Die periodische Säure-Schiff-Färbung ist eine Technik, die den Polysaccharidgehalt von Geweben sichtbar macht. Dieser Artikel zeigt das periodische Säure-Schiff-Färbeprotokoll, das für die Anwendung auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes angepasst ist, die aus menschlichem venösem Blut gereinigt wurden. Solche Proben werden für Lymphozyten und andere weiße Blutkörperchen des Immunsystems angereichert.
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Methodenartikel
Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die periodische Säure-Schiff-Färbung (PAS) ist eine immunhistochemische Technik, die bei Muskelbiopsien und als diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet wird. Polysaccharide wie Glykogen, Glykoproteine und Glykolipide färben sich hellmagentafarben, was es einfach macht, positive und negative Zellen im Gewebe aufzuzählen. In Muskelzellen wird die PAS-Färbung verwendet, um den Glykogengehalt in verschiedenen Arten von Muskelzellen zu bestimmen, während in Blutzellproben die PAS-Färbung als diagnostisches Instrument für eine Vielzahl von Erkrankungen erforscht wurde. Blut enthält einen Anteil an weißen Blutkörperchen, die zum Immunsystem gehören. Die Vorstellung, dass Zellen des Immunsystems Glykogen besitzen und es als Energiequelle nutzen, ist bisher wenig erforscht. Hier beschreiben wir eine angepasste Version des PAS-Färbeprotokolls, die auf mononukleäre Immunzellen aus dem peripheren Blut aus menschlichem venösem Blut angewendet werden kann. Es wurden kleine Zellen mit PAS-positiven Granulaten und größere Zellen mit diffuser PAS-Färbung beobachtet. Die Behandlung von Proben mit Amylase hebt diese Muster auf und bestätigt die Spezifität der Färbung. Eine alternative Technik, die auf enzymatischem Aufschluss basiert, bestätigte das Vorhandensein und die Menge an Glykogen in den Proben. Dieses Protokoll ist nützlich für Hämatologen oder Immunologen, die den Polysaccharidgehalt in Lymphozyten aus dem Blut untersuchen.
Einleitung
Perjodsäure Schiff (PAS) -Färbung eine immunohistochemische Technik, die weit verbreitet in der Muskel Forschung und Diagnostik eingesetzt wird. Es wird auch als ein diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet. Diese Technik funktioniert, indem Periodsäure-Lösung zu der Probe, die innerhalb der Polysaccharid Schaffung Aldehydgruppen, die mit dem farblosen Schiffs-Reagenz, wodurch eine tiefmagenta Produkt reagieren Einheiten oxidiert. Die Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Fleck macht nichts mit Polysacchariden magenta, einschließlich Glykogen, Glycoproteine, Glycolipide, Mucinen, oder andere Moleküle mit Polysaccharid-Gruppierungen.
PAS-Färbung wird oft verwendet, um Glykogenspiegel in Muskelfasern messen. Muskeln Gewebeschnitte sind für die Technik, wenn sie fest an dem Schieber aushalten mehrere Wasch- und Färbeschritte. Glykogen ist den meisten in schnell kontra vorhanden Typ-II-Muskelfasern, die einen hohen Bedarf habenfür die schnelle Produktion von ATP Glykogen für maximale Leistung 1,2 erfordern. Glycogen ist ein verzweigtes Polymer von Glucose, die in freie Glucose durch die Wirkung von Glycogenphosphorylase-Enzyme abgebaut werden können. In Zeiten der Ruhe und Nahrungsversorgung, wird Glykogen durch den Prozess der Glykogenese aufgefüllt, während in Zeiten der Mangelernährung oder Hochenergiebedarf; Glykogen in Glukose durch Glykogenolyse gebrochen. Bereits ab den 1950er Jahren Kliniker Wissenschaftler haben erforscht PAS-Färbung auf Blutproben Glykogengehalt bei verschiedenen Erkrankungen 3-7 analysieren. Zum Beispiel bei Morbus Pompe-einer bonafide Glykogenspeicher krankheits- weißen Blutkörperchen sammeln sich große Mengen an Glykogen, die wesentlich von gesunden Kontrollen 8 unterscheidet.
Dieses Video-Artikel beschreibt eine angepasste Version von PAS-Färbung für den Einsatz in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) Proben von venösem Blut von gesunden Probanden. PBMCs enthalten hauptsächlich Lymphozyten T-Lymphozyten und B-Lymphozyten-Familien, wie auch andere Immunzellen, wie NK-Zellen und Monozyten. Der erste Reinigungsschritt entfernt Erythrozyten, Neutrophilen, Granulozyten und andere. Diese Technik liefert Daten zu einer konzentrierten Anteil der Lymphozyten sich die Robustheit Aufzählung von PAS-positiven Zellen im Vergleich zur Verwendung von Vollblutabstrichen.
Abb. 1: Schritt für Schritt Methodik der PAS-Färbung auf PBMC (A) Zunächst wird Isolierung von PBMC durch Ficoll Gradienten erreicht, zeigt der linken Seite die Vorbereitung vor dem Zentrifugieren, zeigt sie nach der Zentrifugation im rechten Feld, wo die Speckhaut, die den PBMC ist in der Mitte des Rohres beobachtet. (B) Isolierte PBMC werden auf den Objektträger unter Verwendung von Formalin-ethanol Fixierungslösungen festtion. Der Schieber wird sanft mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche gespült. (C) Der Objektträger wird dann in einem 100 ml-Becherglas zur Hälfte mit Amylase-Lösung gefüllt, die Glykogen auflöst platziert. Der Objektträger wird vorsichtig gespült. (D) Der Objektträger wird mit Perjodsäure-Lösung, wobei die Oxidation von Sacchariden erfolgt behandelt. Die Objektträger werden schonend gespült; Dies wird das überschüssige Periodsäure zu entfernen und Beenden des Oxidationsschrittes. (E) Wenn der Schiff'schen Reagenz auf den Objektträgern zu, wird es mit Aldehyden während der Oxidationsstufe erstellt reagieren. Dieser farblose Reagenz wird dann in einem tiefrote magenta Produkt führen. Die Objektträger werden schonend gespült, das überschüssige Schiff-Reagenz zu entfernen.
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Protokoll
Forschung mit menschlichen Blutproben wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 10000618. die Arbeit an dem Maus-Muskel wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 2010BERG zugelassen.
1. PBMC Isolierung aus Vollblut
HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang in einer Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik und hersteller sterilisiert Ausrüstung.
- Gießen Sie 10-15 ml Vollblut aus dem heparinisierten (Antikoagulans) Blutentnahmeröhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Für kleinere Blutverschmutzungen, wischen Sie mit ddH 2 O und 70% EtOH mit Reinigungstuch.
- Verdünne das Blut in dem konischen Rohr an einen 1: 1-Verhältnis mit Phosphatpuffer-Saline (PBS 1x), pH 7,4. Stellen Sie sicher, dass die maximale Gesamtmenge ist 30 ml nicht überschreiten.
- Mischen Sie vorsichtig mit einem serologische Pipettenpistole blasenfrei.
HINWEIS: durch Umdrehen des Röhrchens, um Blut zu vermeiden eine nicht mischenccumulation in der Kappe und nachfolgende Einsickern während der Zentrifugation. - Hinzufügen 13 ml Ficoll-Paque (siehe Materialien und Geräte-Tabelle), in ein neues konisches Rohr 50 ml Kapazität. Halten Sie das Rohr aufrecht im Rack.
- Mit Hilfe einer Transferpipette, nehmen verdünnte Blut, berühren Sie die Transferpipettenspitze an der Innenwand der Röhre in der Nähe der Spitze. Mit langsamen und stetigen Druck, übertragen das Blut entlang der Innenwand des Rohres bildet eine Blutschicht, die auf der Oberseite des Saccharose-Schicht. Führen Sie diesen Schritt so oft, bis alle Blut übertragen wurde.
- Das Röhrchen verschließen und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 700 · g in einer Schaukel Rotor mit mittleren Beschleunigungssatz bis 5, und Verzögerung auf Null gesetzt.
- Langsam nehmen Sie das Rohr und ohne die Schichten zu stören, nehmen Sie es zurück zu der Biosicherheitswerkbank.
- Die Buffy-Coat (dünne weiße Schicht bedeckt), wobei PBMCs werden, zwischen dem PBS / Plasma ein gelegt sorgfältig sammelnnd ficoll Schichten mit einer Transferpipette. Vermeiden Sammeln Saccharoseschicht und nicht die Schicht roter Blutkörperchen stören.
- Übertragen Sie die Buffy-Coat in eine neue 50 ml sterilen konischen Rohr. Es kann mehrmals der Wiederholung von Schritt 1.8, alle PBMC sammeln zu nehmen.
- In PBS pH 7,4 in das Röhrchen mit der PBMC und füllen Sie bis zur 45 ml-Marke. Schütteln Sie Rohr gründlich. Nicht mit dem Vortex.
- Waschen Sie 1: Zentrifuge für 15 Minuten bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung bis 9 eingestellt Bildung eines Pellets aus PBMCs Beachten Sie am unteren Rand der konischen Rohr.
- Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in einem Kunststoffbecher mit 10 ml Bleichmittel.
- Lösen Zellpellet vorsichtig "Abstich" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex.
- Zugeben von 25 ml frischer PBS pH 7.4 mit dem Rohr. Wenn mehr als ein Rohr bearbeitet wird, bündeln die Pellets zusammen in diesem Schritt.
- Waschen 2: zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 · g with sowohl maximale Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt.
- Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Kunststoffbecher mit einem Schuss Bleichmittel.
- Gently "Rack" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). Nicht mit dem Vortex.
- Zugeben von 25 ml frischer PBS zu dem Rohr.
- Nehmen Sie 50 ul der Zellen und Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Lebensfähigkeit Zahl.
- In die gleiche Menge (50 ul) von Trypanblau (a Lebensfähigkeit Färbung) und Pipette auf und ab, um sanft zu mischen.
- Nehmen Sie 10 ul und überträgt es auf einem Hämocytometer, um die Lebensfähigkeit der Zellen pro ml zu überprüfen. Nehmen die Anzahl der Zellen / ml.
- Nehmen Sie die gewünschte Menge an Zellen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 min bei 480 xg sowohl mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung auf 9 gesetzt.
- Entsorgen Sie die PBS (Überstand) in den Becher mit Bleichmittel.
- Gently "Rack" gegen einen gewellten Oberfläche (dh leere Rack). In 80 ul PBS in die Röhre.
2. Machen Sie die PBMC Slide
- Platzieren 80 ul der Zellen auf einen Objektträger. Schmieren Sie das Drop mit Hilfe von einer anderen Folie oder stellen Sie 2 Tropfen von 40 ul jeweils an beiden Enden des Schlittens.
- Lassen Sie Folie in der biologischen Sicherheitswerkbank, um zu trocknen. Beschriften Sie die Folie mit einem Bleistift auf der mattierten Seite.
3. Befestigung der Proben auf den Objektträger
- Bereiten Sie die Fixierungslösung durch Mischen von 0,5 ml 37% Formaldehyd und 4,5 ml 99% Ethanol.
- Nachdem die Folien getrocknet sind, nehmen Sie 2 ml der frisch zubereiteten Fixierlösung und gießen Sie sie auf der Folie, so dass die gesamte Oberfläche der Folie bedeckt ist.
- Verlassen die Lösung auf den Objektträger für 1 min. Spülen Sie den Schieber für 1 Minute mit Leitungswasser und lassen Sie es an der Luft trocknen.
4. Erstellen Sie die Amylase-Lösung für Negativkontrolle
- Nehmen 0,25 g Amylase Pulver und in 50 ml Di auflösengestillt Wasser. Füllen Sie die Lösung in einem sauberen 100 ml-Becher.
- Tauchen Sie die Folie in den Becher, so dass die Hälfte der Folie erhält die Behandlung und die andere Hälfte bleibt unbehandelt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur (Abbildung 1 C) inkubieren.
- Notieren Sie sich auf der Seite des Schlittens erhält den Amylase-Behandlung. Ziehen Sie eine Linie auf der Rückseite der Folie, die die Grenze zwischen der Behandlung und Kontrolle.
- Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O, um die Amylase-Lösung zu entfernen und die Folie an der Luft trocknen.
5. Führen Sie Periodic Acid Schiff (PAS) Färbung und Imaging
HINWEIS: PAS Reagenzien sind giftig beim Einatmen und korrosiv sind, so dass die Schritte müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden, und die Abfallprodukte müssen fachgerecht gemäß gültiger Richtlinien entsorgt werden.
- Stellen Sie den Schieber auf eine flache Oberfläche und gießen 1,50-2,00 ml Perjodsäure-Lösung auf die Probe. Incubate für 5 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Folien in mehreren Ladungen destilliertem Wasser.
- Gießen 1,50-2,00 ml Schiffs-Reagenz auf den Objektträger, Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser für 5 Minuten und lassen Sie es an der Luft trocknen.
- Übernehmen 10 ul Eindeckmittel auf dem Objektträger geben und mit zwei kleinen Deckgläser oder gelten 50 ul und Nutzung einer großen Deckglas.
- Bewerben klaren Nagellack auf den Kanten des Deckglases, lassen Sie über Nacht trocknen.
6. Rufen Sie Bilder mit dem Fernglas Lichtmikroskop Mit dem 100X Ziel
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Ergebnisse
Um die Reagenzien und grundlegende Technik zu validieren, wurde PAS-Färbung nach Angaben des Herstellers auf der Maus Soleusmuskel Abschnitten durchgeführt. Die Färbung wurde am gleichen Tag wie die Opfer gemacht und im letzten Schritt der Färbung wurden die Schnitte mit Xylol fixiert. Der M. soleus ist bekannt, enthalten ~ 35% Glykogen-positiven Zellen 9. Die gefärbten Muskelzellen angezeigt zwei verschiedene PAS-positiven Features-punktförmige Granulat in der Zelle, und eine durchgehende Linie Demarkieren d...
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Diskussion
Die kritischen Schritte dieses Video Artikel waren beim Waschen und Amylase-Behandlung der Zellen. Beim Waschen der Objektträger wurde der entscheidende Schritt mit einem Kunststoff squeezable Waschflasche und ließ das Wasser sanft durch die Probe auf dem Objektträger laufen und nicht direkt mit dem Ziel auf die Proben. Selbst die geringste direkte Wasserdruck würde die Zellen veranlassen, kommen aus der Folie. Ein weiterer wichtiger Schritt war, um dieselbe Folie für ± Amylase Bedingungen. Nachdem die PBMCs mit dem Sch...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des NSERC Discovery Program mit der Fördernummer RGPIN 418522-2013 unterstützt. Wir danken R. Kilgour für die hilfreichen Diskussionen und Katelin Gresty und Dr. A. Berghdal für die Bereitstellung der Mausmuskelschnitte.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Periodsäure-Schiff-Kit |  Sigma-Aldrich | 395B | Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Die Materialien in diesem Kit sind toxisch und gesundheitsschädlich. Vorsicht ist geboten. |
| α-Amylase aus Schweinepankreas | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| Stereo-Mikroskop | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glykogen-Assay-Kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Nichtionisches synthetisches Polymer von Saccharose. |
| Zentrifuge | Für die PBMC-Isolierung wurden Schwenkköbel verwendet. |
Referenzen
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