Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.
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Methodenartikel
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RNA / Protein-Interaktionen sind entscheidend für die Post-Transkriptionsregulationswege. Unter den am besten charakterisierten zytosolische RNA-bindende Proteine sind Eisen regulatorischen Proteinen, IRP1 und irp2. Sie binden an responsive Elemente (IRES) innerhalb der untranslatierten Regionen (UTR) von mehreren Ziel-mRNAs bügeln, damit die mRNA Translation oder Stabilität Steuerung. IRE / IRP Wechselwirkungen wurden weitgehend von der EMSA untersucht. Hier beschreiben wir die EMSA-Protokoll für die Analyse der IRE-Bindungsaktivität von IRP1 und irp2, die generali können, um die Aktivität von anderen RNA-bindenden Proteinen und zu beurteilen. A Rohprotein Lysat eine RNA-Bindungsprotein, oder ein gereinigtes Präparat des Proteins enthält, wird mit einem Überschuss von 32 P-markierten RNA-Sonde inkubiert, wobei zur Komplexbildung. Heparin zugesetzt wird, um nicht-spezifische Protein ausschließen zu Sondenbindung. Anschließend wird die Mischung durch nicht-denaturierende Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die freien Sondewandert schnell, während die RNA / Proteinkomplex Exponate verzögert Mobilität; daher wird das Verfahren auch als "Gelretardation" oder "Bandshift" -Assay. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel getrocknet und RNA / Protein-Komplexe, sowie freier Sonde durch Autoradiographie detektiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, nachzuweisen und zu quantifizieren IRE / IRP und andere RNA / Protein-Interaktionen. Außerdem kann EMSA verwendet, um die Spezifität, Affinität und Stöchiometrie des RNA / Protein-Wechselwirkung untersucht bestimmen.
Einleitung
Die EMSA wurde ursprünglich entwickelt, um die Assoziation von DNA-bindenden Proteinen mit DNA-Zielsequenzen 1,2 studieren. Das Prinzip ist ähnlich für RNA / Protein-Interaktionen 3, die im Mittelpunkt dieses Artikels ist. Kurz gesagt wird RNA negativ geladen und werden in Richtung der Anode während der nicht-denaturierenden Elektrophorese in Polyacrylamid (oder Agarose) Gelen wandern. Migration innerhalb des Gels hängt von der Größe der RNA, die proportional zu ihrer Ladung ist. Spezifische Bindung eines Proteins an RNA verändert seine Mobilität und der Komplex wandert langsamer als das freie RNA. Dies ist vor allem auf eine Erhöhung der Moleku....
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Protokoll
Experimentelle Verfahren mit Mäusen wurden von der Animal Care Committee der McGill University (Protokoll 4966) zugelassen.
1. Herstellung von Proteinextrakten aus kultivierten Zellen
- Waschen kultivierten Zellen zweimal mit 10 ml eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Kratzen Sie anhaftenden Zellen entweder mit einem Gummiwischer oder einem Kunststoffzellschaber in 1 ml eiskaltem PBS, Transfer Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- In einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 700 × g bei 4 ° C. Absaugen PBS.
- 100 l eiskaltem Zytoplasma-Lysepuffer (Tabelle 1) pro 1....
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Ergebnisse
Ein radioaktiv markiertes IRE Sonde hergestellt wurde, wie in den Abschnitten 3 und 4 des Protokolls beschrieben. Die Sequenz der Sonde war 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; die fettgedruckten Nukleotide stellen einen ungepaarten C-Rest und die Schleife, die kritische IRE Merkmale sind. Die spezifische Radioaktivität der Probe betrug 4,5 x 10 & sup9; cpm / ug RNA.
Um die Auswirkungen von Störungen auf .......
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Diskussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die IRE-Bindungsaktivitäten von IRP1 und irp2 studieren, und wir zeigen repräsentative Daten. Durch die Verwendung von verschiedenen Sonden, kann dieses Protokoll auch für die Untersuchung von anderen RNA-bindenden Proteinen eingestellt werden. Ein kritischer Schritt ist die Größe der Sonde. Verwendung von langen Sonden, die gemeinsam ist, wenn die genaue Bindungsstelle nicht bekannt ist, kann in der RNA / Protein-Komplexe, die nicht anders migrieren als die f.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Leupeptin | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA-Polymerase | Thermowissenschaftliches | EPO111, | |
| RNase-Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | ||
| Szintillationsflüssigkeit | Beckman Coulter | 141349 | |
| Heparin | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Name des Geräts | |||
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| Szintillationszähler | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 Wells Kämme | BIORAD | 165-1868 | 1,5 mm dicke |
| 1,5 mm Abstandshalter | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referenzen
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
