zu 2 Wochen.
Stemedia NutriStem XF/FF Nährmedium	Stemgent	05-100-1A	Auftauen bei 4 > C O/N, aliquot und bei 4 μg lagern; C für bis zu 2 Wochen.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissoziationsreagenz)	Invitrogen	A1110501
Esel Anti-Hühner-IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/Transfektionsmittel	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-Well-Platten	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-Well-Platten	VWR	29442-042
10-cm-Platten	Sigma-Aldrich	Z688819
18-Gauge-Nadel	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-Gauge-Nadel	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Durchflusszytometer	KSystem von Nikon (Tokio, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transkriptor Erststrang cDNA Synthese Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Kombinierte Medien 1	StemCell Technologies und Stemgent		besteht zu gleichen Teilen aus mTeSR1 und Nutristem
Kombinierte Medien 2	StemCell Technologies und Stemgent		bestehen zu gleichen Teilen aus TeSR2 und Nutristem
HUF Medium			Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium/F12 [DMEM/F12] ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Glutamax und 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12, ergänzt mit 20 % Knockout-Serumersatz, 1x Glutamax, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Primocin, 1x β-Mercaptoethanol und 10 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor.
DMEM/F12, Dulbecco' s modifizierter Eagle" s mittel/F12; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung.