Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Zusammenfassung

Die periodische Säure-Schiff-Färbung ist eine Technik, die den Polysaccharidgehalt von Geweben sichtbar macht. Dieser Artikel zeigt das periodische Säure-Schiff-Färbeprotokoll, das für die Anwendung auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes angepasst ist, die aus menschlichem venösem Blut gereinigt wurden. Solche Proben werden für Lymphozyten und andere weiße Blutkörperchen des Immunsystems angereichert.

Zusammenfassung

Die periodische Säure-Schiff-Färbung (PAS) ist eine immunhistochemische Technik, die bei Muskelbiopsien und als diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet wird. Polysaccharide wie Glykogen, Glykoproteine und Glykolipide färben sich hellmagentafarben, was es einfach macht, positive und negative Zellen im Gewebe aufzuzählen. In Muskelzellen wird die PAS-Färbung verwendet, um den Glykogengehalt in verschiedenen Arten von Muskelzellen zu bestimmen, während in Blutzellproben die PAS-Färbung als diagnostisches Instrument für eine Vielzahl von Erkrankungen erforscht wurde. Blut enthält einen Anteil an weißen Blutkörperchen, die zum Immunsystem gehören. Die Vorstellung, dass Zellen des Immunsystems Glykogen besitzen und es als Energiequelle nutzen, ist bisher wenig erforscht. Hier beschreiben wir eine angepasste Version des PAS-Färbeprotokolls, die auf mononukleäre Immunzellen aus dem peripheren Blut aus menschlichem venösem Blut angewendet werden kann. Es wurden kleine Zellen mit PAS-positiven Granulaten und größere Zellen mit diffuser PAS-Färbung beobachtet. Die Behandlung von Proben mit Amylase hebt diese Muster auf und bestätigt die Spezifität der Färbung. Eine alternative Technik, die auf enzymatischem Aufschluss basiert, bestätigte das Vorhandensein und die Menge an Glykogen in den Proben. Dieses Protokoll ist nützlich für Hämatologen oder Immunologen, die den Polysaccharidgehalt in Lymphozyten aus dem Blut untersuchen.

Einleitung

Perjodsäure Schiff (PAS) -Färbung eine immunohistochemische Technik, die weit verbreitet in der Muskel Forschung und Diagnostik eingesetzt wird. Es wird auch als ein diagnostisches Werkzeug für Blutproben verwendet. Diese Technik funktioniert, indem Periodsäure-Lösung zu der Probe, die innerhalb der Polysaccharid Schaffung Aldehydgruppen, die mit dem farblosen Schiffs-Reagenz, wodurch eine tiefmagenta Produkt reagieren Einheiten oxidiert. Die Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Fleck macht nichts mit Polysacchariden magenta, einschließlich Glykogen, Glycoproteine, Glycolipide, Mucinen, oder andere Moleküle mit Polysacchari....

Protokoll

Forschung mit menschlichen Blutproben wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 10000618. die Arbeit an dem Maus-Muskel wurde von Concordia University Ethics Review Board, Zertifikat-Nummer 2010BERG zugelassen.

1. PBMC Isolierung aus Vollblut

HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang in einer Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik und hersteller sterilisiert Ausrüstung.

1. Gießen Sie 10-15 ml Vollblut aus dem heparinisierten (Antikoagulans) Blutentnahmeröhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Für kleinere Blutverschmutzungen, wischen Sie mit ddH ₂ O und 70....

Ergebnisse

Um die Reagenzien und grundlegende Technik zu validieren, wurde PAS-Färbung nach Angaben des Herstellers auf der Maus Soleusmuskel Abschnitten durchgeführt. Die Färbung wurde am gleichen Tag wie die Opfer gemacht und im letzten Schritt der Färbung wurden die Schnitte mit Xylol fixiert. Der M. soleus ist bekannt, enthalten ~ 35% Glykogen-positiven Zellen ^9. Die gefärbten Muskelzellen angezeigt zwei verschiedene PAS-positiven Features-punktförmige Granulat in der Zelle, und eine durchgehende Linie Demarkieren d.......

Diskussion

Die kritischen Schritte dieses Video Artikel waren beim Waschen und Amylase-Behandlung der Zellen. Beim Waschen der Objektträger wurde der entscheidende Schritt mit einem Kunststoff squeezable Waschflasche und ließ das Wasser sanft durch die Probe auf dem Objektträger laufen und nicht direkt mit dem Ziel auf die Proben. Selbst die geringste direkte Wasserdruck würde die Zellen veranlassen, kommen aus der Folie. Ein weiterer wichtiger Schritt war, um dieselbe Folie für ± Amylase Bedingungen. Nachdem die PBMCs mit dem Sch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Periodsäure-Schiff-Kit	Sigma-Aldrich	395B	Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Die Materialien in diesem Kit sind toxisch und gesundheitsschädlich. Vorsicht ist geboten.
α-Amylase aus Schweinepankreas	Sigma-Aldrich	A3176
Stereo-Mikroskop	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glykogen-Assay-Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nichtionisches synthetisches Polymer von Saccharose.
Zentrifuge			Für die PBMC-Isolierung wurden Schwenkköbel verwendet.