Remote Limb ischämischen Präkonditionierung: eine neuroprotektive Technique in Nagetiere

Summary

Remote ischämischen Präkonditionierung (RIP) ist ein Verfahren zur Konditionierung Gewebe vor schädlichen Stress. Wir haben eine Methode der Fern Ischämie an der Hintergliedmaße festgelegt, durch Aufblasen eines Blutdruckmanschette für 5-10 min. Die neuroprotektive Fähigkeiten von RIP in einem Modell der retinalen Degeneration bei Nagern gezeigt.

Abstract

Subletalen Ischämie schützt Gewebe gegen eine nachfolgende, weitere schwere Ischämie durch die Hochregulation endogener Mechanismen in das betroffene Gewebe. Subletalen Ischämie ist auch gezeigt worden, um Schutzmechanismen in entfernten Geweben hochregulieren. Eine kurze Zeit der Ischämie (5-10 min) in der hinteren Gliedmaßen der Säugetiere induziert Selbstschutzreaktionen im Gehirn, Lunge, Herz und Netzhaut. Die Wirkung wird als entfernte ischämischen Präkonditionierung (RIP) bezeichnet. Es ist eine therapeutisch vielversprechende Möglichkeit zum Schutz lebenswichtiger Organe, und ist bereits in klinischen Studien für Herz und Gehirn Verletzungen. Diese Veröffentlichung zeigt eine kontrollierte, minimal-invasive Verfahren zur Herstellung einer Extremität - insbesondere die hinteren Gliedmaßen einer Ratte - ischämisch. Eine Blutdruckmanschette zur Verwendung bei neugeborenen Menschen entwickelt wird, um eine manuelle Sphygmomanometer angeschlossen werden, mit 160 mmHg Druck um den oberen Teil der hinteren Gliedmaßen anzuwenden. Eine Sonde zur Hauttemperatur zu erfassen wird die ischemi verifizierena, durch Aufzeichnen der Abfall der Oberflächentemperatur durch Druck induzierten Okklusion der Beinarterien verursacht wird, und den Anstieg der Temperatur, die die Freisetzung der Manschette folgt. Diese Methode der RIP bietet Schutz für die Netzhaut der Ratte gegen hellen Lichtschäden und Degeneration.

Introduction

Das Überleben der meisten, möglicherweise alle, Gewebe im Gesicht des metabolischen Stress kann nach vorheriger Konditionierung mit einer Dauer von subletalen Ischämie ^1,2 verbessert werden. Ischämischen Präkonditionierung (IP) in der Praxis ist die Exposition von Gewebe subletalen Ischämie, bevor die Gewebe Erfahrungen schwereren Belastungen, wie eine anschließende ischämischen Insult. In Tiermodellen liefert IP Schlagschutz an das Gehirn, Retina, Herz und Lunge ^3-6. Entsprechend Beobachtungen bei Schlaganfall-Patienten zeigten einen Zusammenhang zwischen früheren transitorische ischämische Attacken und bessere klinische Ergebnisse ^7,8. IP schützt auch Netzhautfotorezeptoren aus nicht-ischämische Verletzungen ^9.

Die Wirksamkeit von IP in verschiedenen Geweben und Verletzungen legt nahe, daß es die Aktivierung eines angeborenen Mechanismus des Zellüberlebens in allen Geweben vorhanden. Ischämischen Präkonditionierung des Myokards wurde vorgeschlagen, Schutzwirkungen durch die Hochregulation habendes Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF), bekannt, dass viele Stoffwechselwegen durch die Freisetzung von Adenosin oder durch die Öffnung des mitochondrialen ATP-Kaliumkanäle ^10,11 regulieren. Adenosinfreisetzung und ATP-Kaliumkanäle sind in Hirnischämie impliziert aber, Untersuchungen über die neuroprotektive Mechanismen ischämischer Anlagen haben bisher zur Anpassung Anti Exzitotoxizität, anti-apoptotische und Antientzündungswege ^12,13 konzentriert. Insgesamt ist das Verständnis der molekularen Prozess der ischämischen Anlage zum Schutz von Neuronen begrenzt.

Remote ischämischen Präkonditionierung Versuche, ferne von entscheidender Bedeutung Organe (Herz, Gehirn, Lunge) durch die Erzeugung in weniger kritische Ischämie Gewebe zu konditionieren. Remote ischämischen Präkonditionierung (RIP) unter Verwendung des Hinterbein hat sich gezeigt, neuroprotektive in Nagetiermodellen von Schlaganfall ^14-17 sein. Die von uns beschriebenen Verfahren stellt einen einfachen, zuverlässigen und nicht-invasive protocol zur Induktion von RIP.

Die große Mehrheit der RIP-Protokolle beinhalten die hinteren Gliedmaßen, vermutlich weil die Oberschenkelarterie in der oberen hinteren Gliedmaßen entfernt können leicht identifiziert und für chirurgische Klemm und Tourniquet-Anwendung zugegriffen werden. Bei invasiven Schenkel ischämischen Studien zur Untersuchung des Gehirns und der Hautschutz, um eine Ischämie durch Trennen der Oberschenkelarterie von der Leiste aus Bändern und Festklemmen der Femoralarterie ^2,15,18 induziert.

Die Ischämie entweder Schenkel cuffing oder Femoralarterie Klemm resultierende durch Veränderungen auf dem Schenkel mit einem Pulsverlust, Verminderung der Sauerstoffzufuhr und einem Rückgang der Hauttemperatur bestätigt. Fern Ischämie kann durch die Pulsverlust unter Verwendung der Laser-Doppler oder Ultraschall-Doppler ^17-19 bestätigt werden. Hauttemperatur kann als Alternative verwendet werden, um Doppler obwohl die Beziehung nicht linear ist ^20,21 werden. Genaue Temperaturaufzeichnungen sind an der Tagesordnung in Labors und Doseleicht in Fern ischämischen Studien aufgenommen werden.

Eine Alternative zu femorale Klemmoperation ist die Induktion von Ischämie unter Verwendung einer Aderpresse. Venenstauer Anwendung erzeugt Ischämie vergleichbar zu der mit Gefäßklemm erreicht; Kutchner et al. Vergleich invasive Femoralarterie Klemm auf eine nicht-invasive Blutsperre und fanden beide Methoden angehalten Durchblutung der Gliedmaßen und reduziert Hautschäden in einer Schönheitsoperation Modell der Hautlappen Ischämie ^18. Cuffing entweder das Bein oder Arm und die Erhöhung der Manschettendruck oberhalb des systolischen Blutdrucks wurde festgestellt, Schutzmaßnahmen gegen ischämische Schädigung in Schweinen und Menschen ^17,19,22 sein.

Verschiedene Blutsperre Ansätze zur Induzierung Fern ischämischen umfassen die Verwendung einer Blutdruckmanschette oder ein elastisches Band ^17,22,23. Jedoch ist die Verwendung eines elastischen Bandes Ischämie induziert eine unsichere Verfahren, die möglicherweise was zu einer nicht regulierten Menge an Druck in derGliedmaßen, mit steigendem Druck über 500 mmHg an Menschen ²⁴ aufgezeichnet. Ferner Gliedmaßenischämie Verwendung eines elastischen Bandes führt zu Muskelschädigung bei Ratten nach dem Entfernen des Bandes ^23, wie von Evans Blau-Farbstoff, ein in vivo-Markierung von myofiber Lässigkeit ²⁵ beurteilt. Im Gegensatz dazu kann die Abgabe von einem gesteuerten Druck an die Aderpresse unter Verwendung einer Blutdruckmanschette um ein Blutdruckmessgerät ^17,19,22,26 verbunden erreicht werden.

In dieser Studie wurde eine leichte Verletzungen Modell Photorezeptor-Degeneration verwendet werden, um die neuroprotektive Wirksamkeit von Fern ischämischen Präkonditionierung demonstrieren. Remote Ischämie wurde unmittelbar vor Lichtschäden induziert und verhindert spätere Photorezeptordegeneration wie Netzhautfunktionstests bestätigt. Das dazugehörige Video wird die Anwendung nicht-invasiver Fern Ischämie zu demonstrieren.

Protocol

Ethics Statement: Das Protokoll folgt den Richtlinien der Tierpflege University of Sydney, AEC # 5657. Die Anästhesie wurde durch Tierethikkommission (University of Sydney, AEC # 5657) zugelassen.

1. Ausrüstung Vorbereitung

1. Verwenden Sie Echtzeit-Tracking-Hauttemperatur. Schalten Sie Computer und Datenerfassungshardware.
2. Öffnen Temperatur-Recording-Software und stellen Temperatureinstellung zwischen 30-35 ° C und die Häufigkeit der Probenahme bis alle 100 ms.
3. Optional: Legen Sie Rektalthermometer zu Kerntemperatur zu gewährleisten bleibt bei 37,5 ° C stabil.

2. Kalibrierung des Handmessgerät

1. Schließen Neugeborenen Armmanschette, um eine Größe 2 Manschette für ein 250-550 g Ratte sphygmomanometer.Use. Ein Adapter notwendig sein, um den Manschettenschlauch mit dem Blutdruckmessgerät zu verbinden.
2. Lassen Sie die Luft der Manschette entweder durch Lösen der Entlüftungsventil oder Abtrennen des Manschettenschlauch aus der Anpassungoder. Achten Sie darauf, keinen Druck bleibt in der Rohrleitung und das Manometer Adel ruht auf Null innerhalb des oval / Rechteck.
3. Überprüfen Sie den Druck zwischen Schlauch, Manometer und Manschette. Pumpen Sie die Manschette mit sanften Pumpen der Pumpball bis 100 mmHg am Manometer liest. Stellen Sie sicher, der Druck konstant bleibt. Lassen Sie die Luft der Manschette durch langsames Öffnen der Lufttrennwert.

3. Vorbereitung der Tiere

Hinweis: Tiere, die leichte Verletzungen zu unterziehen sind, erfordern dunklen Anpassung der Nacht zuvor entfernten Ischämie. Tiere unterziehen Lichtschäden erfordern dunklen Aufzucht (12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus (5 Lux))

1. Führen Sie Fern Ischämie entweder wach oder anästhesiert Nagetiere. Stellen Sie sicher, dass Tiere einen gesunden Muskeltonus. Stellen Sie sicher, das durch Einklemmen des oberen hinteren Gliedmaßen zu bestätigen, eine ausreichende Muskel vorhanden. RIP-induzierten Schutz gegen Lichtschäden hat in sitzende Ratten bis zu 6 Monaten getestet.
2. Anästhesiert Vorbereitung für RIP
   1. Injizieren Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von 60 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Verlängerung des Beines und Einklemmen der Haut auf der Unterseite des Fußes. Das Tier hat kein Reflex, wenn sie tief anästhesiert. Künstliche Tränen in die Hornhaut Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
   2. Zeigen Ratten entweder auf einem Heizkissen oder Umlauf-Wasserheizer Schlauch, um eine konstante Körpertemperatur von 37,5 ° C zu halten. Positionieren Sie die Ratte in der Bauchlage mit den unteren Gliedmaßen "Fuß-Pads nach oben zeigt. Entweder der rechten oder linken Extremität Fern Ischämie unterzogen.
3. Awake Vorbereitung RIP
   Hinweis: Awake Tierversuche sind zwei Personen erforderlich. Eine Person hält den Tieren und die zweite Person betreibt den manuellen Blutdruckmessgerät. Die Experimentatoren müssen darauf vertrauen können, um das Verfahren durchzuführen, wie Zurückhaltung erhöht die Verletzungsgefahr für Handler sein. Die Ratten unterziehen Fern Ischämie muss konditioniert werden to Handhaltung. Je nach intuitiven Richtlinien manuelle Zurückhaltung sollte Fortschritt von 30 Sekunden bis zu einem Maximum von 5 min über mehrere Wochen. Timid Tiere, die in den Handhaltung gewöhnen ausfallen sollte aus wach Experimenten ausgeschlossen werden. Schließlich ist die manuelle Zurückhaltung wahrscheinlich Stress (und möglicherweise vorstellen verwechselt der Studie) auf Tiere und eine Schein-Kohorte (Platzierung der Manschette ohne Entzündung) führen muss verwendet werden, um genau zu deuten RIP Studienergebnissen werden.
   1. Schneiden Sie ein Handtuch in eine 15 cm x 30-50 cm Stück und legen Sie die kurze Kante senkrecht zur Wirbelsäule der Ratte, für den Kopf an die Spitze der hinteren Gliedmaßen.
   2. Verstauen Sie die kurze Kante unter Oberkörper der Ratte fest und beginnen, die Ratte mit dem restlichen langen Kante Handtuch wickeln. Sichern Sie das Tier eingewickelt unter dem Arm in Rückenlage. Wenn die Ratte unter dem linken Arm hielt, befreien die Ratte rechten Extremität aus dem Handtuch.

4. Anwendung of Hauttemperatursonde

1. Verlängern Sie die Etappe der Ratte, der Ischämie unterzogen und legen Sie die Haut Sonde auf den Fußballen ist. Positionieren Sie den Haut-Sonde, um den Kontakt zwischen dem Temperaturfühler und der Haut zu maximieren. Drücken Sie das Sonde in die Fußballen und bringen die Sonde mit Papierstreifen.
2. Überprüfen Sie die Hautsonde Platzierung durch Verfolgen der Temperatur auf die Temperatur-Recording-Software. Sicherzustellen, dass die Hauttemperatur zwischen 30-34 ° C und stabil bleibt. Verfolgen Sie die Hauttemperatur für 1-2 min. Stellen Sie die Hautsonde, wenn die Temperatur instabil ist oder unter 30 ° C.

5. Fern Ischämie

1. Lassen Sie die Luft der Manschette und sicherzustellen, dass die Luftdruckventil geschlossen ist. Erweitern Sie das Bein und locker umschließen die Manschette auf der oberen hinteren Gliedmaßen. Verwenden Sie den Zeigefinger und Daumen, um das Bein und die unteren Ziffern zu verlängern, um die gelockerten Manschette in Position zu halten.
2. Heben Sie den Manschettendruck anästhesiert Tieres zu 160 mmHg und bei wachen Tieren INCREase der Manschettendruck bis 180 mmHg.
   Hinweis: Die anästhesiert Blutdruck von Ratten reicht von 120 bis 140 mmHg und steigt auf 160 mmHg bei Bewusstsein. Beginnt die Timer-und Fuß Temperaturaufzeichnungen, sobald die korrekte Druck erreicht ist.
   Hinweis: Der Fuß Temperatur sollte um 2 ° C nach 5 min von konstanten Druckabfall.
3. Pflegen Sie die Position der Manschette oberhalb des Tieres "Knie" in der gesamten Ischämie. Manschettendruck beginnt nach wenigen Minuten fallen, oder wenn die Ratte die Extremität bewegt.
4. Mehrmals pumpen die Pumpball in kurzen Stößen, um die gewünschte Manschettendruck wiederholenden kurzen Burst von Pumpen zu halten
5. Fern Ischämie kann kontinuierlich für zwischen 5 und 15 Minuten abgegeben werden. Die Ischämie-Reperfusion-Protokoll besteht aus 2 Perioden von 5 min Ischämie mit einer dazwischenliegenden 5 min Reperfusion.
6. Luft aus dem Manschettendruck durch Lösen der Druckluftventil. Überprüfen Sie die Temperatur verändern sich im Laufe der Ischämie proProtokoll. Lassen Sie die Manschette.
7. Fahren Sie mit Verletzungen Experimentieren. Tiere unter der Wirkung der Anästhesie müssen auf einem Heizkissen gebracht werden. Weiter zu den Tieren, bis die ambulante Überwachung. Tiere nicht zu Wohnraum, bis zu Fuß zurückgeschickt werden.

6. Licht Injury - Netzhautdegeneration Modell

1. Dunkel die Tiere über Nacht (12-15 h) anzupassen. Unmittelbar im Anschluss an Fern Ischämie Anlage oder Schein-Fern Ischämie (Tierhaltung) Ort Tieren in Plexiglasgehäuse mit Nahrung und Wasser.
2. Schalten Sie Leuchtstofflampen (1.000 Lux) über Plexiglasgehäuse um 9 Uhr 24 h entfernt. Nach Belichtung, kehren die Tiere auf zyklische Beleuchtung für 7 Tage verdunkeln.

7. Post-Remote-Ischämie Procedures

1. Vision mit Einschätzung Elektroretinogramm (ERG):
   Hinweis: Die ERG Set-up und Flash-Protokoll gefolgt Brandli und Stein ^26.
   1. Dunkle anzupassen Tiere über Nacht (12-15 h). Unterschwach rot Beleuchtungs betäuben die Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin (60 mg / kg und 5 mg / kg). Mydriatischen (Atropinsulfat 1,0%), Hornhaut Anästhetikum (Proxymetacain 0,5%).
   2. Gelten Hydration der Horn (Carbomer Polymer) Augentropfen sofort auf der Hornhaut. Bewerben Augengel bei 20 min-Takt zu Hornhauthydration zu erhalten.
   3. Zeichnen Sie eine lose gebunden Faden um den Augapfel zu stabilen ERG-Aufnahmen unterstützen. Überwachen Sie Temperatur mit einem Rektalsonde und zu pflegen Körpertemperatur Tieres bei 37 bis 37,5 ° C.
   4. Positionieren Sie den Kopf in einem Ganzfeld Ulbrichtkugel.
      Hinweis: Die Ganzfeld ist eine voll programmierbare Lichtreiz, der einheitliche Whit blinkt liefert von LEDs für die Augen.
   5. Notieren Sie die Elektroretinogramm mit einem maßgeschneiderten 4 mm Platin positive Elektrode leichter Berührung der Hornhaut und eine 2 mm Durchmesser Ag / AgCl-Pellet-Elektrode in den Mund eingeführt. Referenz beide Elektroden mit einer Nadel aus rostfreiem Stahlsubkutan in die Hinterteil eingelegt.
   6. Nehmen Sie Signale mit Bandpass-Einstellung 0.3-1,000 Hz (-3 dB), mit einer 2 kHz Erfassungsrate (AD Instruments). Nachdem ein stabiler ERG Aufzeichnung wird das Tier zu einem 10 Minuten vor Beginn der Dunkeladaptation Aufnahmen fest Thema.
   7. Folgen Sie dem Flash-Protokoll, wie zuvor von Brandli und Stein ²⁶ beschrieben.
      1. Programmierung der Dauer des Blitzes (wir blinkt 1-2 ms Dauer), und legen Sie seine Intensität auf -4,4 bis 2,0 log scot cd.sm ^-2. Verwenden Sie helle Blitze (2,0 log scot cd.sm ^-2, 1 ms), um die Netzhautfunktion zu messen. In dieser Studie ist der Vergleich zwischen Steuerung, Lichtschäden und leichten Verletzungen mit RIP.

8. TUNEL Assay

1. Euthanize Tieren durch intraperitoneale Injektion von Phenobarbital Dosis (100 mg / kg). Entkernen die Augen und fixieren in 4% Paraformaldehyd.
2. Die Augen in PBS zu waschen, bevor cyroprotectingAugen über Nacht in 30% Saccharose (w / v). Betten Sie die Augen in OCT-Verbindung und Schnitt in 20 & mgr; m Sagittalschnitten Verwendung eines Kryostaten.
3. Führen Sie die TUNEL-Assay auf Netzhautschnitte mit DAPI-Färbung nach dem Protokoll von Maslim et al. ²⁷
4. Verwenden Fluoreszenzmikroskopie für TUNEL zählt der Netzhaut. TUNEL-Zellen wurden von der äußeren Körnerschicht (ONL) erfasst; die äußerste Schicht der Retina, die Photorezeptorzellkerne enthält. In dieser Studie wurden TUNEL zählt dreifach für jedes Auge, mit 5 Augen für jede Behandlungsgruppe.
5. Verwenden Sie Einweg-ANOVA, um statistische vergleichen Gruppe bedeutet Kontrolle, Lichtschäden und leichte Verletzungen + RIP Ratten.

Results

Eine Blutdruckmanschette über 160 mmHg erhöht, um stoppt Durchblutung des hinteren Gliedmaßen wie deutlich in 1B zu sehen. Der Mangel an Sauerstoffversorgung des Gewebes ergab sich ein Reduktions Fußtemperatur des Tieres für eine Ischämie-Reperfusion-Protokoll (Abbildung 2). Der Fuß Temperatur (33 ° C) niedriger ist als die Kerntemperatur und zuverlässig reduziert war während der Manschettendruck Erhebung (31 ° C) steigt, wenn die Manschette entleert wurde (32 ° C). Ein einzelnes 1.000 ...

Discussion

Nagetier hinteren Gliedmaßen Ischämie wurde erfolgreich mit einem manuellen Sphygmomanometers induziert und Stulpe Abgabe der Neuroprotektion zu den Photorezeptoren der Netzhaut. Die Feststellung einer ischämischen Anlage induzierte Schutz der Photorezeptoren vor Licht Verletzungen ^9,28.

Im Wesentlichen verursacht Fern Ischämie kurze Sauerstoffmangel zu Geweben. Daher hat Fern ischämischen Präkonditionierung viele Ähnlichkeiten mit ischämischen Anlage oder alternativ bezeichnet is...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold Serie DuraShock Hand-Aneroid-Blutdruckmessgerät	Welch Allyn	DS56	Manuelles Blutdruckmessgerät
Neugeborenes [Größe 2] 1 Tube, 10er Pack	Welch Allyn	5082-102-1	Blutdruckmanschette für Gliedmaßen
Luer-Lock-Adapter	Welch Allyn	5082-178	Adapter für Neugeborenenmanschette
Thermistor Pod	AD Instruments	ML 309	Hauttemperatureinheit
Hauttemperatursonde	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4-Kanal-Erfassungshardware	AD Instruments	PL 35044
Homöothermisches Deckensystem mit flexibler Sonde	Harvard Appartus	507222F
Handtuch			optional: Wach-Fernischämie
Isoflo - 100% Isofluran (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	fakultativ: Betäubungsmittel
Ketamil - Ketamin 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		fakultativ: injizierbare Anästhesie Fernischämie
Xylium - Xylazin 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		fakultativ: injizierbare Anästhesie Fernischämie