Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FIM التصوير وFIMtrack: اثنان أدوات جديدة تسمح عالية الإنتاجية والتكلفة تحليل تحرك الفعال

Published: December 24, 2014 doi: 10.3791/52207
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 2, 1
1Institute of Neuro and Behavioral Biology, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, 2Department of Mathematics and Computer Science, Westfälische Wilhelms-Universität Münster
* These authors contributed equally

Summary

FIM هو نظام الرواية، تكلفة التصوير فعالة مصممة لتتبع الأجسام المتحركة الصغيرة مثل C. ايليجانس، المستورقات أو يرقات ذبابة الفاكهة. تم تصميم هذا البرنامج FIMTrack المصاحب لتقديم تحليل البيانات بسرعة وكفاءة. معا، وهذه الأدوات تتيح تحليل الإنتاجية العالية من الصفات السلوكية.

Abstract

تحليل أداء الشبكة العصبية يتطلب قياس موثوق من الصفات السلوكية. منذ سلوك الحيوانات تتحرك بحرية هو متغير إلى درجة معينة، وكثير من الحيوانات لديها ليتم تحليلها، للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية. وهذا بدوره يتطلب بمساعدة الحاسوب الكمي الآلي من أنماط تنقل. للحصول على صور عالية التباين للكائنات شفافة تقريبا وصغيرة تتحرك، وقد تم تطوير تقنية تصوير جديدة على أساس بالاحباط الانعكاس الكلي الداخلي دعا FIM. في هذا الإعداد، هي مضيئة الحيوانات فقط مع ضوء الأشعة تحت الحمراء في موقف محدد جدا من ملامسة سطح الزحف الأساسي. نتائج هذه المنهجية في النقيض من الصور عالية جدا. بعد ذلك، تتم معالجة هذه الصور عالية التباين باستخدام أنشئت كفاف خوارزميات تتبع. وبناء على هذا، قمنا بتطوير البرمجيات FIMTrack، والذي يعمل على استخراج عدد من الميزات المطلوبة لوصف كميا مجموعة كبيرة ومتنوعة للتنقلالخصائص. خلال تطوير مجموعة من البرامج هذه، ركزنا جهودنا على بنية مفتوحة المصدر مما يتيح إضافة سهلة للمزيد من الوحدات. ويعمل البرنامج منصة مستقلة ويترافق مع واجهة المستخدم الرسومية بديهية توجيه المستخدم من خلال تحليل البيانات. يتم إعطاء كل القيم المعلمة تنقل في شكل ملفات CSV السماح يحلل المزيد من البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، عارض نتائج دمجها في تتبع البرنامج يوفر الفرصة لاستعراض تفاعلي وضبط الإخراج، كما قد تكون هناك حاجة خلال التكامل التحفيز. ويتجلى قوة FIM وFIMTrack من خلال دراسة تحرك من يرقات ذبابة الفاكهة.

Introduction

معظم الحيوانات لديها القدرة على التحرك بطريقة متطورة للغاية والسيطرة عليها. فك أساس الوراثية السيطرة تنقل الأساسية وهي ملزمة لتقييم كمي لأنماط سلوكية مختلفة. وفي هذا الصدد، يمكن أن ذبابة الفاكهة بمثابة نموذج مثالي. تتبع من الطيران بحرية ذبابة الفاكهة ومحيرة 1-4 ولكن الزحف من يرقات ذبابة الفاكهة يحدث في بعدين على سرعة منخفضة نسبيا وبالتالي يمكن رصدها بسهولة. وتستخدم الاجهزة القائمة على الكاميرا جنبا إلى جنب مع الإضاءة المناسبة للحصول على الصور 5. ويعمل كل من الحادث أو الضوء المرسل في التجارب السلوكية 6،7. ولكن نظرا للجسم شبه شفافة من اليرقات وانعكاسات الضوء ممكنة من الزحف سطح التسجيل المؤمنين من الحركات اليرقات يمكن أن يكون تحديا. للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعت بعض الأساليب المعقدة. مؤخرا، تم إدخال الإضاءة الحقل المظلمة لتعزيز الصدارة / تابع الخلفيةراست 8. كبديل للتسجيل القائم على الكاميرا والتصوير الضوئي عدسة أقل وصورة استشعار أقل أدخلت على رقاقة تقنيات اكتساب 9-11.

وقد تم إدخال العديد من البرامج تتبع مؤخرا، بما في ذلك البرمجيات المتاحة تجاريا 12 والعرف الحلول. أمثلة لبرامج تتبع الإنتاجية العالية هي دودة متعدد المقتفي (MWT) 13 و Multianimal المشي والمسار (MAGAT) 8. وقد مشتركة، يمكن تتبع كل من أن الحيوانات متعددة في الساحة الحقل المفتوح واحدة بحيث الحيوانات الاصطدام تؤدي إلى هويات متعددة حيوان جديدة. للتغلب على هذا القيد، تم إدخال الإعداد متعددة جيدا فصل 12 الحيوانات في الآبار الفردية 14. لا يمكن أن يتحقق الكمي الدقيق للتنقل الأفراد واحد باستخدام مرحلة تتبع المنقولة في تركيبة مع المجهر 15. ومع ذلك، كل هذه الأساليب هي إما غير فعالة التكلفة، وعدم إعادة كافيةحل أو قتا أطول من اللازم لارتفاع الإنتاجية phenotyping.

FIM للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير (الطريقة التصوير مقرها FTIR) على أساس بالاحباط انعكاس إجمالي الداخلية (FTIR) 16 (الشكل 1). ويوفر هذا النهج التصوير الجديد على النقيض من ارتفاع غير مسبوق، وحتى يسمح تسجيل متعددة الألوان من الزحف الحيوانات (16). مبدأ الكامنة وراء هذا الأسلوب مفيد وفعال أمرا سهلا. وأغرقت لوحة زجاج الاكريليك مع الضوء (على سبيل المثال، 875 نانومتر الأشعة تحت الحمراء). بسبب مؤشرات الانكسار مختلفة من الزجاج الاكريليك والهواء، وينعكس الضوء تماما على الحدود الزجاج / الهواء. يلاحظ أي تسخين الزجاج الاكريليك 16. إلا إذا الكائنات مع معامل الانكسار أعلى تلمس الجدول غمرت الخفيف، يمكن أن تضيء إدخال هذه الكائنات. إذا كانت الحيوانات تلمس السطح، وينعكس الضوء ويمكن الاستيلاء عليها من أدناه (الشكل 1). ونتيجة لذلك، فقط الاتصاليبدو مجال الحيوانات باعتبارها نقطة مضيئة، والذي يسمح التصوير مفصل مع خلفية سوداء الشاملة. وهكذا، FIM التصوير يسمح لتسجيل الأفلام مثالية لخوارزميات رؤية الكمبيوتر. استخدام بسيط وقوي من FIM يجلب الآن مفصل تحليل إنتاجية عالية من السلوك الحيواني معقدة في متناول اليد ويمكن استخدامها لدراسة معالجة المعلومات: على سبيل المثال، الشم 8، 16؛ رؤية 17 أو 18 thermosensation.

الشكل (1)
الشكل 1. الإعداد FIM مع التكامل الحرارة التحفيز والمبادئ الفيزيائية الأساسية. (A) الإعداد FIM. يمكن أن ينظم شدة الإضاءة في اللوحة الأمامية. (B) لتقديم التحفيز الحرارة، ورسمت لوحة الألومنيوم الأسود، مع perfused المياه الباردة والساخنة في كلا الجانبين، يتم وضع 2 مم فوق سطح أجار التينفسه هو 2 مم. يتم تأسيس التدرج على لوحة المبرد الحرارة وآغار من الاختلافات في درجة الحرارة (C) والمبدأ المادي للبالإحباط الانعكاس الكلي الداخلي: مضاءة لوحة زجاج الاكريليك بواسطة الأشعة تحت الحمراء. θ 1، 2 θ، وθ 3 تشير إلى زوايا انعكاس الضوء. ن A، ن 1، ن 2 و 3 ن دلالة على مؤشرات الانكسار من الهواء، زجاج الاكريليك، وأجار واليرقة على التوالي وتحقيق المساواة ن A <ن 1 <ن 2 <ن 3. بسبب الانكسار، تتغير زاوية انعكاس أثناء المرحلة الانتقالية. إذا كانت الزاوية أقل من الزاوية الحرجة، لا ينعكس ضوء بعد الآن، يمكن أن تمر عبر طبقات ويمكن التقاط من الأسفل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليرة سوريةectrum من العمليات التي يمكن تحليلها من قبل FIM واسع. دون أي تعديلات أخرى، والتصوير FIM يمكن استخدامها لمراقبة جميع مراحل اليرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 5B) أو يمكن استخدامها لمتابعة القدم مطبوعات عالية من الكبار ذبابة الفاكهة 19. وبالمثل، مسارات C. ايليجانس أو حركة الديدان المفلطحة مستورقة يمكن تسجيلها بسهولة (الشكل 5C). ويبدو حتى تحليل الفطرية خوط أو الشعر الجذر النمو ممكنا 19. لدينا في الإعداد FIM الحالي، يتم دمج 4 × 16 الثنائيات الخفيفة الأشعة تحت الحمراء (IR- المصابيح) إلى 32 × 32 سم 2 لوحة زجاج الاكريليك، ودعا الجدول تتبع (الشكل 1). يتم ضبط شدة IR-المصابيح تبعا لوزن الأشياء على الطاولة تتبع، والذي يمكن القيام به بسهولة عن طريق التحكم الجزئي متصلا الدوائر عن طريق نبض العرض التحوير (PWM). FIM ينتج النقيض من الصور عالية جدا على طائفة واسعة من شدة الإضاءة. الأهم من ذلك أنها جنرالerates نتائج ممتازة في منخفض بالفعل irridation الأشعة تحت الحمراء بشكل عام.

يتم وضع الكاميرا مع فلتر الأشعة تحت الحمراء أسفل الجدول تتبع، والذي يسمح التكامل من المحفزات إضافية في الإعداد. المحفزات الحرارة يمكن تطبيقها بسهولة عن طريق لوحة المبرد الحرارة ويتم تطبيقها المنبهات الخفيفة عن طريق جهاز عرض LCD. كما عطور يمكن احتواؤها في التدرجات التي كتبها أغطية بسيطة 8. للتجارب التدرج الحرارة، وperfused للوحة المبرد الحرارة مع المياه الباردة والساخنة على كلا الجانبين على التوالي ووضعها 2 مم فوق اليرقات (الشكل 1B).

توليد التباين العالي، والأفلام عالية الجودة يفتح إمكانية للكمبيوتر يعمل بنظام متطور تحليل الصور، وبالتالي نحن تنفذ البرنامج FIMTrack لاستخراج مجموعة كبيرة من الميزات من الصور (الشكل 2). وقد تم تحديد ستة الميزات الأساسية الأولى من كفاف من الحيوان (الشكل 3A). توفر هذه الميزات خط الأساسلمزيد من حساب ستة ملامح الثانوية التي تصف شكل الحيوانات وموقفها في بعض المحفزات في نقطة زمنية معينة (الشكل 3B). حاليا، يتم احتساب تسعة ميزات التعليم العالي التي يتم دمج الجوانب الزمنية وبالتالي تميز تنقل من الحيوان جنبا إلى جنب مع ميزات الابتدائية والثانوية (الشكل 3C).

الشكل 2
الشكل 2. نظرة عامة FIMTrack، وسير العمل حسابي والتمثيل اليرقات. (A) كيفية استخدام FIMTrack. يتم تحميل الصور. يجب تعيين عتبة قيمة الرمادية وعتبات حجم اليرقات تحديد اليرقات واحدة. يجب أن تكون منطقة اليرقات في [الحجم دقيقة، كحد أقصى الحجم]. بدء تتبع من قبل على زر تسليط الضوء عليها. (ب) تتبع سير العمل. بعد النقر فوق الزر ابدأ، وصورة الخلفية هي كاليفورنيا lculated (شدة الحد الأدنى مع مرور الوقت). طالما هناك أطر اليسار، تتم تجزئة اليرقات على أساس عتبة الرمادية وmin- وعتبة ماكس الحجم. لجميع الانقسامات وتحسب تمثيل اليرقات (قارن إلى (C)). ويرتبط كل نموذج جديد لمسار معين إذا كان المسار الصحيح هو متاح. إذا تم الوصول إلى الإطار الأخير، ويتم ذلك يتبع الصيغة النهائية مرحلة ما بعد المعالجة من قبل الجيل الانتاج. (C) تمثيل اليرقات. يتكون الحيوان من الرأس والذيل نقطة (ح و ر). بين هذه النقاط عدد فردي تعسفي من النقاط العمود الفقري ق ط يمكن تعيين نصف قطرها ص ط. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حساب مركز كتلة m والجسم الرئيسي الانحناء γ زاوية. ورسمت العديد من المعلمات الحركة المتعلقة بخطوط الأرجواني. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

س: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
الشكل 3. ميزات تحسب FIMTrack. (A) ميزات الأولية بناء على كفاف من الحيوانات. (B) ميزات الثانوية، استنادا إلى الميزات الأساسية. (C) ميزات التعليم العالي، على أساس الميزات الرئيسية في إطارات متتالية ومدخلات إضافية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: هنا، ويرد استخدام FIM لمفيد تحليل إنتاجية عالية للتنقل اليرقات لفحص في ظروف خالية من الحركة وتحت تأثير حافز الحرارة. تطبيقات أخرى مثل تحليل المحفزات حاسة الشم تنقل المعالين أو التصوير عالية الدقة من السلوكيات المتداول أو غيرها قد تحتاج بعض التغييرات الطفيفة في البروتوكول، والتي يتم توفيرها عند الطلب.

1. مجموعة المتابعة من التجارب

  1. استخدام حوالي 100 اليرقات في التركيب الوراثي في ​​مجموع (بتوقيت 1 ساعة مطلوب) الحصول على قيم ذات مغزى إحصائيا. ملاحظة: في حالة تحتاج عدة تراكيب وراثية يمكن مقارنتها وسجلت في أيام مختلفة، وتسجيل نفس العدد من اليرقات في التركيب الوراثي في ​​اليوم الواحد.
  2. بالنسبة لمعظم التطبيقات، سجل في 10 هرتز لتحليل المعلمة. للتطبيقات عالية التصوير القرار، وتختلف سرعة التصوير إذا لزم الأمر.
  3. لتتبع يرقات العمر الثالث، وإجراء التجارب حوالي 120 ساعة بعد وضع البيض. جعل سوره أن الثقافات ينتج ما يكفي من اليرقات في الفترة التجريبية (انظر 4.3).
  4. لتطبيقات عدم التحفيز، وإعداد سطح الزحف تحتوي على أجار شفافة (انظر القسم 2). لاحتواء اليرقات في نطاق التحفيز للتطبيق التدرج الحرارة، وتحيط مجال الرؤية مع مكره حاجز أجار الملح (انظر القسم 3).
    ملاحظة: قد تتطلب تطبيقات أخرى الأسطح المختلفة.
  5. تأكد من استخدام غرفة مع الظروف البيئية المستمرة (درجة الحرارة، والضوء، وتدفق الهواء، والهواء والرطوبة وغيرها).

2. الزحف تحضير السطح (شفاف آجار)

ملاحظة: في الإعداد FIM يضاف سطح أجار لتوفير سطح الزحف رطبة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يحسن أيضا خصائص الإضاءة.

  1. تغلي 0.8٪ الغذاء الصف أجار في الماء عالى النقاء منزوع الأيونات. لتطبيق فحص إعداد 400 مل.
  2. صب أجار في 50 ° C (اليد الساخنة) على منفصلة 33 سم × 33 سم ميلانلوحة rylic من الزجاج. فإن التوتر السطحي للأجار وبالتالي فإن درجة حرارة تحديد سمك البلاطة أجار. في 50 ° C، ويتم الحصول على ألواح آغار 2 مم. لا تستنهض الهمم بعد الغليان وتصب باستمرار لتجنب الفقاعات. إعداد ألواح آغار جديدة لكل فترة التصوير من حوالي 4 ساعة.
  3. ملء أطباق 6 سم بتري القياسية مع 0.8٪ الحل أجار المتبقية لفرز وتنظيف وروض اليرقات قبل التجربة (1 طبق في التركيب الوراثي).
  4. في حالة الحاجة حاجز أجار مكره لتطبيق، انتقل إلى القسم 3.
  5. تقليم قبالة حوالي 2 سم من محيط بلاطة أجار للحصول على سطح الساحة الطائرة للتسجيل. إزالة أجار الزائد.
    ملاحظة: حجم يعتمد على التطبيق.
  6. نقل لوح أجار إلى الإعداد FIM مباشرة بعد التبريد عن طريق دفع بلطف أجار مزلق على حافة لوحة زجاج الاكريليك.

3. اختياري: إضافة إلى مكره آجار الجدار إلى الحوصلةلينغ السطحية (سولت آجار)

  1. تغلي 2.5٪ الغذاء الصف أجار مع 3 M كلوريد الصوديوم في الماء عالى النقاء منزوع الأيونات. لفحص في التدرج الحرارة إعداد 200 مل.
    ملاحظة: إن حجم يعتمد على التطبيق.
  2. قطع الشق 2 سم واسعة في السابق سكب الزحف سطح المحيط مجال الرؤية (22 × 22 سم).
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة أشكال حاجز مختلفة ومجالات رأي اعتمادا على التطبيق.
  3. ملء درجة مع أجار الملح 0.1-0.3 سم أعلى من سطح تتبع.

4. يطير المناولة

  1. الخلفي الذباب في 25 ° C حاضنة مع ضوء 12 ساعة / دورة الظلام تعديل لآخر تجربة على ذبابة الغذاء القياسية عند 65٪ رطوبة الهواء.
  2. لالصلبان، وتخدير 30 الذباب الإناث البكر و 8 ذكور مع CO 2 وعبر لهم في 130 قارورة ثقافة مل مع 35 مل الغذاء.
    ملاحظة: واحد 130 مل قارورة الثقافة مع 35 مل الغذاء تسفر عن 20-30 لترأكل يرقات العمر الثالثة ضمن فترة التصوير من 4 ساعات. التصوير وتتبع يعمل من أجل جميع مراحل الطور اليرقي.
  3. إسقاط القليل من الماء في قوارير الثقافة لدفع أواخر الطور الثالث حركة اليرقات وجمع أكبر اليرقات من الجدران قنينة باستخدام الفرشاة الصغيرة.
  4. 2-5 دقيقة قبل تسجيل ونقل اليرقات للفيديو واحد إلى بيتري طبق يحتوي على 0.8٪ الغذاء الصف أجار في الماء النقي جدا منزوع الأيونات إلى روض وتنظيفها.

5. ضبط الإعداد FIM التصوير لتسجيلات (غير المحفز الشروط)

  1. ضبط الكاميرا تركيز العدسة وفتحة إذا لزم الأمر. ضبط الوقت التعرض للكاميرا المعنية.
    ملاحظة: لا تحتاج هذه الإعدادات إلى تغيير خلال التجربة.
  2. ضبط شدة الإضاءة للحصول على النقيض جيدة عن طريق التصوير يرقة واحدة.
  3. إبقاء الأوضاع البيئية في ثابت غرفة خلال التسجيلات. تلقي بظلالها على غرفة لعدم إزعاج اليرقات مع ضوء الاتجاه.

6. اختياري: ضبط الإعداد FIM التصوير لتسجيلات (درجة الحرارة تدريجيا التحفيز الشروط)

ملاحظة: الجهاز التدرج الحرارة هو 42 × 42 × 0.2 سم 3 لوحة الألومنيوم مع طلاء أسود لامع ومواد عزل على الموقع العلوي. وperfused للوحة مع المياه من اثنين من دوائر مختلفة متصلة calorifiers / مبردات ومضخات عند كلا الطرفين (انظر الشكل 1B). درجات الحرارة يمكن ان تنظم من -5 إلى +50 درجة مئوية.

  1. بدوره على ساعة جهاز التدرج الحراري 1 قبل التجارب ووضعه فوق الإعداد للسماح بإنشاء الملف الشخصى درجة الحرارة المطلوبة ومكونات للتوازن.
  2. نقل أجار سطح الزحف بحاجز الملح إلى الإعداد.
  3. وضع لوحة المبرد على أجار وضبط التباعد بين لوحة وسطح الزحف إلى 2 ملم (~ 1 مم فوق اليرقات).
  4. إنشاء التدرج الخطي لل0.8 ° ما لا يقل عن C / سم من 34 ° C (حوالي 2 سم من الجدار الفاصل في مجال الرؤية) إلى 18 درجة مئوية (تقريبا 2 سم من حاجز في موقع معاكس في مجال الرؤية) عن طريق تعديل درجة حرارة المياه الدوائر إلى 1 درجة مئوية و 45 درجة مئوية.
    ملاحظة: خصائص مختلفة التدرج من لوحة معدنية تتطلب درجات حرارة مختلفة التي تحتاج إلى التأكد تجريبيا. لا تحتاج هذه الإعدادات إلى تغيير خلال التجارب.
  5. ضبط الإعدادات كما هو موضح في القسم 5.
  6. اترك السطح الزحف للتوازن في الانحدار قبل التجارب لمدة 20 دقيقة. اختبار التدرج في درجة الحرارة مع البيرومتر.
  7. المضي قدما في القسم 8.

7. التصوير FIM (غير المحفز الشروط)

  1. استخدام الفرشاة المبللة صغيرة لجمع بلطف 15 اليرقات من أطباق بتري التعود ونقلها إلى مركز من سطح تتبع. لا يزال نقل الطعام أو أكثر من اللازمالمياه (انظر 7.8).
  2. سجل 1-50 اليرقات على 22 سم × 22 سم منطقة تتبع. استخدام 15 الحيوانات في الفيديو بالنسبة لمعظم التطبيقات الفرز (لأسباب إحصائية تستخدم 100 شخص على الأقل في التركيب الوراثي).
  3. فصل بلطف اليرقات والانتظار لمدة 10-20 ثانية حتى بدأت كل اليرقات للانتقال مباشرة قبل التسجيل.
  4. تسجيل تنقل اليرقات لمدة 2 دقيقة في 10 لقطة في الثانية لشروط عدم التحفيز. استخدام معرض طرابلس الصور غير المضغوطة وتنسيق الإخراج.
  5. أثناء التسجيل، وجمع اليرقات لمقطع الفيديو التالي من قارورة إلى روض لهم الحرجة: لا تخل اليرقات سجلت مع الضوء.
  6. بعد الانتهاء من التسجيل، وإزالة اليرقات مع الفرشاة الكبيرة والتخلص منها وفقا للقواعد السلامة والتشريعات المحلية.
  7. بعد إزالة اليرقات، واستخدام الفرشاة لتنظيف وترطيب سطح الزحف مع الماء منزوع الأيونات النقي جدا.
  8. الحرجة: الحفاظ على سطح رطبة في جميع الأوقات ولكن تجنب مو المفرطisture، والتي يمكن أن ينظر إليه على هالات أو قطرات المحيطة اليرقات في التسجيلات وتخل تتبع.

8. اختياري: التصوير FIM (درجة الحرارة تدريجيا التحفيز الشروط)

  1. بعد تأسيس التدرج في درجة الحرارة (انظر القسم 6)، وإعداد برنامج تسجيل لحظة تسجيل في غضون 20 ثانية بعد وضع اليرقات على سطح الزحف (انظر 8.2) على سبيل المثال، تعيين عدد من لقطة في الفيديو وتحديد مسار الادخار.
  2. رفع لوحة المبرد قليلا ووضع اليرقات في 33 ° C 2 سم من حاجز الملح. الرجوع إلى 6. و7. لمزيد من التعليمات العامة. خفض وحة المبرد مرة أخرى وبدء التسجيل لمدة 3-4 دقائق مباشرة بعد أن بدأت اليرقات للتحرك مباشرة.
  3. بعد الانتهاء من التسجيل، وإزالة اليرقات مباشرة، نظيفة وترطيب السطح. لا تلمس أجار الملح لتجنب انتشار كلوريد الصوديوم.
  4. الحرجة: الحفاظ على سطح رطبة في جميع الأوقات ولكن تجنبالرطوبة الزائدة، والتي يمكن أن ينظر إليه على هالات أو قطرات المحيطة اليرقات في التسجيلات وتخل تتبع.
  5. السماح للسطح أجار للتوازن مرة أخرى بعد ترطيب لمدة 1-2 دقيقة، مع توفير الصور وجمع حيوانات جديدة قبل إعداد للفيديو المقبل. السيطرة على التدرج في درجة الحرارة باستخدام البيرومتر كل 5 أشرطة الفيديو وضبط درجة حرارة الجهاز عند الحاجة (درجة حرارة الماء، والطول، والتوجه س ص فيما يتعلق السطح تتبع).

9. تتبع من اليرقات تنقل

ملاحظة: لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المرفقة لFIMTrack (ملحق). لمخطط تدفق البرنامج انظر الشكل 2.

  1. ضبط المعلمات من أجل التجارب الخاصة باستخدام الخيار معاينة تتبع.
    1. ضبط بكسل لكل سم وفقا لالكاميرا ومجال الرؤية.
    2. ضبط إطارات لكل ثانية بناء على إعدادات الكاميرا.
    3. ضبط عتبات السطوع حتى عشرفي جميع الحيوانات يتم الكشف عنها بشكل صحيح (وتعطى ردود فعل في المعاينة).
    4. ضبط اليرقات عتبات حجم المنطقة. ملاحظة الخيار ردود الفعل في المعاينة: يتم تسليط الضوء الحيوانات احدة باللون الأصفر، اصطدامها اليرقات مظللة باللون الأحمر ويتم إعطاء مساحة كل حيوان في الزرقاء.
  2. بدء تتبع باستخدام الزر في أسفل اليمين.
    ملاحظة: بعد تتبع ناجح، يتم تخزين صورة يقدم المقطوعات اليرقات وملف CSV يحتوي على تنقل والموقف ميزات تحسب في الدليل الصورة.
  3. استخدام نتائج FIM وحدة المشاهد (تحرير> نتائج عارض ...) لاستعراض ويدويا ضبط تتبع النتائج. إذا لزم الأمر، وتحديد المناطق التحفيز لتقييم البيانات فيما يتعلق للنظام التحفيز على سبيل المثال، والزحف التوجه فيما يتعلق التدرج الحراري أو المسافة إلى مصدر الرائحة. لوصف أكثر تفصيلا يرجى استخدام اليدوي (ملحق).

10. تقييم البيانات

  1. استيراد ملف CSV إلى Excel، ماتلاب أو أي برنامج آخر لمزيد من التحليل الإحصائي.

Representative Results

لتصوير عدة كاميرات مختلفة مع خصائص دقة مختلفة تم اختبار (الشكل 4). جميع الكاميرات حيث مجهزة فلتر الأشعة تحت الحمراء المناسب. وفقا لقرار منخفضة من الكاميرا أدنى سعر في هذا الاختبار، ومجال الرؤية يقتصر على 10 سم × 10 سم. تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام 4 ميجا بكسل (MP) وكاميرا. وهذا يؤدي إلى دقة 100 بكسل لكل الثالث الطور طول اليرقات ويسمح لسهولة التعرف الهياكل الداخلية. بالإضافة إلى ذلك، التمعج للحيوان يمكن استخراجها بسهولة (الشكل 4A). ومع ذلك، يمكن للمرء أن لا يزال الحصول على الأفلام عالية التباين باستخدام كاميرات أقل تكلفة، والتي يمكن أيضا أن تكون تحليلها من قبل FIMTrack. باستخدام 1.4 النائب كاميرا مع عمق 8 بت وقرار من 1،392 خ 1،040 بكسل هو حوالي نصف السعر ويسمح قرار من 45 بكسل في الطور الثالث طول اليرقات في مجال الرؤية. رئيس ولكن يمكن الاعتراف بأية الهياكل الداخلية الأخرى (الشكل 4B). تتبع وكشف التمعج هو ممكن ولكن يتم تقليل دقة (الشكل 4B).

مع أرخص 0.8 MP الكاميرا مع القرار المكانية مقارنة إلى النائب كاميرا 1.4، لا يمكن الاعتراف بها رئيس اليرقات بأمانة بعد الآن (الشكل 4C). تتبع وتحليل التمعج هو ممكن ولكن بما في ذلك المزيد من غضب على أساس زيادة الضوضاء. والمثير للدهشة، حتى منخفضة قرار USB وكاميرا ويب توفر أفلام ذات جودة كافية لحساب مسارات اليرقات (0.3 MP الكاميرا، وأقل من 20 €، الشكل 4D). ويمكن حساب التمعج من المنطقة ولكن القياسات صاخبة جدا.

في الإعداد لدينا نحن نستخدم بشكل روتيني النائب كاميرا 4. للفحص، وهذه الكاميرا يسمح بمراقبة 22 سم × 22 سم الساحة، التي تنص بوضوح على فرصة لتحليل أعداد كبيرة من الحيوانات في وقت واحد بحيث تحليل إنتاجية عالية هو ممكن عمليا. باستخدام هذا الإعداد، طول اليرقات طق يمثلها 40 بكسل والتي لا يزال يسمح تسجيل وتحليل التمعج. وتعطى صورة نموذجية من 15 مسارات اليرقات في الانحدار الحرارة في الشكل 5A. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام عدسة الماكرو يسمح لصورة يرقات مع دقة عالية جدا حيث أصبحت العديد من الأعضاء الداخلية واضحة وزيادة تحسين اعتراف رئيس (الشكل 5B). وعلاوة على ذلك يمكن استخدام هذه لتحليل أكثر تفصيلا مزيد من السلوكيات من مجموعة واسعة 20. نفس الإعداد يمكن استخدامها بسهولة لصورة الزحف C. الديدان ايليجانس (الشكل 5C).

الشكل (4)
الشكل 4. FIM التصوير وتتبع النتائج لكاميرات مختلفة. (A) اليسار: التصوير FIM ثلاثة اليرقات الزحف على مرحلة تتبع 10 سم × 10 سم استولت باستخدام 4 النائب الكاميرا مع 10 إطارا في الثانية. منتصف:لقطة ومركز مسار الشامل لليرقة واحدة. يشار مجال الحيوان. الحق: منطقة من اليرقة تآمر أكثر من 100 الإطارات. السهم الأحمر يشير إلى نقطة زمنية من الصورة يثقب. (ب) أي ما يعادل (A) ولكن استولت باستخدام 1.4 MP الكاميرا. (C) أي ما يعادل (A) ولكن استولت باستخدام 0.8 MP الكاميرا. (D) أي ما يعادل ( A) ولكن القبض باستخدام 0.3 MP الكاميرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. التحفيز الحراري، وارتفاع القرار التطبيقات. (A) تطبيق التحفيز الحراري (مقارنة الشكل 1). مسارات تحسب عن طريق FIMTrack. (B) صورة عالية الدقة تطبيق الثلث والثانية والأولى اليرقة الطور باستخدام عدسة الماكرو. ويمثل طول اليرقات الطور الثالث من قبل 400 بكسل في مجال الرؤية من 2.5 × 2.5 سم. (C) وC. اعتقلت ايليجانس دودة باستخدام التصوير FIM. يشار إلى الحانات الحجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في علم الأعصاب السلوكي هو إلزامي على فك كميا الصفات السلوكية المعقدة. هناك حاجة إلى إجراءات وبالتالي، يجب مراعاتها أعداد كبيرة من الأفراد بدقة عالية والآلي للتحليل الإحصائي. هنا، يتم وصف التصوير FIM، رواية، بسيطة وقوية الإعداد والتصوير، والتي تنص على وسائل لمراقبة تحرك من مجموعة واسعة من الحيوانات. تم اختبار فعالية الإعداد والتصوير FIM استخدام يرقات ذبابة الفاكهة، الديدان المفلطحة مستورقة وC. الديدان ايليجانس. توفر تكنولوجيا FIM التباين العالي جوهريا للكشف حتى الهياكل الداخلية للحيوانات، مثل الدماغ والقصبة الهوائية والأمعاء أو الغدية. الأهم من ذلك، ويتم تحديد هذه الهياكل الداخلية بقوة حتى يتمكنوا من خدمة إلى التعرف تلقائيا على التوجه للحيوان 19.

يمكن أن تتأثر نوعية الأفلام التي كتبها كمية زائدة من المياه على سطح الزحف. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لالتحكم في الرطوبة من أجار. المياه أجار أو أكثر من اللازم قديمة جدا على سطح يمكن أن يسبب التحف. وبالمثل، تأكد من أن يتم تضمين أية فقاعات الهواء في سطح الزحف. بشكل عام، على سطح أجار معدة إعدادا جيدا يسمح تسجيل الأفلام لمدة 4 ساعة.

يرجع ذلك إلى المبادئ الفيزيائية الأساسية التصوير FIM يولد الضوضاء تقريبا التسجيلات صورة حرة، مما أدى إلى جودة صورة رائعة. وهذا بدوره يسهل لاحقا تحليل الصور القائم على الحاسوب وتمكن إنتاجية عالية. ومع ذلك، يتم تقييد منهجية لتحليل الحيوانات التي الاتصال مباشرة على سطح أجار. وتحدى البرمجيات تتبع من قبل الحيوانات تشكيل شكل دونات. على الرغم من أن مؤشر ثنائي يعترف شكل دونات، قد تحسب العمود الفقري الخطأ.

نتيجة لبناء وحدات من الجدول تتبع المزدوج والثلاثي التصوير اللون هو في متناول اليد. وعلاوة على ذلك، يمكن للمحفزات إضافية (الضوء، عطور، المحفزات الكهربائية أو الميكانيكية) تكون بسهولة ديلivered من فوق. برنامج FIMTrack مصممة لتتناسب مع قوة التصوير FIM يمكن اعتمادها بسهولة لتتبع يرقات ذبابة الفاكهة، C. ايليجانس أو planarians. وهكذا، ونظرا لبنائه واضحة ورخيصة (انظر http://FIM.uni-muenster.de)، والتصوير FIM هو ممكن لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية وعلى وجه الخصوص يسمح حاجة ماسة دراسات إنتاجية عالية.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

Acknowledgments

ونحن ممتنون لS. توماس الذي بدأ هذا المشروع، J. هيرمان وU. Burgbacher للمساعدة في بناء الإعداد FIM. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل DFG (SFB 629 B6).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FIM setup Custom  details for construction or purchase of setups is available upon request
Acrylic glass plate Custom  Additional for agar pouring
Heat radiator plate Custom  Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting
Water calorifier/cooling pumps and hoses Custom  based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Standard Camera (4 MP) Basler acA2040-25gm Camera defaultly used for the FIM setup
Test Camera (1.4 MP) QImaging  1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) Camera used for comparison
Test Camera (0.8 MP) Point Grey Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) Camera used for comparison
Test Camera (0.3 MP) Sony PS Eye USB2.0 camera Camera used for comparison
Computer Custom  equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB]
Standard Fly food Custom 
Standard Fly vials 135 ml Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany 78,895
Petri dishes 9 cm Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany 821,473
Ultrapure deionized water Merck Millipore, Darmstadt, Germany Synergy 
NaCl Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany 3957.2
Food grade agar AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany A0917,5000
Paintbrush (small and large) Milan Aquarell 310 Size 0 and 2
Pyrometer Trotec BP20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila. Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).
  2. Frye, M. A., Dickinson, M. H. Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).
  3. Fry, S. N. The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila. Science. 300 (5618), 495-498 (2003).
  4. Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Klämbt, C. Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects. EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).
  5. Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. Object tracking: A Survey. ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).
  6. Pistori, H., et al. Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model. Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PloS one. 3 (5), e2208 (2008).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).
  9. Cui, X., et al. Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).
  10. Heng, X., et al. Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip. Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).
  11. Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion. Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).
  12. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).
  13. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  14. Yu, C. -C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PloS one. 8 (7), e69653 (2013).
  16. Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nature communications. 2, 441 (2011).
  17. Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).
  18. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  19. Risse, B., Thomas, S., Otto, N., Löpmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis. PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).
  20. Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C. Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images. Comput Biol Med. 14, (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 94، ذبابة الفاكهة،
FIM التصوير وFIMtrack: اثنان أدوات جديدة تسمح عالية الإنتاجية والتكلفة تحليل تحرك الفعال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Risse, B., Otto, N., Berh, D.,… More

Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis. J. Vis. Exp. (94), e52207, doi:10.3791/52207 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter