Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

Zusammenfassung

Makrophagen sind die Schlüsselzellen, die an der Pathogenität des Wirts beteiligt sind. Makrophagen weisen eine phänotypische und funktionelle Diversität auf, die durch Proteomanalyse analysiert und nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel wird beschrieben, wie eine 2D-Elektrophorese von Primärkulturen menschlicher Makrophagen durchgeführt wird, die in den M1- oder M2-Phänotyp differenziert sind.

Zusammenfassung

Das Ziel des hier beschriebenen zweidimensionalen (2D) Elektrophoreseprotokolls ist es, zu zeigen, wie der Phänotyp von menschlichen kultivierten Makrophagen analysiert werden kann. Die Schlüsselrolle von Makrophagen wurde bei verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie entzündlichen, immunologischen und infektiösen Krankheiten gezeigt. In diesem Protokoll verwenden wir Primärkulturen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die in den Phänotyp M1 (pro-inflammatorisch) oder M2 (entzündungshemmend) unterschieden werden können. Dieses in vitro Modell ist zuverlässig für die Untersuchung der biologischen Aktivitäten von M1- und M2-Makrophagen und auch für einen proteomischen Ansatz. Proteomische Techniken sind nützlich, um den Phänotyp und das Verhalten von M1- und M2-Makrophagen während der Pathogenität des Wirts zu vergleichen. Die 2D-Gelelektrophorese ist eine leistungsstarke Proteomtechnik zur gleichzeitigen Kartierung einer großen Anzahl von Proteinen oder Polypeptiden. Wir beschreiben das Protokoll der 2D-Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen, das als 2D-Differential-Gelelektrophorese (DIGE) bezeichnet wird. Die M1- und M2-Makrophagenproteine werden vor der Trennung durch isoelektrische Fokussierung entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in der ersten Dimension und ihrer Molekülmasse in der zweiten Dimension mit Cyaninfarbstoffen markiert. Getrennte Protein- oder Polypeptid-Spots werden dann verwendet, um Unterschiede in der Protein- oder Polypeptid-Expression zu erkennen. Die hier beschriebenen proteomischen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Makrophagenproteinveränderungen, die mit verschiedenen Erkrankungen wie Wirtspathogenität oder mikrobiellen Toxinen verbunden sind.

Einleitung

Makrophagen sind heterogen und Kunststoff-Zellen, die in der Lage, verschiedene funktionelle Phänotypen zu erwerben sind. In vivo werden diese Zellen auf eine Vielzahl von Mikroumwelt signalssuch mikrobielle Produkte, Cytokine, etc. ¹ In vitro. Die pro-inflammatorischen Phänotyps (M1) von Makrophagen durch Lipopolysaccharid (LPS) und dem anti-inflammatorischen Phänotyps (M2) durch einige Cytokine, wie Interleukin-4 (IL-4) induziert werden. Darüber hinaus können Makrophagen aus einem aktivierten M1 bis M2 Phänotyp zu wechseln, und umgekehrt, auf spezifische Signale ^2.

Abhängig von der Phänotyp wird Makrophagen verschiedene Funktionen haben. M1 Makrophagen sind Zellen, die pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNF-α) zu erzeugen, um Mikroorganismen oder Tumorzellen ³ töten. Im Gegensatz dazu M2 Makrophagen verhindern, dass diese Entzündungsreaktion wie bei der Wundheilung und Fibrose durch die Herstellung anti inflammatory Faktoren wie TGF-β ^3,4.

Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden Spendern wurden durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie zuvor beschrieben ⁵ wird eine von Boyum ⁶ angepaßt isoliert. Makrophagen in Kultur kann nach 6 Tagen Primärkultur ⁷ in M1 oder M2-Phänotyp unterschieden werden.

Analyse der Proteinexpression oder Proteinveränderungen zwischen den beiden Subtypen von Makrophagen unter verschiedenen gesteuerten Reize, wie Host Pathogenität oder mikrobielle Toxine, hilfreich sein, um die Funktionalität der pro- und anti-inflammatorischen Makrophagen zu entschlüsseln.

Proteomics sind einzigartige Werkzeuge zur direkten Überwachung von Proteinen, die spezifisch nach oben oder in der menschlichen kultivierten Makrophagen unter verschiedenen Stimuli herunterreguliert sind. Fluoreszierende Farbstoffe haben einige der Einschränkungen der 2D-Gelelektrophorese, wie niedrige Empfindlichkeit und Bildanalyse ⁸ gelöst ^< / Sup>. Die Farbstoffe reagieren mit Cystein-Reste haben die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu denen der Reaktion mit Lysinresten ⁹ erhöht. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Nützlichkeit DIGE Sättigungs Markierung für die Analyse von Proben knapp ¹⁰ gegenüber dem klassischen silbergefärbten 2D-Elektrophorese ^11. Diese Technologie ist hilfreich bei der schnellen Analyse von Proteinmodifikationen zwischen den zwei Subtypen von Makrophagen oder zwischen unbehandelten und behandelten Makrophagen aus dem gleichen Subtyp.

Die Vorteile dieser Technik sind Proteomik, die Zugang zu den Informationen der Proteingröße und post-translationalen Modifikationen durch Analyse der ^2D-Gel-12. Es sollte berücksichtigt werden, dass dies nicht ein hoher Durchsatz-Technik entnommen werden, wodurch die Anzahl der Proben, die analysiert werden können. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays, die auf Massenspektrometrie als prüft kürzlich ¹³ kann dies zu verbessern.

_content "> Hier präsentieren wir, wie man 2D DIGE Analyse aus der Proteinextraktion von kultivierten Makrophagen durch die Prozesse der Elektrophorese Isoelektrofokussierung durchzuführen, und SDS-PAGE sowie Informationen über den Nutzen einer angemessenen 2D-Software.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien unserer Institutionen menschlichen Forschungsethikkommission. Buffy-Coat von gesunden menschlichen Spendern wurden aus dem regionalen Blutspendezentrum (Lille, Frankreich) erhalten. Proben aus den Buffy Coats erhalten werden als Inserm Sammlung (n ° DC2010-1209) erklärt.

1. Material und Kultur Medienvorbereitung

1. Verdünnen 10x Phosphatpuffer Saline (PBS) in sterilem destilliertem Wasser, um 1x PBS erhalten.
2. Machen RPMI 1640 Medium mit Gentamicin (40 ug / ml) und L-Glutamin (2 mM), mit und ohne 10% gepooltem Humanserum.

2. Primärkulturen von Monozyten abgeleitete Makrophagen (MDM)

1. Verdünnte Buffycoat (25 ml) mit 1x PBS. Sorgfältig auf einem Ficoll / Leucosep Rohr und Zentrifuge laden bei 1.600 × g für 20 min bei Raumtemperatur.
2. Sammeln Monozyten an der Schnittstelle in ein neues Röhrchen. Waschen 3x mit 10 ml 1 × PBS mit 0,1% EthylendiamintetraEssigsäure (EDTA) durch aufeinanderfolgende Zentrifugation bei 1.000 × g, 370 xg und 160 g für 10 min jeweils, und dann einmal in 1 × PBS allein bei 160 × g für 10 min.
3. Zellpellet in 5 ml RPMI-1640-Medium ohne Serum und Samen, die Zellen in 35 mm-Schalen in einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen pro Schale.
4. Nach der Sedimentation für 90 min im Brutschrank, den Überstand verwerfen die nicht-adhärenten Zellen enthält. Die adhärenten Zellen zu waschen, die aus Monozyten, 3 x mit je 1 ml PBS; dann 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% (v / v) Humanserum zu den zuvor serumfreie Zellen.
5. Nach 6 Tagen in Kultur, um alternative differenzierten Makrophagen (M2) zu erhalten, fügen rekombinantes humanes IL-4 (15 ng / ml) und für 6 Tage beibehalten. Dann behandeln differenzierten Makrophagen mit Lipopolysaccharid (100 ng / ml) am Tag 12 für 4 h auf M1 Makrophagen zu erhalten.

3. Extraktion von M1 und M2 Makrophagen Proteine ​​für 2D-Elektrophorese

1. Wash macrophAlter dreimal mit 25 mM Tris, pH 7,4, und Schrott in Puffer, enthaltend 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M Thioharnstoff und 7 M Harnstoff.
2. Lyse-Zellen unter Verwendung eines Mischers für 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 5 min in Eis und bei -20 ° C.
3. Bestimmen Proteinkonzentration unter Verwendung eines kommerziellen Bradford-Reagenz. Speichern 100 ul Aliquots der Proteine ​​bei -20 ° C bis zur Verwendung.

4. Isoelektrofokussierung

HINWEIS: Führen Sie alle Markierungsverfahren in der Dunkelheit.

1. Verringern 5 ug jeder Probe (M1 und M2 Makrophagen) mit 2 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) für 1 h auf 9 & mgr; l mit Lysepuffer eingestellt auf 37 ° C.
2. Hinzufügen Cyanin 3 (Cy3) bis M1 und M2 Extrakt Sulfhydryl-reaktive Farbstoffextrakt in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein. Hinzufügen Cyanin 5 (Cy5) bis M1 und M2 Extrakte in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein und inkubierenfür 30 min bei 37 ° C.
3. Stoppen der Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens von Probenpuffer, 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3-markierten M1 Proben mit Cy5-markierten M2 Proben in einer Hand und Cy3-markierten M2 Proben mit Cy5-markierten M1 Proben in einer anderen Hand.
5. Rehydrieren einen immobilisierten pH-Gradienten (IPG) -Streifen (240 mM, pH 3-10 linearen Gradienten) mit 450 ul der markierten gemischten Proben in Puffer, enthaltend 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS auf einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) Zellsystem 24 h ohne irgendeine Strom.
6. Fokussieren bei 300 Volt (V) für 3 Stunden und dann mit einem Gradienten bis 1000 V für 6 h mit einem Gradienten bis 8000 V für 3 Stunden und schließlich bei 8000 V für 3 Stunden.

5. Zweite Dimension

HINWEIS: Führen Sie alle Elektrophorese Verfahren in der Dunkelheit.

1. Inkubieren Sie die IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffers enthaltening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M Harnstoff, 2% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 30% (v / v) Glycerin für 10 min.
2. Übertragen die äquilibrierte IPG-Streifen für die zweite Dimension (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)) auf 12,5% PAGE-Gelen und Dichtung mit niedrigschmelzendem Agarose.
3. Durchführung der Elektrophorese bei 20 ° C unter Verwendung eines Ettan-Daltsix System bei einer konstanten Spannung von 70 V über Nacht mit 300 V, gefolgt, bis die Bromphenolblau-Front den Boden des Gels erreicht.

6. Image Acquisition und bioinformatische Analyse

1. Scan Gele zwischen den beiden Niederfluoreszenzglasplatten gegossen mit einem DIGE Imager Scanner Anregungs- / Emissionswellenlängen von 532/580 nm und 633/670 nm Cy3 für Cy5, um Bilder mit einer Pixelgröße von 100 & mgr; m zu ergeben.
2. Führen Sie die Bildanalyse mit kommerzieller Software wie vorher beschrieben ^12.
3. Berechnen und normalisieren Spotvolumina in jedem Bild. Vergeben Sie einen normalisierten Spotvolumen als Requisitortion des Gesamtwerts jedes Spots detektiert im Gel.
4. Analysieren der Unterschiede im Proteinspotvolumen für jede Art von Makrophagen durch Vergleichen der normalisierten Punktvolumenwert zwischen den beiden Gruppen (M1 und M2). Betrachten Sie den Unterschied zwischen den Spotvolumina signifikant zu sein, wenn die Änderung 1,5 fache (p <0,05, one-way ANOVA-Analyse).

Ergebnisse

Um entsprechende Differenz Proteomanalyse durchzuführen, sollte die Verarbeitung von zu analysierenden Proben überprüft werden.

Im dargestellten Beispiel ist die Zellkulturqualität von Makrophagen für die morphologische und molekulare Aspekte erforderlich, wie zuvor veröffentlicht ^5. Die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und die Homogenität der Kultur wurde durch Phasenmikroskopie verfolgt. Figur 1 zeigt ein Beispiel von primären Kulturen von M1 und M2 ...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll Details eines Verfahrens, um die Auswirkungen verschiedener Stimuli der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (anti-inflammatorische) analysieren. Primärkulturen von M1 und M2 Makrophagen wurden aus der Differenzierung der Monozyten, erhalten wie zuvor veröffentlichten ^7.

Das Verfahren von 2D DIGE Gelelektrophorese erfordert spezielle Materialien und Ausrüstung, wie IEF-Zelle für Isoelektrofokussierung, low-Fluoreszenzpla...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-Glutamin-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
Gentamycin 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
Humanserum	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1.077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
6-Well-Platte PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
Lipopolysaccharid	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Forschung Organische Stoffe	3.00E+01
Filter 0.22 &Mikro; m	Millipore	SCGPTORE
100 ml Zylinder	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford-Reagenz	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-Reaktivfarbstoff	GE Healthcare	25-8009-83
IPG-Streifen 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean IEF-Zelle	Bio-Rad	165-4000
Niedrigschmelzende Agarose	Invitrogen	15517-014
Ettan-Daltsix System	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Nichtlineare Dynamik
50 ml Röhrchen	beliebig	n/a
15 ml Tuben	beliebiger Lieferant	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
Uré e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Bromphenolblau	Sigma-Aldrich	114391
Glycerin	Sigma-Aldrich	G6279
Acrylamid 40%	Bio-Rad	161-0148
2D-Reinigung	GE Healthcare	80-6454-51
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé Thylformamid	Sigma-Aldrich	22705-6
Elektrodendochte	Bio-Rad	165-4071