Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Zusammenfassung

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Es wurde keine Heilung für altersbedingte Makuladegeneration (AMD) entdeckt, die Hauptursache für Sehverlust bei Menschen über 55 Jahren. AMD ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung mit unbekannter Ätiologie, obwohl man weitgehend davon ausgeht, dass sie aufgrund des Todes oder einer Funktionsstörung des retinalen Pigmentepithels (RPE) auftritt, einer Monoschicht von Zellen, die der Netzhaut zugrunde liegt und die Photorezeptoren entscheidend unterstützt. RPE-Zellersatzstrategien können vielversprechend sein, um einer großen Untergruppe von AMD-Patienten therapeutische Linderung zu verschaffen, und RPE-Zellen, die primären menschlichen Zellen (hRPE) stark ähneln, wurden in mehreren unabhängigen Labors erzeugt, einschließlich unseres eigenen. Darüber hinaus beschränken sich die Einsatzmöglichkeiten von iPS-RPE nicht nur auf zellbasierte Therapien, sondern wurden auch zur Modellierung von RPE-Erkrankungen eingesetzt. Diese Art von Studien kann nicht nur die molekularen Grundlagen der Krankheiten aufklären, sondern auch als unschätzbare Werkzeuge für die Entwicklung und Erprobung neuartiger Medikamente dienen. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll zur gerichteten Differenzierung von RPE aus Stammzellen vor. Die Zugabe von Nicotinamid und entweder Activin A oder IDE-1, einem kleinen Molekül, das seine Wirkung nachahmt, zu bestimmten Zeitpunkten, erhöht die Ausbeute von RPE-Zellen erheblich. Mit dieser Technik können wir bereits in drei Monaten eine große Anzahl von RPE mit geringer Passage ableiten.

Einleitung

Die verschiedenen Zelltypen, die die Netzhaut besetzen, sind in einer funktionalen Architektur organisiert. Die Photorezeptoren im hinteren Teil der Netzhaut sind dafür verantwortlich, Licht durch Phototransduktion in elektrische Impulse umzuwandeln. Die Phototransduktion kann jedoch nicht ohne die koordinierten Bemühungen anderer benachbarter Zelltypen wie Mueller-Gliazellen und retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) stattfinden. Eine Monoschicht aus RPE-Zellen trennt die sensorische Netzhaut von der Choriokapillaris, der primären Blutversorgung für Photorezeptoren, und ist ideal positioniert, um mehrere Funktionen zu steuern, die für die Photorezeptorhomöostase wichtig sind. Tatsächlich sind das RPE und die Photorezeptoren so voneinander abhängig, dass sie weithin als eine einzige funktionelle Einheit angesehen werden. (Für einen Überblick über alle verschiedenen Funktionen des RPE siehe Strauss, 2005¹.) Der Tod oder die Funktionsstörung der retinalen Pigmentepithelzellen kann die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) auslösen, die in den Industrieländern die Hauptursache für dauerhaften Sehverlust^{ist 2-4}.

AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung des RPE, der Photorezeptoren und des choroidalen Gefäßsystems; die Risikofaktoren sind vielfältig und umfassen Kombinationen von Umwelteinflüssen und genetischen Einflüssen^5,6. Die Behandlungsmöglichkeiten für AMD sind sehr begrenzt, aber eine vielversprechende mögliche Therapie ist der RPE-Zellersatz^7,8. Obwohl die Ergebnisse gemischt sind, hat die Transplantation von RPE-Zellen bei AMD-Patienten (und bei anderen Patienten mit Netzhautdegeneration) und auch bei Nagetiermodellen der Netzhautdegeneration das Potenzial, eine signifikante Photorezeptoratrophie vorübergehend zu verhindern^9-23. (Das Tiermodell, das üblicherweise für diese Studien verwendet wird, sind Ratten des Royal College of Surgeons (RCS), die eine Mutation im MerTK-Gen aufweisen. Diese Mutation macht RPE-Zellen unfähig, die äußeren Photorezeptorsegmente zu phagozytieren und fördert die Degeneration der Netzhaut²⁴.) Während die berichteten Überlebensraten von implantiertem RPE im subretinalen Raum von RCS-Ratten und -Mäusen stark variieren, besteht das Potenzial, dass sie mehrere Monate oder Jahre überleben^9,10,12,20.

RPE-Zellen können in ausreichender Anzahl für eine Transplantation gewonnen werden, indem sie aus pluripotenten Stammzellen^9-14,25-28 gewonnen werden. Mehrere unabhängige Gruppen haben gezeigt, dass diese Zellen auf ähnliche Weise wie ihre somatischen Gegenstücke funktionieren, und Langzeitstudien deuten darauf hin, dass sie bei der Implantation in Ratten- und Mauskrankheitsmodellen^{sicher sind 9,10,12,14,19,20,25,29-32}. Die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen anstelle von embryonalen Stammzellen kann vorteilhaft sein, da ethische Fragen und immunologische Herausforderungen im Zusammenhang mit allogener RPE vermieden werden können^33,34. Eine weitere spannende Anwendung für die iPS-Technologie ist die Krankheitsmodellierung³⁵. Die Fähigkeit, eine große Anzahl von RPE-Zellen von Patienten mit RPE-Erkrankungen zu untersuchen, könnte für das Verständnis ihrer molekularen Grundlagen von unschätzbarem Wert sein. Diese Art von Studie wurde kürzlich mit Morbus Best Patient RPE durchgeführt und könnte den Weg für ähnliche Studien zu erblichen Makulopathien ebnen³⁶.

Die Gewinnung von RPE aus Stammzellen ist ein relativ einfacher Prozess und kann vollständig unter xenofreien Bedingungen durchgeführt werden. Die einfachste Strategie besteht darin, Monoschichten von RPE-Zellen spontan zu gewinnen, die Ausbeute kann jedoch durch gezielte Differenzierungstechniken deutlich verbessert werden. Diese Techniken beinhalten jedoch die Verwendung exogener Proteinfaktoren, die teuer sein können und oft in Bakterien oder anderen nicht-menschlichen Quellen erzeugt werden^10,12,37. In unseren Studien folgten wir einem etablierten Protokoll¹⁰, das Nicotinamid und Activin A verwendet, einen Signalfaktor, der sich für die RPE-Spezifikation als ausreichend erwiesen hat³⁸. Hier wird gezeigt, dass das niedermolekulare IDE-1 Activin A adäquat ersetzen kann, wodurch die Kosten gesenkt und die Bedenken im Zusammenhang mit der Verwendung rekombinanter Proteine gelindert^{werden 39}. Zusätzlich verwenden wir einen xenofreien Serumersatz und kultivieren die differenzierenden RPE-Zellen auf einem synthetischen xenofreien Substrat. Es wurde bereits gezeigt, dass RPE-Zellen mit diesem Ansatz sehr effektiv differenzieren^{können 40}.

Wenn wir als Monoschicht differenziert werden, visualisieren wir pigmentierte Kolonien, die RPE-Zellen enthalten, bereits nach fünf Wochen¹². Sobald sie eine ausreichende Größe erreicht haben, können sie manuell herausgeschnitten und zur Expansion in eine andere Schale übertragen werden. RPE-Zellen sind berüchtigt dafür, dass sie sich mit jeder Passage dedifferenzieren, und die Verwendung von allem, was älter als fünf Passagen ist, sollte vermieden werden (wir stellen fest, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Charakterisierung und Transplantation in Tiermodellen nach zwei oder drei Passagen leicht erzeugt werden kann). Sobald sie vollständig differenziert sind, setzen wir mehrere Techniken ein, um die Zellen anatomisch und funktionell zu charakterisieren und sicherzustellen, dass sie als adäquater Ersatz für erkrankte RPE dienen. Die Beschreibung dieser Techniken und das Protokoll für die Implantation des iPS-RPE in den subretinalen Raum von Nagetieren gehen über den Rahmen dieser Methodenarbeit hinaus und wurden bereits veröffentlicht^12,32,41.

Während die Entwicklung standardisierter Protokolle für die effektive Ableitung von iPS-RPE für die Kliniken eindeutig wichtig ist, gibt es auch noch erhebliche präklinische Arbeit in Tiermodellen zu leisten. Es gibt Bedenken hinsichtlich der Immunogenität von iPS-abgeleiteten Zellen, und es werden mehrere verschiedene Implantationstechniken untersucht, einschließlich der Implantation von Zellen auf künstliche Substrate^42,43. Aus diesen Gründen sind wir der Meinung, dass die Veröffentlichung standardisierter Protokolle von Vorteil ist, um sowohl klinische als auch präklinische Studien zu erleichtern. Vor allem, wenn direkte Vergleiche von iPS-RPE-Zellen durchgeführt werden, die in verschiedenen Labors von verschiedenen Forschungsgruppen gewonnen wurden.

Protokoll

1. gerichteten Differenzierung von Stammzellen gewonnenen RPE

Anmerkung: Alle Inkubationsschritte werden bei 37 ° C in 5% CO ₂ durchgeführt

1. Pflegen Sie die hES oder Hüfte Linien (täglich füttern) in Erhaltungsmedium (MM; Tabelle 1). Sobald die Leitungen ausreichende Standards der Qualitätskontrolle zu erreichen, halten sie auf einer Schicht von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) ausgesät mit einer Dichte von 250.000 / well eines Sechs-Well-Platte. Xeno freien Kulturen kann auch nach der von Tucker et al. ⁴⁰ festgelegten Protokoll erzeugt werden.
2. Lassen Sie die Stammzellenkolonien zur Konfluenz erreichen.
3. Wechseln Sie in Differenzierungsmedium mit Nicotinamid (DM / NIC; Tabelle 1); Futter täglich.
4. Nach drei Wochen in der Kultur, die Differenzierung Medien wechseln mit Nicotinamid und entweder Activin-A oder IDE-1 (DM / NIC / AA oder DM / NIC / IDE1; Tabelle 1) zu RPE Differenzierung zu verbessern.
5. Nach fünf Wochen in der Kultur, wechseln Sie wieder in DM / NIC. Fütterungszeiten sind nicht mehr notwendig, nachdem die pH-Indikatoren in den Medien nicht mehr drehen, gelb den Tag nach der Fütterung.
6. Warten Sie, bis Inseln pigmentierten Zellen angezeigt werden, die groß genug sind, um geschnitten und entfernt werden (siehe Abbildungen 2D-F und 3A).

2. Isola pigmentierte Inseln

1. Bestreichen Sie die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Matrix, die den natürlichen Zellumgebung (Xeno-frei ist vorzuziehen) nachahmt.
   HINWEIS: Cornea Messer und scharfen, spitzen Pinzette sind sehr nützlich für die Kommissionierung. Das gesamte Blatt von differenzierten Zellen können zu lösen, während Kommissionierung. Vermeiden Sie dies, indem Sie vorsichtig arbeiten und zunächst Kommissionierung Kolonien in der Mitte der Schale.
2. Füllen so viele Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen mit Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1), je nach Bedarf. Diese Entscheidung wird von der Anzahl der pigmentierten Kolonien hängengesammelt.
3. In einer Zellkultur Kapuze mit einem Binokular, von Hand ausgeschnitten pigmentierte Inselchen. Hacken jedes Inselchen an der Unterseite der Originalplatte mit einem Skalpell in etwa 2-6 Stücke und ergreifen Sie die pigmentierte Teile mit scharfen Pinzette.
4. Übertragen Sie 1-2 pigmentierte Stücke in jedem 24-Loch.
5. Medien für 3-5 Tage nicht verändern, bis die Zellen haften, dann starten verändernden Medien drei Mal pro Woche. (Wenn sie nicht nach dieser Zeit halten, ist die Wahrscheinlichkeit gut, dass sie nie tun).
6. Erweitern Zellen für 3-4 Wochen in Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1) - Ein Bild einer typischen Kultur wird in 3B gezeigt. Die Zellen können auch die gesamte noch nicht füllen, sondern wartet länger scheint nicht zu helfen. Feed-Zellen dreimal pro Woche.
7. Nach ca. 3 Wochen, Trauben von weißen Zellen manuell entfernen in Klumpen ggf. mit scharfen Pinzette. Diesen Schritt nicht tun, wenn es notwendig ist - es ist leicht zu Verunreinigungen einzuführen. Es ist ideal,versuchen, reinster Populationen von RPE von den ursprünglichen pigmentierte Kolonien in Schritt 1.6 erhalten.

3. Passagieren Stammzellen gewonnenen RPE

1. Lösen die Zellen mit 200 & mgr; l mit einer Zelldissoziationslösung (vorzugsweise nicht Trypsin ein Reagens, inaktiviert durch Verdünnung ist bevorzugt werden) bei 37 ° C für 5-8 min, und inaktivieren es durch Verdünnen mit DM. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und sie wieder zu suspendieren (Wenn der gewählte und nur wenige Zellen enthält, sollten Sie die Bündelung der Zellen, die aus zwei 24-Brunnen).
2. Zentrifuge (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen, und resuspendieren in 3 ml DM-Medien.
3. Wiederplatte Zellen aus einem (oder zwei) 24-Vertiefungen in einer Matrix beschichtet mit 6 Vertiefungen in 3 ml DM pro Napf (1: 5 Expansion).
4. Erweitern für 1-2 Wochen, bis sich die Zellen ~ 90% konfluent; ein Bild der ausdifferenzierten reine Kultur ist in 3C gezeigt.
5. Trennen Sie die Zellen mit 1 ml Zell dissociation Lösung für ca. 5-8 Minuten bei 37 ° C, zu inaktivieren es durch Verdünnen mit DM, verwenden Sie 1000 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und Resuspendieren sie.
6. Spin down (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen und Resuspension in 18 ml DM-Medien.
7. Wiederplatte Zellen von einer 6-well jeder in sechs Matrix beschichteten 6-wells in 3 ml DM pro Napf (1: 6 Expansion) oder einer beschichteten 75 cm ^{2 -Kolben} (1: 7.5 Expansion).
8. Die Schritte 3,4-3,8 wie nötig, bis genügend Zellen erhalten werden.
   HINWEIS: Versuchen Sie so viele Kolonien wie möglich für die Expansion und nicht planen, die Kulturen über Passagierung zu verstärken, da jeder Durchgang induziert RPE Entdifferenzierung zu sammeln.

Ergebnisse

Die in diesem Manuskript dargelegt, wie in 1 dargestellt Schritten kann verwendet werden, um ohne weiteres erzeugen RPE aus Stammzellen, wie zuvor berichtet ^10,12 werden. Nach Aufrechterhaltung der iPS-Linien für mehrere Wochen, beginnen pigmentierte Kolonien nach 5-7 Wochen (7 Wochen alten Kulturen werden in 2A-C gezeigt) in den Kolonien erscheinen. Diese Kolonien können weiterhin für Wochen wachsen die Kulturen gehalten. Nach Erzielung einer ausreichenden Größe, wie in

Diskussion

In diesem Manuskript wir einen Überblick über die Schritte, um eine große Anzahl von reinen iPS-RPE Kulturen effizient zu erzeugen. Wir haben bereits mit dieser gerichtet Differenzierung Protokoll mit Activin A, die wir iPS-RPE, die stark ähneln hRPE basierend auf Transkriptom, Proteomik, Metabolomik und Funktionalität zu generieren gezeigt, und dass sie zu verzögern Netzhautdegeneration, wenn in RCS Ratten implantiert ^12,31,32 . Der Prozess der Erzeugung iPS-RPE ist zeitaufwendig, aber nicht mühsam (...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hornhautmesser	Surgipro	SPOI-070	Messer x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Ca oder Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fötales Rinderserum, regulär (hitzeinaktiviert)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinante Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µ g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Ersatz	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamin 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
rekombinantes Aktivin für Mensch/Maus/Ratte	PeproTech	120-14E	10 & Mikro; g x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Platten	Corning	3877	Gehäuse(12) x 1
TrypLE-Express Enzym (1X), kein Phenolrot	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,1&Mikro; M Pore, 500ml	Corning	431475	Gehäuse(12) x 1