Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

14.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/52179

⸱

12. Januar 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, 2The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle, die eine flexible und strategische Grundlage für die virale Manipulation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bieten, um interessante Proteine zu überexprimieren, um ihre Rolle in Oligodendrozyten spezifisch über das in vitro-Modell der Myelinisierung des Zentralnervensystems zu untersuchen.

Zusammenfassung

Myelinisierung ist ein komplexer Prozess, der beide Neuronen und das Myelin bilden Gliazellen umfasst, Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Wir verwenden ein in vitro Assay Myelinisierung, ein etabliertes Modell für die Untersuchung CNS Myelinisierung in vitro. Um dies zu tun, werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC), um die gereinigte primäre Nager dorsalen Wurzelganglien (DRG) Neuronen hinzugefügt myelinisierenden Kokulturen bilden. Um spezifisch zu verhören, die Rollen, die bestimmte Proteine, die von Oligodendrozyten exprimiert auf Myelinisierung auszuüben haben wir Protokolle, die selektiv zu transduzieren OPCs mit dem Lentivirus überexprimieren Wildtyp, konstitutiv aktiv oder dominant negative Proteine, bevor sie auf die DRG-Neuronen ausgesät entwickelt. So können wir gezielt befragen die Rolle dieser Proteine ​​bei der Regulierung oligodendroglialen Myelinisierung. Die Protokolle können auch bei der Untersuchung von ot aufgetragen werdenihren Zelltypen und bietet somit einen Ansatz, der selektiven Manipulation von Proteinen durch einen gewünschten Zelltyp exprimiert wird, wie beispielsweise Oligodendrozyten, für die gezielte Untersuchung von Signalisierungs- und Kompensationsmechanismen ermöglicht. Zusammenfassend, die Kombination der In-vitro-Assays mit Myelinisierung lentiviralen infiziert OPCs eine strategisches Instrument für die Analyse der molekularen Mechanismen in Myelinisierung beteiligt.

Einleitung

Myelinisierung von Axonen ist entscheidend für die schnelle und effiziente Übertragung von Aktionspotentialen in den beiden zentralen und peripheren Nervensystemen. Spezialisierte Zellen, Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem und Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem, Wrap-around und ensheathe Axone im Myelin, effektiv Isolierung der Nerven und saltatorische Erregungsleitung 1 zu erleichtern. Der Prozess der Myelinisierung in vitro unter Verwendung von retinalen Ganglienneuronen 2, konstruiert Nanofasern 3 oder Dorsalwurzelganglionneuronen cokultiviert entweder mit Schwannschen Zellen 4 oder Oligodendrozyten 5-7 untersucht werden. Die In-vitro-Assay Myelinisierung ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Nervensystems Myelinisierung und viele der grundlegenden Prozesse, die während der Myelinisierung in vivo 8.5 auftreten repliziert. Der Test beinhaltet die Co-Kultur von gereinigten Populationen von Spinalganglion (DRG) Neuronen, mit OPC (für C-NS Myelinisierung) oder Schwann-Zellen (für PNS Myelinisierung). Unter bestimmten Bedingungen sind diese Zellen myelinisierenden ensheathe DRG Axone im befahl, ultra strukturell überprüft, multilamellaren Folie aus isolierendem Plasmamembran, die die gleiche Ergänzung von Myelin in vivo vorhanden spezifische Proteine ​​zu exprimieren.

Das am häufigsten verwendete Zellmodell zu studieren CNS Myelinisierung in vitro ist die Co-Kulturen von DRG-Neuronen und OPCs, die erfolgreich verwendet wurden, um den Effekt, dass exogene Faktoren wie Neurotrophine auszuüben auf CNS Myelinisierung in vitro 5,6 studieren. Exogene Faktoren, wie Wachstumsfaktoren oder kleines Molekül pharmakologische Inhibitoren wurde weithin verwendet, um die Rolle von Signalwegen in der Myelinisierung mit der DRG-OPC Kokulturmodell 7,9 studieren. Jedoch in den Misch Kokultur Einstellungen, die sowohl die Neuronen und Oligodendrozyten enthalten, formell möglich blieb, daß entweder die Wachstumsfaktoren oder die pharmacological Inhibitoren könnte Auswirkungen auf sowohl die DRG-Neuronen und Oligodendrozyten (OL) ausgeübt haben. Hier bietet sich die Möglichkeit, gezielt zu sezieren die Rolle, dass die Proteine ​​nur durch DRGs ausdrücklich oder Oligodendroglia übt auf die Myelinisierung mit dieser Zwei-Zellen-System. Um zweifelsfrei bestätigen, dass der Signalweg in oligodendroglialen Myelinisierung, lentivirale Transduktion OPCs vor auf DRG-Neuronen für die In-vitro-Assays Myelinisierung Aussaat, hat sich eine elegante Möglichkeit, sowohl Wildtyp und mutierten Proteine ​​überexprimiert werden, aber auch direkt reguliert als Zuschlags Ausdruck konstitutiv exprimierten Proteine, die von Oligodendrozyten. Damit bietet dieser Ansatz einen Weg, um gezielt abzufragen und zu manipulieren Signalwege innerhalb Oligodendrozyten zum Studium Myelinisierung 9,10.

In diesem Papier Methoden, die wir selektiv in Oligodendrozyten über einen lentiviralen wurden entwickelt, um ein Protein von Interesse überexprimiert berichten wirAnsatz für das Studium Myelinisierung in vitro. Die Technik beginnt mit der Erzeugung von Expressionsvektoren, die das Gen von Interesse enthält, sei es in einem Wildtyp, konstitutiv aktiven oder dominant negative Form, die dann anschließend in der pENTR Vektor (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) kloniert werden. Dieser Vektor (der das Gen von Interesse), sind der CMV-Promotor-Donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) und das 2K7 lentivector in einer Enzymreaktion kombiniert, um eine 2K7 Vektor, CMV-Promotor, das Gen von Interesse, ein produzieren interne Ribosomenbindungsstelle und GFP (Abbildung 1). Diese Gateway-geklonten 2K7 Konstrukt kombiniert mit der PMD2.G Virushülle und dem pBR8.91 Virus-Paket kann in HEK293T-Zellen cotransfiziert, um Lentiviren, die später verwendet werden, um OPCs transduzieren erzeugen. Einmal mit dem Lentivirus infiziert die OPCs Ausdruck ein hohes Maß an das Protein von Interesse. Diese OPC kann dann auf DRG Neuronenkulturen ausgesät werden und die Wirkung, dass die Expressionvon hohen Niveaus des gewünschten Proteins übt auf die Myelinisierung abgefragt werden. Die Co-Kulturen werden auf Myelin-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse untersucht und für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Immunzytochemie visualisiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tieren für die Studie verwendet wurden, waren gemischten Geschlechts und aufgewachsen in der Tierhaltung von der Abteilung für Anatomie und Pathologie und der Florey Institut für Neurowissenschaften und Mental Health Research an der Universität von Melbourne. Alle tierischen Verfahren wurden von Tierversuchen Ethikkommissionen an der Universität von Melbourne zugelassen.

1. Klonierung 2K7 Lentivector

  1. Bevor die Klonierung des Gens von Interesse in das 2K7 lentiviralen Vektor, Subklonierung des Gens in der pENTR Vektors (3637 bp, Kanamycin-resistent) unter Verwendung von Standardtechniken Molekular 11. Verwenden Sie die EcoRI und SacII Restriktionsstellen für die Subklonierung.
  2. Verstärkung des 2K7 Lentivector
    1. Trans 2K7 lentivector DNA durch vorsichtiges Mischen von 100 ng Plasmid-DNA mit kompetenten Zellen und Inkubation auf Eis für 30 min.
    2. Hitzeschock-DNA / kompetenten Zellen mischen, auf 42 ° C für 90 sec und der Platte diese auf LB-Agar-Platten, die sowohl ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (15 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 Std.
      HINWEIS: Chloramphenicol verwendet wird, um die Rekombination zwischen den langen terminalen Wiederholungen zu vermeiden.
    3. Am nächsten Tag in LB-Medien, die sowohl Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (15 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 h ausgewählten Bakterienklone wachsen. Extrahieren Sie die DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA Maxiprep Kit gemäß Herstellerangaben.
  3. Subklonieren von pENTR Vektor 2K7 Lentivector (Abbildung 1)
    figure-protocol-1
    Abb. 1: Schematische Darstellung der Rekombination Gateway Das Gen von Interesse, das hier als Flag-Erk1 dargestellt wird, wird in die pENTR L1-L2-Vektor kloniert. Dies wird auf die pENTR L4-R1 Vektor, der die CMV-Promotor und das Rückgrat 2K7 Vektor addiert. Diese drei Vektoren werden durch die LR Clonase II Plus Enzym rekombinierteinzufügen, die das Gen von Interesse und den Promotor in das Virus-ready 2K7 Vektor.
    1. Fügen Sie den folgenden in ein 1,5-ml-Tube und vorsichtig mischen:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (Promotor) (60 BNG) von 1 bis 2,5 & mgr;
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (mit Gen von Interesse) (80 BNG) von 1 bis 2,5 & mgr;
      K7 lentivector (80 ng / ul) 1 ul
      TE-Puffer, pH 82-5 ul
      Insgesamt 8 & mgr;
    2. Entfernen Clonase Enzymmischung von -80 ° C und Auftauen auf Eis für 2 min. Sicherzustellen, dass dieses Enzym ein frisches Aliquot von -80 ° C, wie das Enzym wesentlich reduziert Klonierungseffizienz bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen
    3. Add 2 ul Enzym pro Reaktion und gut mischen über Wirbel und inkubieren Sie die Clonase Reaktionsmischung bei 23-25 ​​° C für 6-24 Stunden.
    4. 1 & mgr; l Proteinase K-Lösung (mit Enzym Satzes) zur Clonase Reaktionsgemisch und Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
    5. Trans Clonase Reaktionsgemisch in kompetente Zellen und wachsen die AuswahlKolonien in LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) bei 37 ° C für 16-18 Std.
    6. Extrahieren und zu reinigen DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA-Miniprep-Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
    7. Bestätigen die DNA mittels Verdauung mit den Restriktionsenzymen Spe I und Sac II und eines geeigneten Puffers nach den Anweisungen des Herstellers, um das Fragment, das den Promotor und das Gen von Interesse zu entfernen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um zu überprüfen, ob die DNA subkloniert den richtigen Einsatz Gen von Interesse mit der rechten Vektorgerüst. Die Größe des Vektors selbst ohne insertierte Fragment 6,7 kb. Die Größe der freigesetzten inserierte Fragment enthält sowohl den Promotor und die Einlage Gen von Interesse. Berechnen Sie die erwarteten Fragmentgrößen von der Digest für das spezifische Gen über eine DNA-Sequenz-Editing-Programm, zum Beispiel, APE - eine Plasmid-Editor.
    8. Überprüfen der Größen der beiden DNA-Vektorgerüst und den Freigabe-Fragments, indem eine 1% Agarosegelin 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle der Stammlösungen) bei 100 V
    9. Erhöhen der bestätigten DNA durch wachsende Bakterien in 500 ml LB-Medium Ampicillin (100 ug / ml), die bei 37 ° C für 16-18 Std.
    10. Extrahieren und zu reinigen DNA mit einem handelsüblichen Plasmid-DNA Maxiprep Kit gemäß Herstellerangaben.
      HINWEIS: Maxiprep erzeugt typischerweise ausreichende Menge an DNA für die virale Produktion erforderlich.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.9-1.3.10 die folgenden DNAs für lentiviralen Vorbereitungen zu verstärken: Envelope-Vektor (PMD2.G, 6,1 kb), Paket-Vektor (pBR8.91, 12.5 kb), und eine leere lentiviralen Vektor als Kontrolle (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).

2. 2K7 Virus Produktion

HINWEIS: 1. Tag:

  1. Am Tag der Transfektion Platte 32 Millionen HEK293-Zellen in T175-Kolben mit 25 ml HEK293 T-Zell-Medien (siehe die Tabelle der Stammlösungen). Alternativ Platte 16 Millionen Zellen den Tagvor der Transfektion, wenn die Zeit abgelaufen ist dicht am Tag der Transfektion.
    HINWEIS: Die Transfektion kann durch Plattieren Zellen am Tag der Transfektion oder vor dem Tag gleichermaßen erfolgreich. Mit einer der beiden Alternativen ist der kritische Punkt ist hier, um sicherzustellen, Zellen sich auf Kulturschale Oberfläche vor der Transfektion aufgeklebt werden.
    HINWEIS: Tag 2:
  2. Transfektion
    1. Vor der Transfektion verdünnte DNA 1 ug / ul in TE-Puffer, der 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 in vollentsalztem Wasser enthalten.
    2. In einem 50-ml-Tube, bereiten Sie einen Master-Mix (Tabelle 1) für die Transfektion in der T175-Kolben. Fügen DNA zu vorgewärmten Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und gut mischen durch Wirbel, dann fügen Sie sterile Polyethylenimin (PEI) (siehe Tabelle der Stammlösungen) zu einer vorzeitigen Ausfällen zu vermeiden. ">
      Vektor trong> Konzentration Volumen
      pMDG.2 1 ug / ul 5 & ​​mgr;
      pBR8.91 1 ug / ul 15 ul
      2K7 Vektor mit GFP + Gen von Interesse 1 ug / ul 22 & mgr;
      Sterile Polyethylenimin (PEI) 1 g / L 500 & mgr;
      DMEM 2100 & mgr;
      Tabelle 1: Vorbereiten Transfektionsmischung für 2K7 Virus.
    3. Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens 3-4x und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur (RT).
    4. Führen Sie eine vollständige Medienwechsel auf HEK293T-Zellen. Absaugen des Kulturmediums von Zellen vollständig und Futter mit vorgewärmter HEK293T Zellkulturmedien (25 ml je T175-Kolben).
    5. Fügen Sie das Transfektionsgemisch (DNA / PEI Mischung) tropfenweise zu den Zellen-Monoschicht. Bewegen Sie vorsichtig, um bei 37 ° C, 5% CO 2 gut mischen und inkubieren transfizierten Zellen, über Nacht.
      HINWEIS: Tag 3:
    6. Um sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich ist, überprüfen Sie die GFP-Expression 24 h nach der Transfektion über einen Fluoreszenz-Mikroskopie.
      HINWEIS: Über 50% der Zellen, die GFP in der Regel zeigt eine gute Transfektion.
      HINWEIS: Tag 4:
  3. An der 48 Stunden nach der Transfektion, zur Erhebung der Virusüberstand und ersetzen Sie sie durch frische HEK293 T-Medien (25 ml pro Flasche T175).
    1. Zentrifugieren Sie die Virusüberstand bei 1140 × g für 10 Minuten bei 4 ° C, um aus dem Überstand klar, bis die Zelltrümmer. Über geklärte Überstand an 50 ml Tube und bei 4 ° C.
      HINWEIS: 5. Tag:
  4. Bei 72 Stunden nach der Transfektion sammeln die zweite Charge von Virusüberstand. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1 und Pool 48 und 72 Stunden gelöscht Ständen.
  5. Um das Virus, die virale Zentrifugenüberstand bei 170.000 · g für 90 min konzentrieren bei 4ºC unter Verwendung von 30 ml Ultrazentrifugenröhrchen.
  6. Überstand verwerfen und wiederholen Sie Schritt 2.6, bis alle geklärte Überstand wurde zentrifugiert worden Verlassen einer (unsichtbar) Pellet-Virus Plus gefällt PEI in der Basis der Röhre.
  7. Um die Viren resuspendieren, 500 ul SATO Medien (siehe Tabelle der Stammlösungen) zu den Ultrazentrifugenröhrchen. Vortex für 30 Sekunden einnd kratzen die Basis des Rohrs mit einer Pipettenspitze, um das Virus mechanisch zu lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x, um virale Pellet zu verlieren.
  8. Bündeln die resuspendiert Virus in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin ganz kurz auf unlösliche PEI entfernen. Den Überstand durch ein 0,45 um Filter, um Proteine ​​zu entfernen.
  9. Aliquot des Virus in 20 ul, 50 ul und 100 ul Aliquots und bei -80 ° C.

3. Virale Titer Bestimmung in HEK293T Zellen

  1. Um die Expression des Proteins von Interesse zu überprüfen und die optimale Viruskonzentration für Experimente verwendet, fügen eine Reihe von seriellen Verdünnungen des Virusstamms (beispielsweise 0, 5, 10, 20, 40, 80 & mgr; l), um HEK293-Zellen in plattierten transduzieren 6-Well-Platten, und die Kultur für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Dieses Protokoll erzeugt typischerweise Virus, das in Konzentrationen im Bereich von 1:50 bis 1 verwendet werden können: 200, die robuste Expression des Gens der zu erreichenInteresse.
  2. 48 Stunden nach der Virusübertragung, Lyse HEK293T-Zellen in TNE-Puffer (siehe Tabelle der Stammlösung) mit Proteasehemmern.
    1. Vertiefungen zweimal Spülen Sie mit kaltem DPBS und fügen 150 ul TNE-Puffer in jede Vertiefung.
    2. Lyse Zellen durch Auf- und Abpipettieren 5-10x. Übertragen Ganzzelllysaten bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren auf Eis für 15-30 min.
    3. Zentrifugation der Lysate bei 4 ° C für 30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (20,000 · g) und die Übertragung geklärte Überstand in ein frisches Röhrchen zur Proteinbestimmung nach Bradford und anschließende Western Blot-Analyse.
  3. Bestimmen Sie die Höhe der Expression des Proteins von Interesse durch Standard Western Blot-Analyse, während Sondieren für Antikörper gegen das Protein selbst und dem geschmolzenen Tag (dh Flagge). Verwenden Sie die Virusverdünnung, die> 95% GFP + -Zellen und robuste Expression von Protein von Interesse für Experimente ergibt.

4. Isolierung und Kultur der DRGs (Fild 2 Schritte 1 & 2)

figure-protocol-2
Abb. 2: Schematische Darstellung der In-vitro-Assays Myelinisierung DRG-Neuronen von P2-3 Rattenjungen, dann gereinigt und kultiviert über zwei Wochen (1-2) zerlegt. OPCs sind aus P7-9 Rattenhirnen mit Immunopanning gereinigt (3). OPCs werden dann mit Lentivirus und für 48 Stunden (4) kultiviert infiziert. OPCs werden dann auf DRGs ausgesät, und alle Wachstumsfaktoren von Interesse, wie BDNF hinzugefügt (5). Co-Kulturen werden dann für 2 Wochen kultiviert, damit OPCs zu differenzieren und myelinisieren die Axone (6). Schließlich werden die Co-Kulturen entweder für Western Blot lysiert oder Immunzytochemie (7) befestigt.

HINWEIS: Tag 1 2 Tage vor der Dissektion:

  1. Coat autoklaviert 22 mm x 22 mm Deckgläsern mit Poly-L-Ornithin (0,5 mg / ml) in einer 6-Well-Platte, und bei 37 ° C über Nacht.
  2. Am nächsten Tag, Kleiderdeck wieder mit Laminin (20 ug / ml in MEM) bei 37 ° C über Nacht, saugen überschüssige und trocken für 20 Minuten in der Gewebekultur Kapuze.
    HINWEIS: Tag 2: Präparation und Isolierung von DRGs:
  3. Sacrifice P2-P3 Rattenjungen 12x durch zervikale Trennung.
  4. Entfernen der Haut über dem vom Rücken des Tieres. Verwenden Vannas Schere Wirbelloch öffnen und Pinzette vorsichtig aushöhlen das Rückenmark.
  5. Auszureißen DRGs, die dazwischen liegen, Wirbelsäulen und abgeschnitten befestigt spinalen Nervenfasern, dann Ort DRGs in einer 33 mm Petrischale mit 3 ml L-15 Medien. Es ist normalerweise nicht möglich, zwischen 8 und 12 DRG von jeder Seite des Rückenmarks zu sammeln
  6. Aufesammeltes DRGs zusammen mit den L-15-Medium in einem 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 180 × g für 5 min.
  7. Aspirierender Überstand, 2 ml 0,25% Trypsin, um Pellets DRG und bei 37 ° C für 30 min.
  8. 5 ml Medium M1 (siehe Tabelle der Stammlösung) zu den DRG-Pellets zu Trypsin und Zentrifuge bei 180 xg für 3 min bei RT zu stoppen.
  9. Überstand entfernen, resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml vorgewärmten M1 Medium (nicht mit Wachstumsfaktoren). Man reibt die Ganglien Pellet durch Pipettieren von 50-fach oder bis die Ganglien dispergiert sind. Zentrifuge Zellsuspension bei 180 × g für 3 min.
  10. Resuspendieren dissoziierten Neuronen in Medien M1 und die Platte in einer 6-Napf-Platte mit 5-Ganglien pro 100 ul pro Vertiefung.
  11. So entfernen Sie wuchernden nicht-neuronalen Zellen nach einer mindestens 4-stündigen Inkubation, um die Befestigung zu erleichtern, nehmen Sie M1 Medien und füttern Neuronen mit M2-Medium (siehe Tabelle der Stammlösung). Kultur DRG Neuronen in Gegenwart von NGF (100 ng / ml), um eine Kultur der NGF-abhängige TrkA exprimierende DRGs reinigen. Alternativ können Sie auch BDNF (100 ng / ml), um BDNF-abhängigen TrkB-expres reinigensingen DRGs.
  12. Pflegen Neuronen in M1 Medien (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) im Wechsel mit antimitotischen M2-Medium für 2 Wochen als unten.
  13. Pflegen Medium M1 (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) an den Tagen 4-6, 8-10, 12-14 und M2-Medium (+ NGF oder BDNF bei 100 ng / ml) mit FDU und Uridin an den Tagen 1 bis 4, 6-8 und 10-12. Ein Minimum von 3 Zyklen von M2-Medium Reinigung erforderlich.
  14. Pflegen DRGs in M1 allein für eine weitere Woche nach Abschluss der 2 Wochen antimitotische Zyklus. Ändern M1 Medien alle 2-3 Tage.

    15. 5. Isolierung und Kultur der OPCs (Abbildung 2 Schritt 3)

    HINWEIS: Tag 1 2 Tage vor der Dissektion:

    1. Mantel 10 cm-Gewebekulturplatten mit Poly-D-Lysin (PDL, 10 ug / ml in sterilisiertem deionisiertem Wasser) bei 4 ° C über Nacht.
      HINWEIS: Tag 2: 1 Tag vor der Dissektion:
    2. Mit sterilem entionisiertem Wasser 3x waschen PDL Platten. Lassen Sie für ca. 6 h in der Gewebekultur Haube trocknen. Wenn nicht sofort verwendet, wickeln und zu speichernfür bis zu 4 Wochen bei 4 ° C.
    3. Bereiten sekundären Antikörper Platten für Immunopanning. 1 Gehirnsezierung bereiten 2x IgG Platten (für Ran2 Antikörper an Astrozyten und O1-Antikörper zu entfernen, um zu entfernen premyelinating Oligodendrozyten), mit 45 & mgr; l Ziegen-α-Maus IgG in DPBS (15 ml) pro 10 cm Petrischale; 1x IgM Platte (O4 Antikörper zum Auswählen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen), 45 & mgr; l Ziegen-α-Maus IgM in DPBS (15 ml) pro 10 cm Petrischale.
      HINWEIS: Tag 3: Tag der Präparation:
    4. In 200 Einheiten Papain in 10 ml Papain Puffer (Tabelle 2) und Aufwärmen auf 37 ° C, bis der Puffer klar wird.
      Konzentration für 250 ml Endkonzentration
      EBSS Lager 10x 25 ml 1x
      MgSO 4 100 mM 2,5 ml 1 mM
      Glucose 30% 3 ml 0,46%
      EGTA 0,5 M 1 ml 2 mM
      NaHCO3 1 M 6,5 ml 26 mM
      Bringen Volumen bis 250 ml mit VE-Wasser und Filter zu sterilisieren
      Tabelle 2: Herstellung von Papain Puffer.
    5. Waschen Sie alle sekundären Antikörper Platten mit DP-BS für 3x.
    6. Gießen Sie die Ran2 und O1-Antikörper auf die IgG-Platten und der O4 Hybridomzellen auf die IgM-Platte. Alle diese primären Antikörper Inkubation erfolgt über 2 Stunden bei RT.
    7. Präparieren eines Gehirns von einem P7 Ratte. Enthaupten einen Welpen mit scharfen Scheren und entfernen Sie die Haut über den Schädel mit einer Schere.
      1. Um den Schädel geschnitten aus dem Hinterhauptslappen, Temporallappen und an den Stirnlappen. Entfernen von Gehirn Schädel mit einer Pinzette und sanft überträgt es auf einer 35-mm-Petrischale mit 1 ml DPBS.
      2. Würfeln Gehirn in kleine Stücke in etwa mit einer Schere oder sterile Klinge.
    8. Filter vorgewärmt Papain-Puffer (10 ml) in ein neues 15 ml Röhrchen, das ein Körnchen von L-Cystein, danach 200 ul DNAse (12.500 U / ml) zu dem filtrierten Papain Puffer.
    9. Gießen Sie die Papain-Puffer auf die gewürfelte Hirngewebe; Inkubieren bei 37 ° C für 90 min.
    10. Gentlly Transfer dissoziiert Hirngewebe in 50-ml-Röhrchen mit einer 25 ml Pipette undabsetzen lassen.
    11. Entfernen Papain Puffer, 2 ml Lo Ovo (Ovomucoid) zu Hirngewebe und titurate 5-10x durch Pipettieren zu brechen Stücke von Hirngewebe, absetzen lassen und entfernen Sie die oberen 2 ml Überstand in ein neues Röhrchen.
    12. Fügen Sie eine weitere 2 ml Lo Ovo zu Hirngewebe und wiederholen Sie Schritt 5,11 bis keine Klumpen von Gewebe bleibt. Tituration bekommen kann immer aggressiver.
    13. Zentrifuge dissoziierte Zellsuspension für 15 min bei 200 x g. Absaugen Stand und resuspendiere Zellpellet in 10 ml Hallo Ovo und zentrifugieren für 15 min bei 200 x g.
    14. Waschen Sie zuerst Immunopanning Platte (Ran 2-Platte) mit DPBS für 3x. Überstand entfernen, Zellen in 10 ml Panning Puffer (Tabelle 2) und gießen Sie auf die erste Immunopanning Platte (Ran 2 Schild). Zellen, die Proben für 15 min bei RT.
    15. Waschen Sie die zweite Immunopanning Platte (O1 Platte) mit DPBS für 3x.
    16. Nach der Inkubation in der ersten Immunopanning Platte, das Zünglein an der Zellsuspension auf zweitenImmunopanning Platte (O1 Platte), spülen Sie lose Zellen von der Oberfläche der Platte mit 1-3 ml Panning Puffer und Pipettieren mit dem O1 Platte. Zellen, die Proben für 15 min bei RT.
    17. Waschen Sie die dritte Immunopanning Platte (O4 Schild). Diese Platte ist die positive Selektionsplatte, wo die OPCs binden seiner Oberfläche. Waschen Sie die O4-Platte mit DPBS für 3x.
    18. Nach der Inkubation auf der zweiten Immunopanning Platte, übertragen die Zellen auf die endgültige Immunopanning Platte (O4 Platte), inkubieren Zellen für 45 min bei RT. Dieser Schritt wird O4 + OPCs auswählen.
    19. Überstand von dem letzten Immunopanning Platte (O4 Platte) und spülen Sie die Platte mit EBSS für 6x.
    20. Um OPCs off der Platte zu entfernen, inkubiert die Zellen mit 5 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt 1:10 mit EBSS bei 37 ° C für 8 min.
    21. 5 ml 30% FBS (in EBSS hergestellt), um das Trypsin zu neutralisieren. Entfernen Zellen ab Oberfläche der Platte durch Pipettieren ca. 50x.
    22. Übertragen Sie alle ZellSuspension in ein neues Röhrchen und zentrifugiere für 15 Minuten bei 200 x g.
    23. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vorgewärmten SATO Medien, gefolgt von Zellzählung. Dissection von einem Gehirn 1,5-2.000.000 OPCs liefern.
    24. Platten Zellen auf Trocken PDL-beschichteten Platten in einer Dichte von 1 x 10 5 und 5 x 10 5 pro 10 cm Platte mit in SATO Medium (10 ml), der ciliare neurotrophe Faktor enthalten (CNTF, 10 ng / ml), Plättchenwachstumsfaktor (PDGF, 10 ng / ml), Neurotrophin 3 (NT3, 1 ng / ml) und Forskolin (4,2 ug / ml) 2,12. Kultur OPCs bei 37 ° C, 8% CO 2.

    6. transduzierenden OPCs

    1. Kultur primären OPCs in SATO Medium (10 ml / 10 cm-Platte) mit CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml) und Forskolin (4,2 ug / ml) bei 37 ° C, 8% CO 2 für 24 Stunden nach der Sektion.
    2. Komplett absaugen den OPC Kulturmedien, Futter Zellen mit frisch zubereiteten SATO Medium (10 ml) Mit Wachstumsfaktoren (siehe oben in Schritt 6.1).
    3. Hinzufügen Virus zu den OPCs auf die optimale Konzentration für Schritt 3 (Abbildung 2, Schritt 4), Kultur OPCs für weitere 48 h bestimmt.

    7. OPC Seeding für myelinisierenden Co-Kulturen (Abbildung 2, Schritt 5 und 6)

    1. Um OPCs von der Oberfläche, erste Spülung OPC Platten mit 8 ml EBSS zweimal zu entfernen, dann inkubieren Zellen mit 5 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt 1:10 mit EBSS bei 37 ° C für 2 min.
    2. Neutralisieren die Trypsin mit 30% FBS in EBSS (5 ml), und entfernen Sie Zellen aus Platte pipettiert. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml-Gefäß, Zentrifuge bei 180 × g für 15 min bei RT.
    3. Absaugen der Überstand und resuspendieren Zellpellet in 1 ml vorgewärmten SATO Medien gefolgt von Zellzahl.
    4. Vor der OPC Aussaat, vollständig absaugen Medien aus dem DRG-Kulturplatte. Gently Saatgut 200.000 OPCs tropfenweise auf die DRG-Neuronen, wie zuvor beschrieben 6.4.
      HINWEIS:Die gesamte OPC Aussaat Volumen muss weniger als 200 & mgr; l pro 22 mm Deckglas sein.
    5. Lassen Zellen ohne Bewegen der Platte für 10 Minuten in der Gewebekultur Haube zu regeln, dann vorsichtig nachfüllen 1 ml vorgewärmten SATO Medium pro Vertiefung.
    6. Ausstrich die restlichen Schwester OPCs mit SATO Medium mit Wachstumsfaktoren (siehe Schritt 6.1). Verwenden Sie diese Schwester OPCs, die Expression des Proteins von Interesse zu prüfen.
    7. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie den SATO Medien mit dem Co-Kulturmedien (2 ml / Vertiefung), die SATO Medien (keine Faktoren) und Neurobasalmedium (v / v) mit 1% B27. Pflegen Sie die Co-Kulturen für 14 Tage mit Medienwechsel alle 2-3 Tage.
    8. Bewertung der Co-Kulturen für Myelinprotein-Expression durch Western Blot-Analyse und Visualisierung für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Doppelimmunfärbung mit Antikörpern gegen das Myelin-Basisprotein-Marker und neuronalen Marker 4-6.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das Flag-markierten extrazellulären Signal-bezogene Kinase 1 (Flag-Erk1) Konstrukt für Lentivirus Produktion verwendet wird durch Restriktionsenzym verdauen prüft der verwendeten Konstrukte, die sowohl die 2K7 Konstrukte und die für die Virusproduktion erforderlichen Verpacken und Zusatz-Konstrukte (Abbildung 3) .

figure-results-1
Figur 3: DNA-Konstrukt Verifikation.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Myelinisierung von Axonen ist eine entscheidende Prozess für die optimale Funktion von sowohl den zentralen und peripheren Nervensystems von Wirbeltieren. Die Erzeugung und Wartung von myelinisierten Axonen ist ein komplexer Prozess, und koordinierte molekulare Wechselwirkungen zwischen neuronalen, glialen (von Schwann-Zellen oder Oligodendrozyten) und extrazellulären Matrixproteinen. Die Bedeutung und die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist, dass es ermöglicht die Manipulation von Proteinen in einem spezifischen Zellty...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf diese Forschung gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC-Stipendium #454330 für JX, Projektstipendium #628761 für SM und APP1058647 für JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 für JX), das University of Melbourne Research Grant Support Scheme und das Melbourne Research CI Fellowship für JX sowie die australischen Postgraduiertenstipendien für HP und AF. Wir möchten das Operational Infrastructure Scheme der Ministerium für Innovation, Industrie und regionale Entwicklung, Victoria, Australien.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2K7 Lentivektor Freundliches Geschenk von Dr. Suter9
>5-Fluoro-2′-DesoxyuridinSigma-AldrichF0503-100mg
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgGJackson Immunoresearch115545205
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Life TechnologiesA11008
Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Life TechnologiesA11005
Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Life TechnologiesA11012
AmpicillinSigma-AldrichA9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronale ErgänzungStammzelltechnologien 5711
BDNF (Mensch)PeprotechPT450021000
Biotin (d-Biotin)Sigma AldrichB4639
Bradford ReagenzSigma AldrichB6916-500ML   
BSASigma AldrichA4161
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378-100G
CNTFPeprotech450-13020
DAKO Fluoreszenz-EindeckmedienDAKOS302380-2
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein GlutaminLife Technologies10313039
DNaseSigma-AldrichD5025-375KU
DPBSLife Technologies14190250
DPBS, Calcium, MagnesiumLife Technologies14040182
EBSSLife Technologies14155063
EcoRI-HFNEBR3101
Eintrittsvektoren für Promotor und Gen von InteresseGenerieren gemäß den Protokollen 1-2
Fötales RinderserumSigma-Aldrich12003C
Forskolin Sigma AldrichF6886-50MG
Glukose (D-Glukose)Sigma-AldrichG7528
GlycerinChem SupplyGL010-500MSiehe Lagerlösungen
Ziege Anti-Maus IgGJackson ImmunoResearch115005003
Ziege Anti-Maus IgM Jackson ImmunoResearch115005020
Goat Anti-Ratte IgGJackson ImmunoResearch112005167
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
IgepalSigma AldrichI3021-100ML 
Insulin Sigma AldrichI6634 
KanamycinSigma-Aldrich60615
Laminin Life Technologies23017015
LB MediumSiehe Lagerlösungen
LB-AgarSiehe Lagerlösungen
L-CysteinSigma-AldrichC-7477
L-15 MediumLife Technologies11415064
L-GlutamatSigma-AldrichG1626
L-Glutamin - 200 mM (100x) flüssigLife Technologies25030081
LR Clonase II Plus EnzymLife Technologies12538-120
MEM, NEAA, ohne GlutaminLife Technologies10370088
; β III Tubulin PromegaG7121
Maus & alpha; MBP (monoklonal)MilliporeMAB381
Na pyruvat Life Technologies11360-070
NACSigma AldrichA8199
NcoI-HFNEBR3193S
NEBuffer 4NEBB7004S
Neurobasales MediumLife Technologies21103049
NGF (Maus)Alomone LabsN-100
NT-3Peprotech  450-03
O1-Antikörper - Maus Anti-O1MilliporeMAB344Alternative, wenn O1-Hybridomzellen nicht verfügbar
sind O1-HybridomzellenKonditioniertes Medium mit Anti-O1-Antikörper zur Verwendung zur Immunpanierung
O4-Antikörper - Maus Anti-O4MilliporeMAB345Alternative, wenn O4-Hybridomzellen nicht verfügbar sind
O4-HybridomzellenKonditioniertes Medium mit Anti-O4-Antikörpern zur Verwendung für die Immunpanierung
Kompetente ZellenLife TechnologiesA10460
One Shot Stbl kompetente ZellenLife TechnologiesC7373-03
Papain SuspensionWorthington/CooperLS003126
pBR8.91Freundliches Geschenk von Dr. Denham10
PDGF-AA (Mensch)PeprotechPT10013A500   
Penicillin-Streptomycin 100x LösungLife Technologies15140122
pENTRY4IRES2GFPInvitrogen11818-010 
pMD2.GAddgene12259
Poly-D-LysinSigmaP6407-5MG
Polyethylenimin (PEI)Sigma-Aldrich408727-100ML
Poly-L-Ornithin Sigma Aldrich P3655
Progesteron Sigma AldrichP8783
Proteasehemmer Tablette (Complete mini)Roche11836153001
Proteinase KGeliefert mit dem Clonase-Enzym
PutrescinSigma AldrichP-5780
Kaninchen & Alpha-NeurofilamentMilliporeAB1987   
Kaninchen & Alpha; MBP (polyklonal)MilliporeAB980
Ran2-HybridomzellenATCCTIB-119Konditioniertes Medium mit Anti-Ran2-Antikörper zur Verwendung zur Immunpannierung
Ratte anti-CD140A/PDGFRa-AntikörperBD Pharmingen558774
SacIINEBR0157
SOC-MediumLieferung mit kompetenten Bakterien
Natriumselenit Sigma AldrichS5261
Spe INEBR0133S
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase PufferNEBB0202S
TE Puffer pH8Siehe Stammlösungen
TNE Lysepuffer
Spurenelemente BZellgro 99-175-CI
Transferrin (Apo-Transferrin human)Sigma-AldrichT1147
Triton X-100Sigma-AldrichT9284 
TrypsinSigma-AldrichT9201-1G
Trypsin-Inhibitor aus HühnereiweißRoche10109878001
Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot (0,05%)Life Technologies25300-054
Unkonjugiertes Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1Vector Laboratories L-1100
UridinSigma-AldrichU3003-5G
Maus &alpha

Referenzen

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Lentivirus ProduktionIn vitro Myelinisierungs Assayvirale TransduktionWestern Blot AnalyseImmunfluoreszenzf rbungDRG Neuronen KulturUltrazentrifugationsprotokollGFP ExpressionsanalyseZellaussaattechnik
Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.