Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Zusammenfassung

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Es wurde keine Heilung für altersbedingte Makuladegeneration (AMD) entdeckt, die Hauptursache für Sehverlust bei Menschen über 55 Jahren. AMD ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung mit unbekannter Ätiologie, obwohl man weitgehend davon ausgeht, dass sie aufgrund des Todes oder einer Funktionsstörung des retinalen Pigmentepithels (RPE) auftritt, einer Monoschicht von Zellen, die der Netzhaut zugrunde liegt und die Photorezeptoren entscheidend unterstützt. RPE-Zellersatzstrategien können vielversprechend sein, um einer großen Untergruppe von AMD-Patienten therapeutische Linderung zu verschaffen, und RPE-Zellen, die primären menschlichen Zellen (hRPE) stark ähneln, wurden in mehreren unabhängigen Labors erzeugt, einschließlich unseres eigenen. Darüber hinaus beschränken sich die Einsatzmöglichkeiten von iPS-RPE nicht nur auf zellbasierte Therapien, sondern wurden auch zur Modellierung von RPE-Erkrankungen eingesetzt. Diese Art von Studien kann nicht nur die molekularen Grundlagen der Krankheiten aufklären, sondern auch als unschätzbare Werkzeuge für die Entwicklung und Erprobung neuartiger Medikamente dienen. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll zur gerichteten Differenzierung von RPE aus Stammzellen vor. Die Zugabe von Nicotinamid und entweder Activin A oder IDE-1, einem kleinen Molekül, das seine Wirkung nachahmt, zu bestimmten Zeitpunkten, erhöht die Ausbeute von RPE-Zellen erheblich. Mit dieser Technik können wir bereits in drei Monaten eine große Anzahl von RPE mit geringer Passage ableiten.

Einleitung

Die verschiedenen Zelltypen, die die Netzhaut besetzen, sind in einer funktionalen Architektur organisiert. Die Photorezeptoren im hinteren Teil der Netzhaut sind dafür verantwortlich, Licht durch Phototransduktion in elektrische Impulse umzuwandeln. Die Phototransduktion kann jedoch nicht ohne die koordinierten Bemühungen anderer benachbarter Zelltypen wie Mueller-Gliazellen und retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) stattfinden. Eine Monoschicht aus RPE-Zellen trennt die sensorische Netzhaut von der Choriokapillaris, der primären Blutversorgung für Photorezeptoren, und ist ideal positioniert, um mehrere Funktionen zu steuern, die für die Photorezeptorhomöostase wichti....

Protokoll

1. gerichteten Differenzierung von Stammzellen gewonnenen RPE

Anmerkung: Alle Inkubationsschritte werden bei 37 ° C in 5% CO ₂ durchgeführt

1. Pflegen Sie die hES oder Hüfte Linien (täglich füttern) in Erhaltungsmedium (MM; Tabelle 1). Sobald die Leitungen ausreichende Standards der Qualitätskontrolle zu erreichen, halten sie auf einer Schicht von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) ausgesät mit einer Dichte von 250.000 / well eines Sechs-Well-Platte. Xeno freien Kulturen kann auch nach der von Tucker et al. ⁴⁰ festgelegten Protokoll erzeugt werden.
....

Ergebnisse

Die in diesem Manuskript dargelegt, wie in 1 dargestellt Schritten kann verwendet werden, um ohne weiteres erzeugen RPE aus Stammzellen, wie zuvor berichtet ^10,12 werden. Nach Aufrechterhaltung der iPS-Linien für mehrere Wochen, beginnen pigmentierte Kolonien nach 5-7 Wochen (7 Wochen alten Kulturen werden in 2A-C gezeigt) in den Kolonien erscheinen. Diese Kolonien können weiterhin für Wochen wachsen die Kulturen gehalten. Nach Erzielung einer ausreichenden Größe, wie in

Diskussion

In diesem Manuskript wir einen Überblick über die Schritte, um eine große Anzahl von reinen iPS-RPE Kulturen effizient zu erzeugen. Wir haben bereits mit dieser gerichtet Differenzierung Protokoll mit Activin A, die wir iPS-RPE, die stark ähneln hRPE basierend auf Transkriptom, Proteomik, Metabolomik und Funktionalität zu generieren gezeigt, und dass sie zu verzögern Netzhautdegeneration, wenn in RCS Ratten implantiert ^12,31,32 . Der Prozess der Erzeugung iPS-RPE ist zeitaufwendig, aber nicht mühsam (.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hornhautmesser	Surgipro	SPOI-070	Messer x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Ca oder Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fötales Rinderserum, regulär (hitzeinaktiviert)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinante Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µ g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Ersatz	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamin 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
rekombinantes Aktivin für Mensch/Maus/Ratte	PeproTech	120-14E	10 & Mikro; g x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Platten	Corning	3877	Gehäuse(12) x 1
TrypLE-Express Enzym (1X), kein Phenolrot	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,1&Mikro; M Pore, 500ml	Corning	431475	Gehäuse(12) x 1