Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung von Primärkulturen von murinen und humanen ösophagealen Stromazellen mit einem Myofibroblasten-Phänotyp. Kultivierte Zellen haben eine spindelförmige Morphologie, exprimieren α-SMA und Vimentin und es fehlen epitheliale, hämatopoetische und endotheliale Zelloberflächenmarker. Charakterisierte Stromazellen können in funktionellen Studien zu epithelial-stromalen Wechselwirkungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Murine und menschliche Speiseröhre Myofibroblasten werden über enzymatische Verdauung erzeugt. Neugeborene (8-12 Tage alt) murine Speiseröhre wird geerntet, zerkleinert, gewaschen und bis zur enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 25 min unterzogen. Menschliche Speiseröhre Resektionsproben aus Muscularis propria und Adventitia befreit und der verbleibende Schleimhaut zerkleinert und einem enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 6 h unterzogen. Kultivierte Zellen exprimieren α-SMA und Vimentin und Desmin ausdrückliche schwach oder gar nicht. Die Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Epithelzellen, hämatopoietische oder Endothelzellen. Kultur Reinheit wird durch durchflusszytometrische Beurteilung der Zelloberflächenmarker Expression potentieller Gefährdungs ​​hämatopoetischen und Endothelzellen bestätigt. Das beschriebene Verfahren ist einfach und führt zu einer konsistenten Erzeugung nicht hematopoieitc nicht endothelial Stromazellen. Einschränkungen dieser Technik sind inhärent auf die Verwendung vonPrimärkulturen in der Molekularbiologie Studien, dh die unvermeidlichen Schwankungen zwischen den Kulturen in den verschiedenen Mäusen oder Menschen fest gestoßen. Primäre Kulturen sind jedoch ein repräsentativer Reflexion des in vivo-Zustand im Vergleich zu Zelllinien. Diese Verfahren stellen auch Forscher die Fähigkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen und experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Dadurch gekennzeichnet Speiseröhren Stromazellen können auch in funktionalen Studien, die epithelial-stromale Wechselwirkungen in Erkrankungen der Speiseröhre verwendet werden.

Einleitung

Epithelial-stromale Wechselwirkungen an der Regulation einer Vielzahl von Gastrointestinaltrakt Funktionen einschließlich Schleimhautregeneration, Reparatur, Fibrose und Karzinogenese ^1,2 beteiligt. Diese Wechselwirkungen sind am besten in den Dünndarm und Dickdarm untersucht und kann in ähnlicher Weise eine Rolle bei der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen ^3. Eine Subpopulation von Darm und Kolon Stromazellen bezeichnet Myofibroblasten wurde gezeigt, dass bei der Vermittlung der Gewebeschädigung, Entzündung teil und Reparatur ^4,5. Im distalen Gastrointestinaltrakt werden diese spindelförmige Zellen angrenzend an die Basalmembran an der Grenzfläche zwischen Epithel und Lamina propria und werden als α-SMA und Vimentin positiv definiert, pan-Cytokeratin negativ und schwach positive oder Desmin negativ ^5.

Die Speiseröhre Stroma wurde nicht konsequent auf zellulärer oder molekularer Ebene charakterisiert. Unsere Arbeit im murinen Speiseröhre demonstrated α-SMA und Vimentin-Zellen in der Speiseröhre Stroma, gelegentlich darunter liegenden zu dem Plattenepithel ^6. Epithelial-Stroma-Wechselwirkungen in der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen wie Magen- und Speiseröhren vermittelten Verletzung ⁶ und eosinophile Ösophagitis ³ in Verbindung gebracht. Fibrotischen Strikturen auch eine bekannte Komplikation der Schädigung der Speiseröhre und Stromazellen in der Pathogenese von gastrointestinalen Fibrose in Verbindung gebracht. Isolation dieser Zellen wird dazu beitragen, zu tun, die notwendigen Studien zur gestörten Signalwege zu untersuchen.

Diese Vorlage enthält die erforderlichen Primärkulturen von α-SMA positiv, Vimentin positiven Myofibroblasten, dass bestehende Wissenslücken in Bezug auf Signalwege vermitteln, diese Interaktionen angesprochen werden kann etablieren Techniken. Die beschriebene Technik wurde erfolgreich von den Autoren verwendet wird, um primäre murine Colon Myofibroblasten ⁷ und furthe etablierenr für die Einrichtung von murinen ⁶ und Menschen Myofibroblasten-ähnlichen Speiseröhren Stromazellen angepasst.

Wir beschreiben hier Bedingungen benötigt, um festzustellen und zu charakterisieren diese Kulturen von Maus oder Mensch Ösophagus vor in Zukunft funktionelle Studien verwenden etabliert. Kulturen angebaut und für bis zu 15 Passagen genutzt werden. Isolation und Etablierung von Primärkulturen über die Methoden unten beschrieben erzeugt Stromazellen mit Myofibroblasten Phänotyp; α-SMA, Vimentin positiv und schwach positiv oder negativ für Desmin und Cytokeratin negativ. Dieser Phänotyp unterscheidet sich vom Phänotyp des Ösophagus Fibroblasten, die überwiegend Vimentin ist positiv, α-SMA negativen ³ oder der α-SMA positiv, Vimentin-negativen Phänotyp des Muscularis mucosae ^6.

Protokoll

Das Protokoll zu Tierversuchen, die Grundlagen und Ziele der Forschung durchzuführen, von der University of Southern California Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss eingereicht und genehmigt wurden.

Das Protokoll für die Einrichtung von Primärkulturen von de-identifizierte menschliche Speiseröhre Proben wurde von der University of Southern California Institutional Review Board genehmigt.

1. Besorgen Sie Maus oder Mensch Ösophagus

1. Erhalten Maus Ösophagus:
   1. Euthanize die 8-12 Tage alten Maus mit 2% Isofluran Inhalationsdosis durch Genickbruch folgte.
   2. Pin das Tier sich mit Bauch nach oben und benetzen die Bauchseite mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen und heben Sie die Haut anterior der Harnröhrenöffnung mit einer Pinzette. Verwenden Sie gerade Standard-OP-Schere entlang der ventralen Mittellinie von der Harnröhrenöffnung bis zum Kinn geschnitten. Achten Sie darauf, nur die Haut geschnitten.
   3. Einen Einschnitt von der Harnröhrenöffnung nach unten auf das Knie auf beiden Seiten des Tieres, wodurch ein umgekehrtes "Y". Eine weitere Einschnitt auf beiden Seiten des Tieres entlang der Rippen.
   4. Die Haut sorgfältig schälen auf beiden Seiten, aus der zugrunde liegenden Bauchfell und den Brustkorb und legte sich an den Seiten. Untersuchen der Brustkorb über der Brusthöhle und das Peritoneum über der Bauchhöhle.
      1. Heben Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und durchschneiden bis zum Zwerchfell und Brustkorb und zeigte Schere nach oben, um Schäden an Bauch Inhalte zu verhindern. Gently heben Sie den linken Leberlappen, legen das darunterliegende Magen, der Speiseröhre und Magen-Kreuzung und die Bauch Teil der Speiseröhre.
   5. Verwenden autoklaviert chirurgische Scheren durch das Brustbein und Brustkorb entlang der Mittellinie bis zu den Hals Gürtel geschnitten. Punkt Schere nach oben, um eine Beschädigung der thorakalen Inhalte zu verhindern. Voll den Inhalt des ExposesBrusthöhle durch Ziehen des Brustkorbs zu den Seiten.
   6. Das Herz und die beiden Lungenlappen vorsichtig entfernen. Absorbieren überschüssiges Blut mit Q-Tips. Die Brust-Ösophagus ist ein schmaler, flexibler Schlauch liegen hinter der Luftröhre und anterior der Brustwirbel.
      HINWEIS: Die Speiseröhre kann schwierig sein, in murinen Neugeborenen identifizieren. Lokalisierung des Ösophagus und Magen-Kreuzung macht Speiseröhren Identifikation unkompliziert.
   7. Befolgen Sie sorgfältig die Speiseröhre aus dem Magen, sezieren die umliegende Gefäßsystem, Fett und Gekröse den ganzen Weg bis zu der Speiseröhre Ursprung im Halsraum. Chirurgische Schere mit stumpfer Spitze am besten für diesen Zweck.
   8. Resezieren die gesamte Länge der Speiseröhre und in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung (HBSS) zur weiteren Verarbeitung weiter unten beschrieben. Entfernen Sie einen Teil des Magens zur Orientierung, wenn gewünscht.
      HINWEIS: Aufgrund der kleinen Gewebegröße, die Trennung der Muscularis propria von der Muskelist Schleimhaut nicht in murine Neugeborenen Speiseröhre erreichbar und die gesamte Speiseröhre zu Verarbeitung nachfolgend beschriebenen unterzogen.
2. Erhalten Menschen Ösophagus:
   1. Waschen Sie Ösophagusresektion Proben (typischerweise 5 cm oder weniger) mit HBSS und entfernen Sie alle angeschlossenen Bindegewebe, Fett oder Gefäßsystem.
   2. Resektion eines Teils der Probe und setzen in Formalin für zukünftige histologische Untersuchung, falls gewünscht.
   3. Trennen Sie die übrigen Schleimhaut aus Basis Muscularis propria durch scharfe Dissektion.
   4. Geschnitten Schleimhaut in Unterzentimeter Fragmente und unter der nachstehend beschriebenen Protokoll.
      HINWEIS: Human Speiseröhre Resektionen in PBS für bis zu 6 Stunden vor der Verarbeitung nachfolgend beschrieben gelagert werden. Quelle der Ösophagektomie Proben wird diktieren, Probengröße und Laborabhängig sein.

2. Isolieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen

1. Isolieren der Speiseröhre Stromazellen from murinen und menschlichen Gewebes durch eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Verdau.
   1. Mechanisch verdauen durch Zerkleinern des Gewebes mit einer Schere und mehrmaligem Waschen mit HBSS. Enzymatisch zu verdauen durch Inkubieren des Gewebes mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase, für 25 min (murine Gewebe) oder bis zu 6 Stunden (menschliches Gewebe). Stellen Sie sicher, dass Instrumente zur Zerkleinerung verwendet wurden autoklaviert und sterilisiert.
      HINWEIS: Kollagenasen sind Enzyme, die Kollagen, eine extrazelluläre Matrix zur Aufnahme von tierischem Gewebe zusammen verantwortlich Protein zu brechen. Kollagenase XI hat hohe Collagenase-Aktivität und hat Erfolg in dieser Isolierungsprotokoll gesehen. Dispase ist ein bakterielles Enzym mit milden proteolytische Spaltaktivität, welche Zellmembran-Aktivität bewahrt und wird in Kombination mit Kollagenase als Sekundärenzym verwendet.
   2. Zeigen Schleimhautfragmente aus der Maus oder menschlichem Gewebe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder 5 ml jeweils erhalten, die HBSS. Mince Gewebe weiterin 2-3 mm große Stücke mit einer Schere mit einem offenen Spitzenbreite, die in ihre Röhrchen passen. Planen Sie ausreichend Zeit, damit für Ösophagus-Schleimhaut-Fragmente an den Boden des Röhrchens sedimentieren.
   3. Langsam dekantieren HBSS, darauf achten, daß das Gewebe versehentlich zu verwerfen. Ersetzen mit frischem HBSS folgenden durch leichtes Schütteln. Alternativ zu entfernen HBSS mit einer 1 ml Pipette.
   4. Waschen Gewebe auf diese Weise insgesamt 8 Mal unter leichtem Schütteln in zwischen den Waschgängen so dass genügend Zeit für Speiseröhren Fragmente zwischen jedem Wasch sedimentieren.
      HINWEIS: Human Tissue mehr benötigen Hacken, dass Neugeborene Mausgewebe.
2. Inkubieren murinen Gewebe mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase für 25 min auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt.
   1. Inkubieren menschlichem Gewebe mit 300 U / ml XI Kollagenase und 0,1 mg / ml Dispase für bis zu 6 Stunden, auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt.
      HINWEIS: Die Verfügbarkeit von menschlichen esophagus variabel ist. Menschen Ösophagusmukosa mit Enzymen für bis zu 6 h führt zu erfolgreichen Generation von Primärkulturen inkubiert.
3. Nach enzymatische Verdauung, Hackfleisch Gewebe weiter mit Schere und Zentrifuge bei 200 g für 10 min.
4. Überstand verwerfen. Übertragen der Pellets, die aus einer gemischten Zellsuspension auf eine 5-ml-Röhrchen und waschen 5mal in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 2% Sorbitol ergänzt um nicht lebensfähige Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
5. Samenzellen in 6-Well-Platten und die Kultur in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mg / ml Insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ug / ml Gentamicin und 2 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) . Vakuumfilter (0,22 um) Alle Komponenten außer EGF die nach Filtration zugesetzt werden können. Verteilen Zellen aus menschlichen Resektionsproben erhalten unter mehreren Platten mit 6 Vertiefungen, abhängig von der Größe der Resektion.
6. Sobald Brunnen sind 80% konfluent, Gang anhaftenden Zellen zu T25-Kolben unsing 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Neutralisieren mit Medien und Spin bei 400 x g.
   1. Bei einem 6 gut Gang zu einem T25-Kolben, Passage-Zellen bei einer 1: 1-Verhältnis. 3-Verhältnis: 2 oder 1: Konfluente T25-Kolben kann zu einem 1 agiert werden. Um den Durchgang von einer T25-Flasche mit einem T75-Kolben, mit einem 1: 1 Verhältnis. Medienwechsel alle 2-3 Tage, unabhängig von dem Behälter.
   2. Wachsen Zellen bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% CO ₂ -Inkubator und Kultur in den oben beschriebenen myofibroblast Medien.
      HINWEIS: Epithelzellen nicht unter diesen Kultur oder Gang Bedingungen zu überleben. Zellen zur Charakterisierung und in den unten beschriebenen Studien verwendet werden, sind zwischen den Passagen 5 und 15.
   3. Cryo-Erhaltung Zellen in flüssigem N ₂ durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid in die Myofibroblasten Medien.

3. Charakterisieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen

1. Untersuchen Sie die Morphologie der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Beachten Sie die spindelförmigeMorphologie der anhaftenden Zellen (Abbildung 1).
2. Charakterisierung kultivierten Zellen durch Auswerten der folgenden Zytoskelett-Marker: α-SMA, Vimentin, Desmin und Cytokeratin. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp exprimieren Zytoskelett myofibroblast Marker α-SMA und Vimentin (Abbildung 2).
   1. Zur weiteren Unterscheidung kultivierten Stromazellen aus Muskelzellen, für Desmin Immunfärbung. Zur Durchführung des Immunfärbung auf kultivierte Zellen, die Platte 1,5 x 10 ⁴ Zellen in 4-Well-Kammerobjektträgern und wachsen in Myofibroblasten Medien für 24 Stunden. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp wird schwach oder nicht vorhanden Desmin-Expression. Stromalen Zellen fehlt die Expression des epithelialen Marker pan-Cytokeratin (Daten nicht gezeigt).
      HINWEIS: Bewertung der Kulturen gehört die Bewertung von Zytoskelett Marker durch Immunzytochemie und Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Immuncytochemie als primäre Methode zur Charakterisierung als der Ex verwendetpression Profil der Proteine ​​des Zytoskeletts ist einzigartig für den Fibroblasten, Myofibroblasten oder Muskelzelle. Durchflusszytometrie stellt die Reinheit der Kultur durch Auswertung Zelloberflächenexpression von Epithel-, Endothel- und blutbildenden Zellen-Marker. CD90 ist nützlich als Zusatz Verfahren zur Identifizierung von menschlichen Stromazellen, wie es sowohl an menschlichen Fibroblasten und Myofibroblasten ausgedrückt. CD90 ist nicht hilfreich bei der Charakterisierung von murinen Stromazellen, wie es auch von Maus-T-Zellen exprimiert wird.
3. Nachdem die Zellen erreichen 60% Zusammenfluss gründlich Folien mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und befestigen mit Methanol. Inkubieren Zellen in Methanol für 10 min bei -20 ° C, dann in PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung.
4. Folgen Sie Standard-Immunfärbung Protokoll.
5. Kurz vor dem Aufbringen des primären Antikörpers, blockieren die fixierten Zellen mit 5% goatserum in PBS. Verdünnen Sie primäre und sekundäre Antikörper in 5% Ziegenserum als auch.
   1. Für den Nachweis von α-SMA und Vimentin, verwenden Sie dieFolgende Antikörper und Konzentrationen: Mouse mAb zu α-SMA bei 1: 250 Verdünnung und Rabbit pAb zu Vimentin bei 1: 500-Verdünnung.
   2. Inkubieren mit primärem Antikörper bei Raumtemperatur über Nacht bei 4 ° C, Spülen 3 mal mit PBS und fügen sekundären Antikörper Rhodamin-konjugiertes Ziege-anti-Maus bei einer Verdünnung von 1: 200 und Cy2 konjugierten Ziegen anti Kaninchen bei einer Verdünnung von 1: 1000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   3. Gegenfärbung Kerne mit 4 ', 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 1 ug / ml für 1 Minute und dann mit PBS waschen. Analysieren Sie Dias mit einem inversen Mikroskop.
6. Reinheit der Kulturen durch die Prüfung der murinen und humanen Ösophagus-Zellen, die für blutbildende (CD45) und Endothelzellen (CD31) Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3). Charakterisierung menschlicher Zellen durch die Expression von stromalen Zelloberflächenmarker CD90.
   HINWEIS: CD90 kann nicht verwendet werden, um murine Stromazellen murine T cel identifizierenls drücken auch CD90.
   1. Lösen kultivierten Maus Speiseröhren Stromazellen von den Kulturflaschen durch Behandlung mit nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung bei 37 ° C für 10 min, mit FACS-Puffer zweimal gewaschen, gezählt und mit FITC-CD45 und CD31-APC mit relevanten Isotypenkontrollen gefärbten gemäß Standard-Färbeverfahren.
   2. Sammeln Zellen mittels FACS Calibur und Daten mit FlowJo Software analysieren. Vor dem Färben von Zellen, Antikörper zu optimieren und titriert Konzentrationen mit Isotypkontrollen, normale Maus Milz und Knochenmarkzellen.

Ergebnisse

Ösophagus-Stroma-Zellen isoliert durch mechanische und enzymatische Verdauung werden zunächst vernickelt und in 6-Well-Platten kultiviert. Untersuchung von Zellen mit einem inversen Mikroskop innerhalb von Stunden nach Plattierung zeigt eine gemischte Zellsuspension lose anhaftenden zum Plattenboden (1A). Im Laufe der nächsten 24 Stunden, sind spindelförmige Zellen, fest haft an den Plattenboden beobachtet Aufnahmen aus der gemischten Zellsuspension (1B) .Diese sprießen Zellen auf das g...

Diskussion

Die Techniken zur Primärkultur Generation sind in der Regel ähnlich bei der Verwendung von murinen oder menschlichen Gewebes mit Hacken und Aufschlusszeiten für Gewebegröße angepasst. Unsere Erfahrungen mit murinen Gewebe schlägt vor, dass mit den oben beschriebenen Methoden konsequent in erfolgreiche Etablierung der Primärkulturen führen. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die Sterilisation von chirurgischen Geräten und folgenden Norm sterile Techniken der Gewebekultur. Das Alter der Mäuse ist auch ein en...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gewebekulturreagenzien
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Kollagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbit	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrin	Roche	10-652-202-001
Trypsin/EDTA	Corning	25-052-Cl
Epidermaler Wachstumsfaktor	Sigma-Aldrich	E9644<
Ziegenserum	Sigma Aldrich	G9023
Maus mAB bis α-SMA	abcam	ab7817
Kaninchen pAB zu Vimentin	abcam	ab45939
Cy2 konjugiertes Kaninchen anti Kaninchen	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 konjugiert zu eFluor 450	eBioscience	48-0319-41
CD90 konjugiert zu APC	eBioscience	17-0909-41
Annexin V und 7AAD	BD Pharmigen	559763
Maus Fc-Block für CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Ausstattung
5 ml Röhrchen	Eppendorf	30108310
Inverses Mikroskop	Motic	AE31
Biosicherheitswerkbank und Inkubatoren	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4-Well-Kammer-Objektträger	Thermo Scientific	177437
Kühlzentrifuge	Eppendorf	5810R
Olympus Vakuum-Filtersystem	Genesee Scientific	25-227
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	Eclipse TE300
6-Well-Platten	Corning	3516
T25 Kolben	TRP	90026
T75 Kolben	Corning	43064
Präparierschere
Präparierzange Sezierzange
	Kendall	540500
Software
Metamorph Software (Molekulare Bauelemente)	Molekulare Bauelemente
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience

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