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Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

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DOI:

10.3791/52227

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30. November 2015

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1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir skizzieren eine Methodik für die Verarbeitung von Vollblut, um eine Vielzahl von Komponenten für die weitere Analyse zu erhalten. Wir haben ein optimiertes Protokoll optimiert, das eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung von Vollblutproben mit hohem Durchsatz in einer nicht-klinischen Umgebung ermöglicht.

Zusammenfassung

Erhebung und Verarbeitung von Vollblut-Proben in einem nicht-klinischen Umfeld bietet eine einzigartige Gelegenheit, selbstständig lebenden Personen mit und ohne Vorerkrankungen zu bewerten. Schnelle Verarbeitung dieser Proben ist wichtig, um eine Verschlechterung der zellulären Schlüsselkomponenten zu vermeiden. Dazu zählen Verfahren zur gleichzeitigen Pbmc (PBMC), DNA, RNA und Serum-Isolierung aus einer einzigen Blutprobe in den Häusern der zustimmenden Teilnehmer in einem Ballungsgebiet durchgeführt, mit der Verarbeitung innerhalb von 2 h Sammlung initiiert. Wir haben diese Techniken verwendet werden, um mehr als 1.600 Blutproben ergeben konsistente, hochwertige Materialien, die später in erfolgreiche DNA-Methylierung, Genotypisierung, Genexpression verwendet worden ist und Strömungsanalysen Zytometrie verarbeiten. Einige der verwendeten Methoden sind Standard; Wenn sie jedoch in der beschriebenen Weise kombiniert werden, eine effiziente Verarbeitung von Proben von Teilnehmern populations und / oder gemeinschafts ermöglichen siebasierte Studien, die normalerweise nicht in einer klinischen Umgebung ausgewertet würde. Daher hat dieses Protokoll die Möglichkeit, Proben (und anschließend Daten), die mehr repräsentativ für die allgemeine Bevölkerung zu erhalten.

Einleitung

Mehrere Studien haben Unterschiede in der Genexpression, DNA-Methylierung und Zell-Untergruppe im Blut bei Menschen mit und ohne geistige (oder anderen) Erkrankungen 1-4 gekennzeichnet. Diese Studien haben jedoch in klinischen Settings, in denen krankheitsassoziierten Unterschiede können aufgrund des allgemein schwerer Natur der Krankheiten, für die Patienten, die Behandlung vergrößert werden erhalten. Aufgrund der Fortschritte in der "Omics" Ansätze hat die letzten zehn Jahre eine Explosion von Interesse an biologischen Proben aus Community und / oder epidemiologische Einstellungen 5-7, um populationsbasierte Schätzungen der Prävalenz der Krankheit geben und ein umfassenderes Bild des Gesehenen Umweltfaktoren dieser geistigen und / oder körperlichen Krankheiten.

Eine der größten Herausforderungen in dieser Hinsicht ist die Voraussetzung für eine schnelle Verarbeitung der gesammelten Proben. Abbau von mononuklearen Zellen, Schlüssel Immunsystem Komponenten, die frequentl sindy verwendet werden, um beurteilen die Gesundheit einer Person, beginnt unmittelbar nach Blutentnahme mit einer signifikanten Abnahme der Wiederaufnahme nach 2 Stunden der Sammlung 8-10. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen wir Ihnen ein optimiertes Protokoll, bei dem mehrere Komponenten von menschlichem Vollblut gleichzeitig von Proben in den Häusern von Themen, die in einem großen Stadtgebiet erhalten wurde, isoliert. Das Protokoll ist nach unserer Zusammenstellung und Modifikation der aktuellen Techniken, einschließlich der Speicherung aller "extra" Fraktionen bei Zukunftstechniken ermöglichen eine weitere Isolierung der Basis / Analysen. Alternative Verfahren oder Kits können anstelle der hier beschriebenen einzelnen Methoden diejenigen umrissen eingesetzt werden haben sich als zuverlässige und effiziente Einrichtung zum Verarbeiten von Proben in einem Hochdurchsatz-Art sein. Hochwertige Fraktionen (PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Blut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung und alle Test-ready Proben produzierten verfügbar innerhalb von 2 Tagen (Abbildung 1 sein).

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effiziente Verarbeitung von Proben aus Community-Wohnung, erwachsenen Einwohner der Stadt von Detroit für die Prüfung in der Detroit Neighborhood Health Study gesammelt aktivieren (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), eine bevölkerungsbezogene Studie über die sozialen und biologischen Determinanten der posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD) und anderen psychischen Erkrankungen. Die Prävalenz von PTSD in Detroit mehr als zweimal der nationale Durchschnitt 11,12. Identifizierung von biologischen Determinanten von PTBS in dieser Population kann helfen, geeignete pharmakologische und / oder kognitiv-verhaltenstherapeutische Maßnahmen, um diejenigen, die an der Krankheit zu unterstützen entwickeln, sowohl in diesem städtischen Bevölkerung und in anderen Hochrisikogruppen (zB der Rückkehr Kriegsveteranen). Unser Labor, die zuvor an der Wayne State University in Detroit, Michigan, wurde für die Verarbeitung basierend auf unserem Know-how im Umgang mit frischen Gewebeproben von einer Vielzahl abgeleitet gewähltvon Quellen, um die Notwendigkeit, die Bearbeitung der Proben innerhalb von 2 Stunden der Sammlung zu beginnen, und unsere Nähe zu den Sammelstellen. Mit dieser einzigartigen Gelegenheit, bei der Hand, war es unser Ziel, um die Verarbeitung für höchste Ausbeute von DNA, RNA, Serum und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von jeder Probe (insgesamt N = 1.639 Proben über 5 Wellen der Probenentnahme) zu optimieren. Die hier beschriebenen Verfahren können gleichzeitig in einer nicht-klinischen Umfeld durchgeführt werden, wodurch Ausgangsmaterial (siehe Tabelle 1 für die Durchschnittserträge) für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Microarray, epigenetischen, Echtzeit-RT-PCR und Durchflusszytometrie analysiert.

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Abbildung 1. Gesamtarbeitsablauf. Die hier dargestellte Gesamtprozess umfasst die Logistik der Gewinnung der Blutproben von der Identifizierung zustimmenden particnehmer in die Blutabnahme selbst. Hochwertige, Fraktionen (periphere mononukleäre Blutzellen; PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Vollblut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung produziert werden und alle Test-ready Proben können innerhalb von 2 Tagen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus sind die durch dieses Verfahren hergestellten Fraktionen geeignet für Langzeitspeicherung, wenn die Proben nicht sofort getestet werden. Der gesamte Zeitachse hier skizzierten konnte an einem einzigen Tag (~ 5 Stunden insgesamt) abgeschlossen sein. Allerdings würde ein solcher Tag extrem arbeitsintensiv insbesondere für einen Monteur mit umfassender Erfahrung mit den Techniken. Daher empfehlen wir, Aufteilen der Verfahren an Tag 1 zwischen mindestens zwei Techniker und Abschluss der RNA-Prozessierung am Tag 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

Die Detroit Neighborhood Health Study wurde überprüft und von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt. Alle Teilnehmer, sofern vor ihrer Teilnahme an der Studie informierte Zustimmung.

1. Überblick

  1. Richtig dokumentieren alle Phasen von der Einstellung durch die Analyse von Endpunktdaten. Führen Sie die Protokolle an Tag 1 gleichzeitig, Schaltstufen und überlappenden, wie es die Zeit erlaubt. Die Folge von Stufen wird geschrieben, um Leistungseffizienz zu optimieren. Abbildung 1 gibt einen Überblick über den gesamten Prozess.
    Hinweis: Der Begriff "Teilnehmer" wird durchgehend verwendet, um die de-identifizierte Blutprobe von einem mündigen Individuum gezeichnet zu bedeuten. Die Zeiten, in Klammern unter anzuzeigen, Hands-on-Zeit. Beispiele für das Tracking-Blatt und Probenprotokoll kann im Ergänzungs Tabellen S1 und S2 zu finden sind. Die Proben werden durch phlebotomists in den Häusern gesammeltvon Einzelpersonen als Zustimmung Teilnehmer vom Studienkoordinator und zum Labor transportiert durch einen Kurier identifiziert (siehe Zusatzinformationen (SI) 1 für eine weitere Vorverarbeitung Details).

2. Tag 1 Setup-

  1. Vorbereitung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Heizen Sie einen Wärmeblock bis 56 ºC.
  3. Bereiten Sie die Protease (siehe SI 2) durch Aliquotierung 20 & mgr; l in die entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhrchen für die Tageslieferungen (2 pro Teilnehmer).
  4. Stellen Sie sicher, Puffer AW1 und AW2 (Waschpuffer in der DNA-Isolation Kit, das die Reinheit der DNA zu erhöhen) sind bereit für den Einsatz, indem 100% Ethanol, wie auf dem Etikett angegeben, falls erforderlich.
  5. Abkühlen Kühlzentrifuge bis 4 ° C.
  6. Setzen Sie die Kappe auf der Flasche 1x PBS mit dem mitgelieferten Gummimembran Kappe und durchbohren die Gummimembran mit einer Überführungsnadel, Beibehaltung der Schraubverschluss auf dem Transfer spike, um Verdunstung zu verhindern. Wiederholen Sie mit der Flasche RNA Stabilisierungslösung.
  7. Nach der Herstellung des Puffer, Zentrifuge und Wärmeblock, dokumentieren die Zeit der Vacutainer-Lieferung auf dem Probenverfolgungsblatt (siehe Tabelle SI).

3. Tag 1: Verarbeitungsvollblut-Probe für die DNA, PBMCs und Leukozyten-RNA (2 Stunden)

  1. Überblick
    1. Allot genügend Zeit, um die Verzögerung zwischen Blutentnahme und Verarbeitungsstartzeit zu minimieren. Beginnen Verarbeitung der Ficoll enthält Vacutainern innerhalb von 2 h der Blutabnahme, um eine Erhöhung der roten Blutkörperchen Kontamination und eine Abnahme der mononuklearen Zellwiederherstellung zu vermeiden.
    2. Nehmen Ansammlung von 2 Vacutainern gesammelt, die Ficoll-Gradienten-Gel, 2 K 2 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Vacutainer und 1-Serum Vacutainer pro Erwachsener Teilnehmers. Bei der Lieferung der Vacutainern an das Labor, haben ein Techniker unterzeichnen die Tracking-Blatt bedeutet die Akzeptanz der Proben. Bettelnsofort die Verarbeitung mit dem Startzeitpunkt auf einer Pro-Vacutainer-Basis auf dem Probenprotokoll dokumentiert.
  2. Serum Isolation Stufe 1 (1 min)
    1. Dokumentieren Sie die Startzeit auf der Probenprotokoll (siehe Tabelle SI 2). Zentrifuge (mit Bremse und Beschleunigung OFF) der 7,0 ml Serum (rot) Vacutainer (1 pro Teilnehmer) mit einem Schwingbecher-Rotor mit Aerosolkappen (Biosicherheitsstufe 2; BSL2-zertifiziert) für 20 min, 1.300 xg, 4 ° C.
  3. DNA Isolation Stufe 1 (15 min)
    Hinweis: Weitere Details zu diesem Isolationsverfahren siehe Herstellerprotokoll 13.
    1. Dokumentieren Sie die Startzeit. In einem BSL2 Zellkultur Kapuze, invertieren die Vacutainern, die das Ficoll-Gel 5 mal danach 200 ul Vollblut von der Spitze eines der Vacutainer in jeweils zwei 20 ul Aliquots Protease (400 ul Gesamt pro Teilnehmer). So dass die Protease + Blutmikrozentrifugenröhrchen in der Kapuze, fahren Sie mit dem centrifugation des Ficoll enthält Vacutainern in Schritt 3.4.1.
      Hinweis: Verwenden Sie den Vacutainer mit der größten Sammlung Volumen, unter Berücksichtigung der Notwendigkeit, den Ausgleich der Zentrifuge (dh, kann es notwendig sein, um 200 & mgr; l von jeder der beiden Vacutainern entfernen), wenn das Drehen der Vacutainer in Schritt 3.4.1. Zusätzlich, um eine ordnungsgemäße Trennung während der Verarbeitung der blauen Vacutainer zu gewährleisten, sollte der Pegel in dem Vacutainer restliche Blut nicht weniger als 2,5 Zoll über der Ficoll-Schicht sein.
  4. PBMC Isolierung Stufe 1 (1 min)
    1. Dokumentieren Sie die Startzeit (innerhalb von 2 Stunden der Blutabnahme sein, um eine Erhöhung der roten Blutkörperchen Kontamination und eine Abnahme der mononuklearen Zellrückgewinnung zu vermeiden) .Invert der Ficoll enthält Vacutainern 8-10 mal. Zentrifuge (mit Bremse und Beschleunigung OFF) die Vacutainer (2 pro Teilnehmer) mit einem Schwingbecher-Rotor mit Aerosolkappen (BSL2-zertifiziert) für 30 min, 1.600 xg, 22 ° C.
  5. DNA Isolation Stufe 2 (20 min)
    1. Zurück zur Seite der Motorhaube und fügen Sie 200 ul Puffer AL zu jedem der Protease + Blutmikrozentrifugenröhrchen (Schritt 3.3.1). Cap, von der Haube zu entfernen, Vortex 15 Sekunden und Flash-Spin.
    2. Inkubieren Sie 56 ºC in einem Wärmeblock, 10 min.
    3. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Flash-Spin. Zurück zu den BSL2 Kapuze. Fügen Sie 200 ul 100% Ethanol. Cap, von der Haube zu entfernen, Vortex 15 Sekunden und Flash-Spin. Die restlichen Schritte können außerhalb der Haube abgeschlossen sein.
    4. Gelten Lysat (innerhalb von 30 min aus Schritt 3.5.3) wird an eine markierte Spinsäule (in einem 2 ml-Sammelröhrchen). Schließen Sie den Deckel, um eine Kreuzkontamination durch Aerosole zu vermeiden. Centrifuge 6000 · g, 1 min.
    5. Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen.
    6. Fügen Sie 500 ul Buffer AW1 an die Säule ohne Befeuchtung der Felge, schließen Sie den Deckel, und Zentrifuge 6000 · g, 1 min.
    7. Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt filtrate und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen.
    8. Fügen Sie 500 ul Puffer AW2 auf die Säule ohne Befeuchtung der Felge, schließen Sie den Deckel, und Zentrifuge 20.000 xg, 3 min.
    9. Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube (nicht im Lieferumfang enthalten) und Zentrifuge 20.000 · g, 1 min.
    10. Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube (nicht im Lieferumfang enthalten).
    11. Fügen Sie 200 ul Buffer AE oder Wasser auf jede Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Centrifuge 6000 · g, 1 min.
    12. Wiederholen Sie Schritt 3.5.11 Elution in die gleiche Sammelröhrchen.
    13. Bündeln die eluierte DNA aus den 2 Spalten pro Teilnehmer. Gesamtausbeute ~ 800 & mgr; l pro Teilnehmer.
    14. Quantifizierung der Proben mit einem Spektralphotometer, wenn es die Zeit erlaubt.
    15. Wie in 2 ml-Kryoröhrchen gewünscht, dokumentiert die Konzentration von jedem auf der specime aliquoten DNAn log. Transfer Kryoröhrchen zu einem Kryobox Ort und bei -80 ° C für die langfristige Lagerung. Dokumentieren Sie die Gefrierstartzeit.
  6. Leukozyten RNA Isolation Stufe 1 (30 min)
    Hinweis: Führen Sie in einem biologischen Sicherheitsstufe 2 zertifizierte Zellkultur Kapuze. Weitere Einzelheiten zu dieser Isolierung siehe Herstellerangaben 15.
    1. Durchbohren die Gummimembran der K 2 EDTA Vacutainer mit einer Überführungsnadel. Bewahren Sie die Hülle und Schraubkappe zur Verwendung in Schritt 3.6.11. Nach BSL2 Standardpraktiken, kümmern sich um die Exposition gegenBloodBorne Pathogens zu vermeiden.
    2. Bringen Sie den weißen Slip-Anschluss an die Spitze der Führungsnadel.
    3. Beschriften Sie die Filter mit dem entsprechenden Teilnehmer-ID verbinden Sie dann den Einlass (aufgeweiteten Ende) des Filters zu dem weißen Slip-Anschluss.
    4. Bringen Sie einen ummantelten 25⅝ G-Nadel mit dem Ausgang (verjüngte Ende) des Filters. Vorbereiten der Filteraufbau vor der Auslieferung beschleunigt den Prozess erheblich und damit,Anbringen des weißen Slip Verbinders an der Führungsnadel, Addieren des Filters, dann der ummantelte Nadel und Einstellung der Anordnung in einem Kulturgefäßständer bis zur Verwendung empfohlen.
    5. Nach der Montage des K 2 EDTA-Röhrchen-System, sicher unsheathe die Nadel (verwenden Sie das Ende einer Metallspachtel). Stechen Sie die Nadel in eine leere 10 ml evakuierten Blutentnahmeröhrchen (Serum-Empfänger Tube) und invertieren die K 2 EDTA Vacutainer / filter / Receiver Röhrenanordnung. Nach BSL2 Standardpraktiken, kümmern sich um die Exposition gegenBloodBorne Pathogens zu vermeiden.
    6. Lassen Sie das Blut durch filtern, bis die keilförmigen Abschnitte des Filters haben Blut gelöscht. Filtration dauert ca. 2 min und in einem Reagenzglasgestell während der Filtration platziert werden.
    7. Entfernen Sie den Filter von der Baugruppe. Lassen Sie das Nadel im Gefäß mitsamt Filtrat und entsorgen Sie die gesamte Baugruppe in einem Scharfbehälter.
    8. Bringen Sie ein 5-ml-Spritze in die Überführungsnadel auf der Flasche 1x PBS, invert die Flasche, und ziehen Sie 3 ml.
    9. Befestigen Sie die Spritze mit PBS zu dem Einlass des Filters und spülen Sie den Filter (3-5 Tropfen pro Sekunde). Sammeln Sie die Durchströmung in einer biologischen Abfallbehälter. Nehmen Sie die Spritze aus dem Filter ohne Zurückziehen des Kolbens.
    10. Nach der Filtration und einer PBS waschen, zurückzutreten 3 ml der RNA-Stabilisierungsmittel mit einem neuen 5-ml-Spritze und die in Schritt 3.6.8 beschriebenen Verfahren. Spülen Sie den Filter wie in Schritt 3.6.9. Die RNA-Stabilisierung Mittel sollte auf dem Filter verbleiben. Nehmen Sie die Spritze aus dem Filter ohne Zurückziehen des Kolbens.
    11. Verschließen Sie die Filter Einlass und Auslass mit dem Mantel und Schraubverschluss aus der Überführungsnadel Verlassen des Filters mit RNA-Stabilisierungsmittel gesättigt beibehalten. Der Filter kann an diesem Punkt gelagert werden. Lagern Sie den Filter bei -80 ºC, bis die Zeit erlaubt (~ 2 Stunden) in Anspruch nehmen Sie die Schritte 5.3 bis 5.4.7.
      Hinweis: Filter bei -80 ºC für bis zu einem Jahr nach der Sammlung gespeichert haben ohne decrea verarbeitetense in der RNA-Qualität.
  7. PBMC Isolierung Stufe 2 (30 min)
    1. Entfernen Sie die Ficoll enthält Vacutainern aus der Zentrifuge (Schritt 3.4.1) und weiter in einem BSL2 Kapuze. Vacutainern sollten Trennung wie in Abbildung 2 angezeigt. Wenn nicht, siehe Tabelle 2.
    2. Sobald der Vacutainer ist mit der BSL2 Haube zurückgegeben, entfernen Sie den Stopfen und zurückzutreten 1,5 ml der oberen, gelblich, Plasmaschicht (Abbildung 2) unter Verwendung einer serologischen Pipette, ohne sich in der Nähe des einkernigen (clear / white) Schicht. Übertragen Sie das Plasma in einen 5 ml Kryoröhrchen - (Pool 2 Vacutainer - 1 Teilnehmer). Melden Sie sich das gesammelte Volumen. Siehe Schritt 3.7.6 für die Lagerung.
      Hinweis: Die beste Trennung und größten PBMC Erträge stammen aus Teilnehmern, die mindestens 12 Stunden vor der Blutentnahme gefastet haben.
    3. Übertragen Sie die restlichen Plasma und die weißliche, mononukleare Schicht (alles, was über der Gelschicht - Abbildung 2) usingen ein serologischer Pipette in ein 15 ml konischen Röhrchen, die Bündelung der einkernigen Schicht von jeder der beiden Ficoll enthält Vacutainern pro Teilnehmer zu einem konischen Rohr.
    4. Hinzufügen 1x PBS, um das Gesamtvolumen in dem konischen Rohr auf 15 ml zu bringen. Cap Rohr und Invert-5-mal. Zentrifuge (mit Bremse und der Beschleunigung OFF) 15 min, 300 × g, 22 ° C.
    5. Zurück zur Ficoll enthält Vacutainern in der Haube und sammeln Sie die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) durch die Verwendung eines 5 ¾ "Pasteur-Pipette, um wirbeln und lösen Sie die Außenseite des Ficoll Gelschicht und entfernen Sie sie, wenn möglich. Verwenden Sie eine serologische Pipette zu sammeln und zu überweisen Sie den roten Blutkörperchen (~ 4,5 ml) zu einer 5 ml Kryoröhrchen. Melden Sie sich das gesammelte Volumen.
    6. Übertragen Sie die 5 ml Kryoröhrchen (Plasma in Schritt 3.7.2 und RBCs in Schritt 3.7.5) zu einer gesteuerten Rate Gefrierbehälter und bei -80 ºC für mindestens 24 Stunden, wonach sie zu einer Kryobox übertragen werden und kehrte zu setzen -80 ºC für die langfristige Lagerung.
    7. Bringen Sie den Conische Rohr an der Haube, wenn die Zentrifugation in Schritt 3.7.4 abgeschlossen ist, und saugen alles, aber ~ 500 ul des PBS, ohne das Pellet zu stören. PBMC Ausbeute ist größer, wenn ~ 200 ul PBS ist über dem Pellet zu diesem Zeitpunkt verlassen.
    8. In frischem 1x PBS, um das Volumen auf 10 ml zu bringen. Das Pellet vorsichtig. Cap Rohr und Invert-5-mal. Zentrifuge (mit Bremse und der Beschleunigung OFF) 10 min, 300 × g, 22 ° C.
  8. Serum Isolation Stufe 2 (10 min)
    Hinweis: Führen Sie in einem BSL2 Kapuze.
    1. Aliquot der oberen Serumschicht aus dem Serum Vacutainer, nach der Zentrifugation (Schritt 3.2.1), in 2 ml-Kryoröhrchen nach Wunsch. Typische Ausbeute beträgt 2,5 ml (Tabelle 1). Melden Sie die Lautstärke. Verwenden Sie beispielsweise 4 Kryoröhrchen Aliquotierung 200 ul in Kryoröhrchen 1, 1000 ul in Kryoröhrchen 2 und teilen den übrigen in Kryoröhrchen 3 und 4.
    2. Übertragen Sie die Tieftemperaturampullen zu einem Kryobox Ort und bei -80 ºC für die langfristige Lagerung. Dokumentieren Sie die GefrierstartZeit.
  9. PBMC Isolierung Stufe 3 (15 min)
    1. Zurück zu der Haube, nach der Zentrifugation (Schritt 3.7.8), und saugen so viel Überstand / PBS wie möglich, ohne das Pellet aufzurühren. Pellet mit einer Pipette in 2,5 ml PBMC Freezing Medium 1 (siehe SI 2).
    2. Hinzufügen von 2,5 ml PBMC Einfriermedium 2 (siehe SI 2) an der Zelle / Mittellösung in Schritt 3.9.1. Vortex vorsichtig.
    3. Aliquot 10 ul der Zell-Lösung in eine 0,65 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (weitere Verdünnung kann notwendig sein). In 10 ul 0,4% Trypanblau-Färbung in den 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen durch Pipettieren mehrmals. Für weitere Details siehe Handbuch des Herstellers 16.
    4. Pipettieren Sie 10 ul der Mischung in eine Zelle Zählkammer Rutsche und Platz Rutsche in den Zellzähler innerhalb von 3 Minuten der Vermischung. Zoom und Fokus in die Zellen. Drücken Sie die "Count Cells" zu erhalten PBMC zählen.
    5. Aliquot, wenn die lebensfähigenPBMC Zahl über 3 Millionen Zellen pro Milliliter (mc / ml), wie in Kryoröhrchen gewünschten und weiter zu dem Schritt 3.9.9. Speicher PBMCs in bis zu 5 Kryoröhrchen in einer Konzentration von mindestens 3 mc / ml.
    6. Wenn der lebensfähigen PBMC Zahl unter 3 mc / ml, die Berechnung der Gesamtzahl der Zellen durch Multiplizieren der lebensfähigen mc / ml bis 5 ml. Teilen diese Zahl durch 4, 3, 2 oder 1 ml, so dass es zumindest ein Rohr mit 3 mc / ml betragen.
    7. Zentrifuge das konische Röhrchen, die Zellen / Einfriermedium Lösung für 5 min bei 300 g (Brems- und Beschleunigungs OFF). Nach Zentrifugation absaugen geeigneten Volumen Gefriermedium (Überstand) Verlassen der oben unter (4, 3, 2 oder 1 ml) berechnete Volumen.
    8. Das Pellet in dem verbleibenden Überstand und Aliquots mindestens 3 mc / ml in die entsprechende Anzahl von Kryoröhrchen (1-4) bei 1 ml / Kryovial. Abschluss Einfriermedium 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) / 20% fötales Rinderserum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. DocumENT Der Zellzahl pro Kryoröhrchen. Übertragen die Kryoröhrchen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierbehälter und bei -80 ºC für mindestens 24 Stunden, wonach die Kryoröhrchen kann einer Kryobox führt und in einem Flüssigstickstofftank (Dampfphase) zur Langzeitlagerung gebracht werden gesetzt. Document Gefrierstartzeit.

4. Tag 2 Setup

  1. Wärme ein Aliquot (220 ul pro Filter) nucleasefreiem 0,1 mM EDTA in einer Nuklease-freies Röhrchen auf 80 ° C in einem Heizblock.
  2. Bereiten Waschlösungen 1 und 2 (siehe SI 2).

5. Tag 2: Langzeit-Probenlagerung und Leukozytenfilter Processing (3 Stunden)

  1. Überblick.
    1. Führen Sie dieses Verfahren innerhalb von 6 Monaten nach der Antragstellung der Leukozyten an den Filter.
      Hinweis: Insgesamt dauert Tag 2 Verarbeitungs etwa 3 h und während es ist mit "Tag 2", die wichtigste Voraussetzung ist, dass die Filterverarbeitungsabschnitt sollte an einem Tag durchgeführt werden, wennes gibt keinen Tag 1 Verarbeitung im Labor stattfindet.
  2. Langzeitprobenlagerung (15 min)
    1. Führen Sie dieses Verfahren jeden Tag, vor der Lieferung neuer Vacutainern zum Labor für Tag 1 Verarbeitung. Übertragen Sie die Kryoröhrchen, die O / N in kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierbehälter an Tag 1 gespeichert wurden in entsprechend gekennzeichneten Cryoboxen und wieder auf -80 ºC oder flüssiger Stickstoff (Dampfphase) für langfristige Lagerung. Organisieren Sie die Kryoröhrchen auf Basis von Probentyp (zB DNA, PBMC, RBCs, etc.), um Probenort zu beschleunigen Verfolgung für Endpunkt-Assays.
  3. Leukozyten RNA-Filter-Verarbeitung (45 min).
    Hinweis: Weitere Informationen zu diesem Verfahren finden Sie die Anweisungen des Herstellers 17.
    1. Bringen Sie den Filter auf RT (Auftauen ca. 5 min).
    2. Entfernen Sie den Mantel und Schraubkappe aus dem Filter. Fahren Sie den Kolben einer 5 ml Spritze und verbinden Sie es mit dem Einlass (aufgeweiteten Ende) des Filters, drücken Sie den Kolben, um die RNA-Stabilisierung Mittel zu vertreiben von den Filteröffnungen in einer biologischen Abfallbehälter.
    3. Laden eines neuen 5-ml-Spritze mit 4 ml einer Phenol und Guanidinisothiocyanat-Lösung für die RNA-Isolierung und sie an dem Einlass des Filters ist, drücken den Kolben, um die Lösung durch den Filter zu spülen, das Sammeln des Lysates in ein beschriftetes 15 ml konischen Röhrchen (2 pro Teilnehmer).
    4. Trennen Sie die Spritze aus dem Filter, den Kolben zurückzuziehen, wieder verbinden Sie es mit dem Filter, und drücken Sie den Kolben, um Restproben in der Filterscheibe eingefangen in die gleichen 15 ml konischen Röhrchen zu vertreiben. Entsorgen Sie Filter und Spritze.
    5. Fügen Sie 800 ul BCP zu dem konischen Rohr, schließen Sie das Rohr dicht und kräftig schütteln prep für 30 Sekunden.
    6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge für 10 min bei 2.000 x g.
    7. Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase zu einer frisch markierte 15 ml konischen Röhrchen (~ 2,5 ml).
    8. Mit 0,5-fache des Volumens der wäßrigen Phase des Nuclease-freiem Wasser eind gut mischen. Dann fügen Sie 1.25x der wässrigen Volumen von 100% Ethanol und nochmals mischen.
      Hinweis: Für eine 2,5 ml wässrige Volumen, fügen 1,25 ml Nuclease freies Wasser, mischen, dann fügen Sie 4,7 ml 100% Ethanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml Nuclease freies Wasser DANN 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml neuen wässrigen Volumen THEN 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% Ethanol). Dieser Schritt ermöglicht die Isolierung von Gesamt-RNA, die die kleinen RNA-Fraktion umfasst. Ein Verfahren, um die kleinen RNAs aus der Isolation weglassen finden Sie im Handbuch 17 gefunden werden.
    9. Entfernen Sie den Kolben aus einer 5-ml-Spritze und legen Sie eine Spin Patrone an seinem Platz. Bringen Sie die Kartusche / Spritzenanordnung zu einer Vakuumkammer. Für eine sichere Verbindung mit dem Vakuumverteiler, legen Sie die Kassette / Spritzenanordnung innerhalb einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Boden abgeschnitten.
    10. Gelten die Probe aus Schritt 5.3.8 zur Spin Patrone langsam mit dem Vakuum, vorsichtige Zugabe weitere Probe, während sie durch die Kartusche gezogen.
      Hinweis: Wenn kein UnterdruckDerzeit sehen Zentrifugationsverfahren bei http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
    11. Übertragen Sie die Spin-Kartusche in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 750 ul Wasch 1. Zentrifugenschleuderpatrone / Rohrbaugruppe 5-10 sec bei 12.000 x g.
    12. Entsorgen Filtrat aus der Tube und gibt den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß.
    13. Fügen Sie 750 ul Wasch 2 und Zentrifugenschleuderpatrone / Rohr für 5-10 sec bei 12.000 x g. Entsorgen Filtrat wie in Schritt 5.3.12. Bringen Sie den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß.
    14. Wiederholen Sie mit einem anderen 750 & mgr; l Wasch 2 und Zentrifugation wie in Schritt 5.3.13. Verwerfen Filtrat. Bringen Sie den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß. Zentrifugieren Sie die Spin-Kartusche / Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute, um den Filter trocknen.
    15. Übertragen Sie die Spin-Kartusche in ein frisches, beschriftet 1,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen.
    16. Fügen Sie 200 ul Nuklease-freies 0,1 mM EDTA (bis 80 & # vorgewärmt176; C) in die Mitte des Spinnfilterpatrone (2 pro Teilnehmer). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
    17. Zentrifugieren für 1 min bei 12.000 × g, um die RNA zu eluieren. Bewahren Sie die Filtrat. Entsorgen Spin Patrone.
    18. Split jeder 200 ul Filtrat in zwei 100 ul Aliquots an die frische 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Etikett und auf Eis halten. An dieser Stelle wird ausgehend von 2 Filter pro Teilnehmer vier 100 ul Aliquots von RNA pro Teilnehmer ergeben.
  4. DNase-Behandlung (1 h)
    Hinweis: Für weitere Informationen zu dieser Behandlung siehe Protokoll des Herstellers 18.
    1. Erstellen Sie einen Master-Mix durch die Kombination von 10 ul DNase I-Puffer und 2 ul rDNase I pro Aliquot + 1 (zur Berücksichtigung von Pipettieren Fehler).
      Hinweis: Bei vier Proben, 100 ul Aliquots verwenden 50 ul DNase I Puffer + 10 ul rDNase I.
    2. Aliquot 12 ul des Master-Mix in Schritt 5.4.1 in jedes der RNA-Aliquots von Schritt 5.3.18 und vorsichtig mischen. Bei 37° C für 30 Minuten in einen Heizblock.
    3. Mischen Sie den DNase-Inaktivierung Reagenz und fügen 11,2 & mgr; l zu jedem Aliquot, gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 min verwirbelt 2-3mal während der Inkubation.
    4. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1,5 min.
    5. Den Überstand (RNA) in ein frisches 1,5 ml-Tube. Aliquots aus dem gleichen Teilnehmer kann hier gebündelt.
    6. Führen Sie jede Probe auf einem Spektrophotometer, um die Konzentration zu erhalten. Ein Qualitäts-Analyse der RNA wird unter Verwendung eines Bioanalyzer (siehe Schritt 5.5) empfohlen.
    7. Aliquot der RNA in Kryoröhrchen nach Wunsch. Wenn ein Bioanalyzer Analyse nicht sofort aliquote 1,5 ul der Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen für eine spätere Analyse durchgeführt werden. Dokumentieren Sie die Konzentrationen und die Gefrierstartzeit. Proben bei -80 ° C.
  5. Bioanalyzer Analyse (1 Stunde)
    1. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers 19. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, werden die Daten automatisch gespeichert, sondern speichern Sie es erneut wit einem kleineren, erkennbare Dateinamen. Erwartete Ergebnisse (Abbildung 3): Der Leiter sollte 6 Peaks, Proben 3 Peaks (2 ribosomalen Peaks bei 44 sec und 50 sec bzw. 1 und früher Marker Peak bei 25 sec) zu haben.

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Ergebnisse

Es ist wichtig, dass das gesamte Verfahren zu produzieren hochwertiges Material für die Analyse in einer Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Genexpression über Microarray und RT-PCR-Analyse, Erkennung von epigenetischen Modifikationen und Zell-Untergruppe Variationen. Tabelle 1 zeigt die durchschnittliche Ausbeute und Qualität der Materialien, von jedem der Prozesse dar. 3 stellt ein Beispiel für die Ausgabequalität der Leukozyten RNA Isolation und Filterverarbeitung...

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Diskussion

Wir haben eine schlanke Protokoll, das bereits erfolgreich angewendet wurde, um mehr als 1.600 Vollblut-Proben in der Detroit Neighborhood Health Study bearbeiten beschrieben. Obwohl viele dieser Verfahren sind in der vorhandenen Literatur zur Verfügung, unsere Schritt-für-Schritt-Zusammenstellung, einschließlich der genauen zeitlichen Änderungen zwischen jedem Schritt, spiegelt eine optimierte effizientes Protokoll erfolgreich produziert eine Vielzahl von biologischen Proben mit einer Vielzahl von Downstream-Anwendunge...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken Henriette Mair-Meijers für die unschätzbare Liebe zum Detail und die Stunden, die sie in die Bearbeitung der Blutentnahmen investiert haben. Wir sind dankbar für die Grafikdesign-Expertise von Natalie Jameson Kiesling. Wir danken auch für die Zustimmung der hier genannten Hersteller (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)), die Verwendung ihrer Produkte wie beschrieben zu veröffentlichen. Diese Arbeit wurde großzügig von den National Institutes of Health mit den Preisnummern DA022720, RC1MH088283 und DA022720-05-S1 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Tag 1: DNA-Isolierung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaP5493-1LTag 1: PBMC-Isolierung
5 ¾ ” PasteurpipettenFisher13-678-6ATag 1: PBMC-Isolierung
Fötales Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviertLife Technologies10082147Tag 1: PBMC-Isolierung
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD8418-500mlTag 1: PBMC-Isolierung
RPMI Medium 1640, flüssigesInvitrogen11875119Tag 1: PBMC-Isolierung
0,4 % Trypanblau-FleckInvitrogenT10282Tag 1: PBMC-Isolierung
Countess Cell Counting ChamberInvitrogenC10283Tag 1: PBMC-Isolierung
Countess Automated Cell Counter oder Zellzählgerät wie ein Mikroskop und ein HämozytometerInvitrogenC10281Tag 1: PBMC-Isolierung
LeukoLOCK Fraktionierung & Stabilisierungs-Kit Ambion1933Tag 1: Leukozyten-RNA-Isolierung
25  G x 5/8 Zoll NadelnBecton Dickinson305122Tag 1: Leukozyten-RNA-Isolierung
Spritzen (5  ml)Becton Dickinson309646Tage 1 und 2: Denaturierende Lyselösung zur Isolierung von Leukozyten-RNA
 Ambion8540GTag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA
5  M NaClLife Technologies24740011Tag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA
TRI-ReagenzAmbion9738Tag 2: Isolierung von Leukozyten-RNA
von Brom-3-chlorpropan (BCP)SigmaB-9673Isolierung von Leukozyten-RNA
Ambion10051GTag 2: Leukozyten-RNA-Isolierung
0,1  mM EDTAAmbion9912Tag 2: Leukozyten-RNA-Isolierung
DNA-freies KitAmbionAM1960Tag 2: DNase-Behandlung
RNA 6000 Leiter Agilent5067-1529Tag 2: Bioanalysator-Analyse
RNA 6000 Nano Series II Kit Agilent5067-1511Tag 2: Bioanalysator-Analyse
RNaseZAPAmbionAM8782Tag 2: Bioanalysator-Analyse
Ethanol >99%SigmaE7023-500ml
Isopropanol >99% SigmaI9516-500ml
Nukleasefreies Reinstwasser Invitrogen9938
Pipettenspitzen (nukleasefrei)Eppendorf22491253
Pipette (serologisch)Eppendorf2223020-4
Pipettierer (für Volumina unter 1  ml)Eppendorf3120000-054
Pipetten (serologisch)Fisher13-678-27E
Gefrierbehälter mit kontrollierter RateNalgene5100-0001
Kryoboxen (für 2  ml und 5  ml Kryoröhrchen und 1,5  ml Mikrozentrifugenröhrchen)Fisher03-395-464
ReagenzglasgestellThermo Scientific14-804-134
15  ml Polypropylen-RöhrchenFisher14-959-49D
1,5  ml und 0,65 MikrozentrifugenröhrchenFisher07-200-534 und 07-200-185
2  ml und 5  ml KryofläschchenFisher10-500-26 und 10-269-88F 
8  ml CPT VacutainerBD Biosciences3627612 Röhrchen
6  ml K2 EDTA VacutainerBD Biosciences3678632 Röhrchen
8,5  ml SST VacutainerBD Biosciences3679881 Röhrchen
VortexerFisher2215365
Trockenbad-Inkubator mit Heizblock für MikrozentrifugenröhrchenFisher11-715-1250
Filtrations-/Vakuumsystem für den Einsatz in der ZellkulturhaubeFisher01-257-87
Festwinkelrotor für Mikrozentrifugenröhrchen mit aerosoldichtem DeckelEppendorf22637002
Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor und aerosoldichten Verschlüssen für 16 x 125  mm Vacutainer und 15  ml Polypropylen-RöhrchenEppendorf226281572, man muss nicht gekühlt werden
Nanodrop 2000 (empfohlen für die Genauigkeit kleiner Volumina) oder ein anderes spektrophotometrisches GerätFisher13-400-411
Agilent BioanalysatorAgilent TechnologiesG2940CA
FlüssigstickstofftankThermo Scientific11-676-56
Behälter für scharfe GegenständeFisher22-037-970
Behälter für biologische AbfälleThermo Scientific1223P52
Biosicherheitsstufe 2  zertifizierte ZellkulturhaubeThermo Scientific13-261-315
Tag 2: Spin-Kartuschen zur

Referenzen

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