Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Summary

Zellkultursubstrate, funktionalisiert mit mikroskaligen Mustern biologischer Liganden, haben einen immensen Nutzen im Bereich des Tissue Engineering. Hier demonstrieren wir die vielseitige und automatisierte Herstellung von Gewebekultursubstraten mit mehreren, mikrostrukturierten Poly(ethylenglykol)-Bürsten und präsentieren orthogonale Chemien, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung von biologischen Liganden ermöglichen.

Abstract

Im Tissue Engineering ist es wünschenswert, die räumliche Kontrolle der Gewebemorphologie und des Zellschicksals in Kultur auf der Mikrometerskala zu zeigen. Kultursubstrate mit transplantierten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Bürsten können verwendet werden, um diese Aufgabe zu erfüllen, indem mikroskalige, nicht fouling- und zelladhäsionsresistente Regionen sowie Regionen geschaffen werden, in denen Zellen an biospezifischen Wechselwirkungen mit kovalent gebundenen Liganden beteiligt sind. Um komplexe Gewebe unter Verwendung solcher Substrate zu entwickeln, wird es notwendig sein, mehrere PEG-Bürsten sequentiell zu strukturieren, die funktionalisiert sind, um unterschiedliche Bioaktivitäten zu verleihen, und die in mikroskaligen Orientierungen ausgerichtet sind, die In-vivo-Nischen nachahmen. Der Mikrokontaktdruck (μCP) ist eine vielseitige Technik, um solche gepfropften PEG-Bürsten zu modellieren, aber der manuelle μCP kann nicht mit mikroskaliger Präzision durchgeführt werden. Daher haben wir fortschrittliche Robotik mit Soft-Lithographie-Techniken und aufkommenden oberflächenchemischen Reaktionen kombiniert, um eine robotergestützte Mikrokontaktdruckmethode (R-μCP) zur Herstellung von Kultursubstraten mit komplexen, mikroskaligen und hochgeordneten Mustern von PEG-Bürsten zu entwickeln, die orthogonale "Klick"-Chemien darstellen. Hier beschreiben wir ausführlich den Workflow zur Herstellung solcher Substrate.

Introduction

Die Fähigkeit von PEG-gepfropften Oberflächen kovalent gebunden biochemischen Liganden angezeigt während gleichzeitig inhärente Nicht-Fouling-Eigenschaften machen sie zu einer idealen Wahl für Engineering individuelle Mikroumgebungen auf Kultursubstraten ^1,2,3. Die biospezifische Wechselwirkungen von Liganden konjugiert PEG vermittelte Bürsten ermöglicht reductionistic Analyse der Wirkungen von biochemischen Hinweisen im Komplex in vivo Gewebemikroumgebung über einzelne Zell Phänotypen gefunden. Weiterhin kann bio-orthogonal "auf" Chemie verwendet werden, um Richt Immobilisierung von Liganden zu erleichtern, so dass sie im nativen Konformationen ^4-6 dargestellt werden. So mikroskaligen räumlichen Strukturierung von PEG Bürsten ist ein vielseitiges Werkzeug, um Designer in vitro Nischen schaffen, um Zellsignalisierung durch immobilisierte biochemischen Cues ^6,7 induzierte untersuchen.

Ein übliches Verfahren zur Erzeugung von räumlichen Mustern der biochemischen cues bringt Mikrokontakt-Drucken (mCP) gold-beschichteten Substrate mit Mustern von PEG konjugierten Alkanthiole. Dann werden die mikroselbstorganisierte Monoschichten (SAMs) von PEG-ylated Alkanthiole schränkt die physikalische Adsorption von biochemischen Molekülen, zB Proteine, nur für die nicht gemusterten Bereiche des Substrats ^8,9. , Die durch diese Technik erzeugt SAMs sind jedoch empfindlich gegenüber Oxidation in der Langzeitzellkulturmedien. Somit μCP'd Alkanthiol SAMs häufig weiter mit PEG Polymerbürsten mit oberflächeninitiierte Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP-SI), um die Region nicht-Fouling-Stabilität ¹⁰ zu erhöhen gepfropft. Insbesondere mCP der Alkanthiol Polymerisationsinitiator erzeugt ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, auf Gold-beschichteten Oberflächen, gefolgt von SI-ATRP von Poly (ethylenglycol) methylethermethacrylat (PEGMEMA) Monomere Oberflächen mikro langfristig stabil und nicht Fouling PEG Bürsten. Darüber hinaus sind diese sind in der Lage, die weiter modifiziert, um diverse chemische Einheiten ¹¹ zu präsentieren.

Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft, Sha et. al. eine Methode entwickelt, um Kultursubstrate mit Mehrkomponenten PEGMEMA Bürsten präsentiert orthogonal "auf" Chemie-Ingenieur. Bei diesem Verfahren verwendet man eine Reihe von & mgr; CP / SI-ATRP Schritten mit sequentieller Natriumazid, Ethanolamin vermischt und Propargylamin nucleophile Substitutionen Kultursubstrate präsentiert Mikromuster mehrere immobilisierte Liganden ⁶ zu erstellen. Während das Potential der Verwendung solcher Chemikalien in Verbindung mit manuellen mgr; CP neue Kultursubstrate Ingenieur ist immens, es wird von der Präzision und Genauigkeit, mit welcher mehrere & mgr; CP Schritte können auf einem einzigen Substrat ausgerichtet werden, beschränkt. Ein hohes Maß an Präzision und Genauigkeit erforderlich wäre, um reproduzierbar herzustellen Komplex in vitro Nischen mit diesen vielseitigen Techniken werden.

e_content "> Um diese Einschränkung zu begegnen, haben mehrere automatisierte und halbautomatisierte mCP Systemen erzeugt wurden. Chakra et. al. eine mCP System, in dem kundenspezifische Stempel sind auf einem Schienensystem platziert und mit Gold-beschichtete Objektträger mit in konformen Kontakt gebracht entwickelt ein computergesteuertes pneumatisches Stellglied. Allerdings erfordert dieses Verfahren die präzise Herstellung von kundenspezifischen Stempel entwickelt und berichtet über eine Präzisions 10 um ohne Bericht der erreicht wird, wenn die Durchführung mehrerer Schritte ¹² & mgr; CP Genauigkeit. Vor kurzem wurde ein Verfahren unter Verwendung eines integrierten kinematischen Kopplungssystem berichteten Genauigkeit unterhalb von 1 um unter Verwendung eines einzigen Musters, waren aber nicht in der Lage, mehrere Muster genau auszurichten aufgrund des Fehlens einer präzisen Steuerung der Stempelfunktionen von Form zu Form ^13. Zusätzlich beiden vorhergehenden Verfahren erfordern das Substrat zwischen den Strukturierungsschritten fest bleiben und damit deutlich die Vielfalt der Oberflächenmodifizierung Chemie, die sein kann, begrenztverwendet. Hier beschreiben wir eine automatisierte R-mCP System in der Lage genau und präzise Ausrichtung mehrerer mCP Schritte und ermöglicht maximale Flexibilität bei der Briefmarkenentwurf und Fertigung. Weiterhin können die gemusterten Substraten wiederholt aus dem System zwischen Stanz entfernt werden, wodurch die Verwendung von verschiedenen Substratmodifikation Chemien, einschließlich sequentieller nucleophile Substitutionen erlaubt. Substrate entwickelt unter Verwendung solcher Chemikalien wurden für Zellkultur zuvor sowohl von uns ^6,14 und andere ⁷ verwendet. So haben wir R-mgr; CP und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen zusammengeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von skalierbaren Kultursubstrate mit komplexen biochemischen und mikro Signale zu entwickeln.

Protocol

1. Gene Elastomere Briefmarken

1. Um Silizium Meister der PDMS-Stempel zu erzeugen, Design-Merkmal-Muster der Photomaske ist mit Computer-Aided-Design-Software.
   1. Gestalten Sie das erste Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 300 & mgr; m Innendurchmesser (ID) und 600 & mgr; m OD mit 1200 & mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand.
   2. Gestalten Sie das zweite Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 600 um ID und 900 & mgr; m OD mit 1200 & mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand.
   3. Zusätzlich legen 1 x 1 mm ² Quadratreferenzmarken an allen vier Ecken jedes Array-Design Abstand 1.200 & mgr; m von Mitte zu Mitte von der Ecke Muster in einem 45 ° -Winkel.
   4. Fabrizieren die Silizium-Master für die Verwendung in diesem Experiment mit 1: 1-Seitenverhältnisse, in Korrelation zu einem 300 um Feature Tiefe mit Standardlithographietechniken anderswo ¹⁵ oder in Zusammenarbeit mit einem mikrofluidischen Gießerei detailliert.
      HINWEIS: Feature Tiefen von weniger als 100 & mgr; m können zu abnorm Verformung Briefmarken vor mit Substratoberflächen kontaktieren führen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll beginnt mit mit bereits erhaltenen Silizium-Master mit den beschriebenen Muster aus Fotolack, die Spezialausrüstung und saubere Zimmer zu schaffen erfordert. Am besten ist es mit einem Verarbeiter oder Core Facility, diese strukturiert Master-Dokumente erstellen zu konsultieren.
2. Silanisieren Silizium Meister O / N durch Inkubation mit (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydroocty) Trichlorsilan Dampf.
   HINWEIS: Silandampf ist sehr giftig und sollte nur in einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden.
3. Erstellen inverse Repliken der Silizium Meister durch Härten einer 10: 1-Verhältnis von PDMS-Prepolymer und PDMS Härter auf der Oberseite der silanisierten Silizium Meister in einer Petrischale O / N bei 60 ° C.
4. Entfernen Sie die PDMS-Stempel aus den Silizium Meister und binden die Briefmarken zu Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Träger oder einer anderen starren Materials unter Verwendung von Klebstoff.
   HINWEIS: Das Material der Wahl nicht transparent oder biokompatibel sein. Es muss jedoch eine flache Oberfläche für die Schnittstelle mit der Roboterwerkzeuge und höhere Steifigkeit als PDMS bereitzustellen.

2. Vorbereiten Coverslides

1. Spülen Mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) in Toluol, Methanol und beschallen in Aceton für 1 Minute vor dem Spülen mit Ethanol und Trocknen unter einem leichten Stickstoffstrom.
   Hinweis: Behandeln Toluol und Aceton nur in einer chemischen Abzugshaube.
2. Mantel coverslides mit ~ 3,5 nm Titan (Ti), gefolgt von 18,0 nm Gold (Au) mit einem fokussierten Elektronenstrahl-Verdampfers.
   Hinweis: Dieses Verfahren ist mit einer Vielzahl von mit Gold beschichteten Substraten, einschließlich Silicium und Polystyrol kompatibel. Während es möglich ist, diese vor Ort zu erzeugen, sind ebenfalls mit Gold beschichteten Substrate über kommerzielle Lieferanten erhältlich.
   HINWEIS: Ti-Schichten sollte mindestens 3 nm dick sein, während Au-Schichten auf Substraten sollte eint mindestens 5 nm dick und kann den ganzen Weg in der Dicke in Abhängigkeit von den idealen optischen Eigenschaften des fertigen Substrats ^16,17 1mm liegen. Substrate sind nicht erforderlich für die Herstellung optisch klar zu sein; jedoch ermöglicht sie mikroskopische Analyse hergestellt Substraten.
3. Spülen Sie goldbeschichteten coverslides mit Ethanol und trocken unter leichtem Stickstoff unmittelbar vor der Verwendung.

3. R-mCP der Außenring

1. Bevor R-mCP mit der selektiv kompatible Knickarmroboter (SCARA) System, kalibrieren Sie die Roboterwerkzeug Effektoren und begleitenden Dual-Kamera-Systeme mit der Software des Systems.
   ANMERKUNG: Diese Werkzeuge sind in Figur 1 dargestellt.

Abbildung 1. R- mCP System und Robotic Arm Tooling. (A) Großansicht des R-mCP System mit allen Werkzeuge und Vorrichtungen (a) Vakuumspann, (b) Reagenz Bad, (c) nach unten gerichtete Kamera, (d) Stempel Verschachtelung Halterung, (e) Roboter Werkzeug. (B) Robotic arm tooling Darstellung (f) Diamant Ätzanlage und (g) pneumatische Saugwerkzeug hält eine (h) ABS-Backed PDMS-Stempel.

2. Manuell legen Sie eine PDMS-Stempel mit 600 um ID und 900 & mgr; m OD vorstehende Ringe nach unten im Stempel Verschachtelung Befestigung. Hand legen eine frisch gereinigte Gold beschichteten Deckglas auf der Oberseite der Vakuumspannvorrichtung, in Figur 1A dargestellt, und zu immobilisieren sie mit dem verbundenen Laborvakuum.
3. Mit den Robotersteuerungen, richten Sie den nach unten weisenden Kamera über dem Mittelpunkt des goldbeschichteten Deckglas, wie in 2A.
   HINWEIS: Dieser Punkt kann anfänglich visuell definiert werden und erfordert keine große Genauigkeit, wie der PDMS-Stempel ist viel largER als die goldbeschichteten Folie.
4. Weisen den Roboterarm zu vier Referenz ätzen "X" Markierungen an den Ecken eines Quadrats mit den Maßen 3,8 mm · 3,8 mm auf der Gold beschichteten Deckglas mit der Diamant Ätzanlage zum Roboterarm befestigt zentriert. (In 2B Dargestellt; automatisierten Prozess)
   HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, alle vier Referenzmarken sind innerhalb einer visuellen Rahmen der nach unten weisenden Kamera.
5. Mit den Robotern pneumatische Absaugung Tooling, Abholung und halten die PDMS-Stempel 1 mm über der Stempel Verschachtelung Halterung wie in 2C. (Automatisierten Prozess)
6. Mit dem nach oben zeigenden Kamera und LED-Beleuchtungsring in 2D und E abgebildet, visualisieren quadratischen Referenzmarken des Stempels und ihnen mit der Kamera-Software zu identifizieren 10 mal um durchschnittlich X des Stempels, Y zu bestimmen und von der Mitte der Winkelversatz Roboter Werkzeugachse. (Automatisierten Prozess)
7. Wie in HINWEIS: Eine interne Berechnung wird von der Software des Robotersystems durchgeführt, um genau auszurichten der Stempel und Deckglas der X, Y-Center-Standorte und Winkelverschiebungen in künftige R-mCP Schritte.
8. 3.8) Den Stempel in ein Bad aus Alkanthiol ATRP Initiators, ω-mercaptoundecyl bromisobutyrat (2 mM in Ethanol), wie in Abbildung 2F dargestellt. (Automatisierten Prozess)
9. Entfernen Sie den Stempel aus der Alkanthiol-Lösung und legen Sie es über Stickstoffstrom auf 0,48 bar (5 psi) unter Druck gesetzt, um das Ethanol wie in 2G verdampfen. Nach 1 min erhöht der Stickstoffstrom Druck auf 1,03 bar (15 psi) zu einheitlichen Trockenheit zu gewährleisten. (Automatisierten Prozess)
   HINWEIS: Unvollständige Trocknung wird in vollständigen oder teilweisen Verlust der Mustertreue führen.
10. Nach dem Trocknen bewegen der Stempel über die berechnete Mittelstellung des Gold-beschichteten Objektträger und senken es bei 100 & mgr; m-Schritten während der Überwachung Z-Achsen-Motorkraft, wie in Figur 2H dargestellt.
    ANMERKUNG: Diese wird als Drehmoment von der Z-Achsen-Motor erfahren und in die Roboterführung Software angezeigt kommuniziert. (Automatisierten Prozess)
11. Stop Absenken der Stempel einmal der vorbestimmte Druck von 79,2 kPa erreicht worden ist, und der Kontakt mit dem Gold-beschichteten Objektträger für 15 Sekunden zu halten. (Automatisierten Prozess)
    HINWEIS: Die Druckwerte werden hier für den aktuellen Stempel Design und Funktion Höhe optimiert. Wenn der Briefmarkenentwurf ist von einem Versuch und Irrtum-Prozess verändert, speziell für hohe Seitenverhältnis Briefmarken, tune diese entsprechend.
12. Entfernen Sie langsam den Stempel aus dem goldbeschichteten Objektträger und setzen Sie den Stempel wieder in die Stempel Verschachtelung Befestigung. (Automatisierten Prozess)

4. SI-ATRP von PEGMEMA auf mikrostrukturierten Coverslides

1. Lassen Unterdruck hält die mikroDeckGlas, und überträgt es auf einen 50-ml-Schlenk-Kolben. Seal und entgast Schlenkkolben mit einer Vakuumpumpe.
2. Hinzufügen von 5,5 ml ATRP Reaktionsmischung, die das Makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), Wasser (34,4 ml), Methanol (43,8 ml), Kupfer (II) -bromid (1 mmol) und 2 ', 2-Bipyridin (3 mmol) an die Schlenk-Kolben.
3. 0,5 ml der L-Natriumascorbat (454,3 mM) in Wasser, um die Reaktion zu starten, und lassen Sie sie 16 Stunden lang bei RT unter Schutzgas fortzusetzen.
   HINWEIS: Nach der Zugabe von L-Natriumascorbat, wird Reaktionsfarbe von hellgrün bis dunkelbraun zu verschieben, wie in 3A-B gezeigt.
   HINWEIS: Die Reaktion kann über 16 Stunden weiter, aber es wird die Länge der PEG Bürsten nicht wesentlich erhöhen.

Abbildung 3. Einleitung SI-ATRP. (A) Einleitung der Reaktion und (B) anschließende Farbänderung nach Zugabe von L-Natriumascorbat. (C) Mikroskopische Aufnahme von mikroDeckGlas Oberfläche folgenden SI-ATRP Verfahren. Maßstabsleiste 1 mm.

4. Entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Schenk-Kolben und spülen mit Ethanol, Wasser und Ethanol und trocken unter einem leichten Stickstoffstrom.
   HINWEIS: Nach SI-ATRP, sollten Oberflächenmodifikationen für das Auge sichtbar sein und kann, wie in 3C abgebildet und unter einem Mikroskop untersucht werden.
   Anmerkung: Dies ist die einfachste Methode, um die Genauigkeit der Test testen, wie es entfällt die Notwendigkeit, die Substrate Immunfärbung.

5. Azid Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains

1. Legen Sie die mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
2. 6 ml N, N-Dimethylformamid (DMF), enthaltend 100 mM Natriumazid in die Reaktionsflasche. Pflegen diese Reaktion bei 37 ° C für 24 Stunden.
   Hinweis: Behandeln DMF nur in einer chemischen Abzugshaube. Vorsicht beim Abwiegen Natriumazid.
3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

6. Passivierung von Brom Funktionalisierte PEGMEMA Chains

1. Zeigen mikrostrukturiert Deckglas in 20 ml Glasreaktionsgefäße.
2. 6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), die 100 mM Ethanolamin und 300 mM Triethylamin zu der Reaktionsflasche. Halten diese Reaktion bei 40 ° C für 24 Stunden.
   Hinweis: Behandeln DMSO, Ethanolamin und Triethylamin nur in einer chemischen Abzugshaube.
3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikro coverslide aus dem Reaktionsgefäß gründlich mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

7. R-mCP der Innenring und SI-ATRP von PEGMEMA

1. Durchführung R-mCP Schritte wie zuvor in den Schritten 3.2 und 3.6 - 3.12, Substitution eines PDMS-Stempel mit 300 um ID und 600 um Außendurchmesser vorstehenden Ringräume, so dass die Ringräume mit kleineren Merkmale sind in den zuvor mikrostrukturiert Ringräume angeordnet.
   HINWEIS: Die Druckschwelle für diese Briefmarke ist 132,0 kPa. Wie bereits erwähnt, werden diese Druckeinstellungen für wobei die Stempelfunktionen in diesem Experiment verwendet optimiert.
2. Führen Sie SI-ATRP Schritte wie zuvor in den Schritten 4.1 beschrieben - 4.4.

8. Acetylen Funktionalisierung von mikrostrukturierten PEGMEMA Chains

1. Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
2. 6 ml DMSO, enthaltend 100 mMPropargylamin in die Reaktionsflasche. Halten Sie diese Reaktion bei RT für 24 h.
   Hinweis: Behandeln DMSO und Propargylamin nur in einer chemischen Abzugshaube.
3. Nach Abschluss entfernen Sie die mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß und spülen mit Ethanol und dann mit Wasser und trocken unter einem Stickstoffstrom.

9. Kupferkatalysierte "Click" Biotinylierung von Acetylen Abgebrochene PEGMEMA Chains

1. Zeigen mikroDeckGlas in einem 20 ml Glasreaktionsflasche.
2. 6 ml Kupfersulfat (15 mM) / Tris [(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v Wasser / DMF) enthalten 562 uM Azid-PEG ₄ -Biotin Konjugat in die Reaktionsflasche. Mit 1,2 ml L-Ascorbinsäure (0,15 mM) in Wasser zu der Mischung, um die Reaktion zu initialisieren.
3. Bubble Stickstoff durch die Reaktionslösung für 10 sec, versiegeln die Phiole mit Parafilm und für 24 h bei RT reagieren.
4. Nach completion entfernen mikroDeckGlas aus dem Reaktionsgefäß, mit Wasser abspülen und legen Sie sie in einem 12-Well-Polystyrolschale.

10. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Acetylengruppen

1. Block mikroDeckGlas in DPBS (3% Eselserum) 1 h bei RT. Färbung für biotinylierte Acetylengruppen mit Streptavidin-546-Konjugat (2 ug / ml) in DBP (3% Eselserum in PBS) für 2 h bei RT.
2. Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal mit DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln.
   ANMERKUNG: Abbildung 4B zeigt ein Bild der Folie, nach dieser Schritt abgeschlossen ist.

11. Kupferfreie "Click" Biotinylierung von Azid Abgebrochene PEGMEMA Chains

HINWEIS: Wenn gewünscht, kann dieses Substrat Modifikationsschritt in situ während der Zellkultur durchgeführt werden.

1. Lassen mikroDeckGlas in 12-Well-polystyrene Gericht folgenden DBPs spült.
2. 2 ml DBP (oder Zellkulturmedium), enthaltend 20 & mgr; M-PEG DBCO ₄ Biotin und lassen diese Reaktion für 24 h bei RT weiter (oder bei 37 ° C in einem Brutschrank).
3. Nach Abschluss gründlich mikroDeckGlas 5 mal mit DPBS (oder einfach führen Sie einen Medienwechsel).

12. Immunfluoreszenz-Nachweis von biotinylierter Azidgruppen

1. Färbung für biotinylierte Azidgruppen mit Streptavidin-488-Konjugat (2 ug / ml) in 2 ml DPBS (3% Eselserum) für 2 h bei RT.
2. Spülen mit Mikrodeckglas 5 mal in DPBS für 10 min unter leichtem Schütteln.
3. Bildmikrodeckglas mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskops. 4A-C zeigt Bilder der Folie, nach diesem Schritt abgeschlossen.
   HINWEIS: Bei der Verwendung von Substraten für die Gewebekultur-Assays, überspringen Abschnitte 10 und 12 dieses Protokolls. Nach der gewünschten degree Funktionalisierungsgrad sterilisieren entworfen Deckglas durch Spülen beide Seiten mit 100% Ethanol und Trocknen unter einem Stickstoffstrom. Die Objektträger in einer sterilen Sicherheitswerkbank und spülen Sie die Objektträger mit PBS fünfmal, bevor mit Zellaussaat und Kultur voran.

Results

Der Einsatz von manuellen Ausrichtung mCP Techniken, um Kultursubstrate mit Arrays von PEG-gepfropft Bürsten mit orthogonaler funktionalisiert Engineer "klicken Sie auf" Chemie hat in früheren Arbeiten ⁶ nachgewiesen. Allerdings bietet diese minimale Steuerung der Musterausrichtung und führt oft zu einer Überlappung von funktionalisierten Bereichen. Hier wird eine neue R-mgr; CP-System verwendet, um diese Beschränkung zu überwinden, und ihre Fähigkeit, genau Muster eine Anordnung von PEG Bürstenringräume mit ...

Discussion

Ideale Substrate für das Tissue Engineering Bioinspiriertes würde und dadurch die räumliche Verteilung der kritischen bioaktiven Liganden innerhalb der nativen Geweben zu rekapitulieren. Sie würden auch dynamische Eigenschaften besitzen, die zeitliche Änderungen der Liganden und die räumlichen Muster in der sie präsentiert gerichtet Morphogenese ermöglichen und räumlich begrenzte Induktion von Zellschicksal zu ermöglichen. Herstellung solcher Substrate erfordert die Immobilisierung von mehreren biochemischen Signale in ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Auf Wunsch sind höherwertige Modelle mit erhöhter Präzision erhältlich.
(Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan	Gelest	SIT8174.0	VORSICHT, Sollte nur in einem chemischen Abzug gehandhabt werden. Bei der Silanisierung von Wafern sollte niemand die Haube betreten, bis das gesamte Silan verdampft ist.
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Entgasen Sie Lösungen vor der Verwendung gründlich durch Vakuumbelichtung. Alternative Kits wie Kit 182 sind akzeptabel.
24 mm x 50 mm #1 Deckglas-Objektträger	Fisher Scientific	48393106	Diese können von einer Reihe von Anbietern mit unterschiedlichen Abmessungen erworben werden, um den Anforderungen gerecht zu werden.
CHA-600 Telemark Elektronenstrahlverdampfer	Telemark	SEC-600-RAP	Erfordert eine spezielle Schulung.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST&
omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrat	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Bei -20 μC lagern. Andere ATRP-Initiatoren können als diese R-& mu verwendet werden. Die CP-Plattform ist auf alle Mikrostrukturierungsmodalitäten anwendbar.
Schlenk Tube Flask 50 ml	Synthware	60003-078	Benötigt Gummistopfen mit Membran.
Poly(ethylenglykol)-methylethermethacrylat	Sigma Aldrich	447943	Versand mit MEHQ- und BHT-freien readical-Inhibitoren.
Methanol (ACS-zertifiziert)	Fisher Scientific	A412-4	VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.
Kupfer(II)-bromid	Sigma Aldrich	437867	VORSICHT, begrenzen Sie die Exposition mit chirurgischer Maske.
2,2'-Bipyridin	Sigma Aldrich	D216305	VORSICHT, Exposition mit chirurgischer Maske begrenzen.
Natrium-L-Ascorbat	Sigma Aldrich	A4034
20 ml Szintillationsfläschchen aus Borosilikatglas	Fisher Scientific	03-340-4E
Natriumazid	Sigma Aldrich	S2002	VORSICHT, Begrenzen Sie die Exposition mit chirurgischer Maske.
N,N-Dimethyformamid	Sigma Aldrich	227056	VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.
Ethanolamin	Sigma Aldrich	398136	VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.
Triethylamin	Sigma Aldrich	T0886	VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.
Dimethylsulfoxid	Sigma Aldrich	276855	VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.
Propargylamin	Sigma Aldrich	P50900	VORSICHT, nur im chemischen Abzug handhaben.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	VORSICHT, nur in chemischem Abzug handhaben.
Azid-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilisiert in DMF
Kupfer(II)-sulfat	Sigma Aldrich	C1297	VORSICHT, Exposition mit chirurgischer Maske begrenzen.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbinsäure	Sigma Aldrich	A7506
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Invitrogen	14190144
Eselsserum	Sigma Aldrich	D9663	Mit Eselserum kontaminierte Gegenstände gelten als biologisch gefährliches Material und sollten entsprechend entsorgt werden. Verschiedene andere Verbindungen (z.B. BSA) stehen zur Verfügung und dienen diesem Zweck.
12-Well-Polystyrolplatte	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Platten können von einer Reihe von Lieferanten mit unterschiedlichen Abmessungen erworben werden.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilisiert in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat	Life Technologies	S-11223	Solubilisiert in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 Konjugat	Life Technologies	S-11225	Solubilisiert in PBS
Nikon A1-R Konfokalmikroskop	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	Ein Epifluoreszenzmikroskop reicht aus, um funktionalisierte mikrostrukturierte Substrate abzubilden.