Methodenartikel

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

DOI:

10.3791/52230

⸱

3. Dezember 2014

 ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA / Protein-Interaktionen sind entscheidend für die Post-Transkriptionsregulationswege. Unter den am besten charakterisierten zytosolische RNA-bindende Proteine ​​sind Eisen regulatorischen Proteinen, IRP1 und irp2. Sie binden an responsive Elemente (IRES) innerhalb der untranslatierten Regionen (UTR) von mehreren Ziel-mRNAs bügeln, damit die mRNA Translation oder Stabilität Steuerung. IRE / IRP Wechselwirkungen wurden weitgehend von der EMSA untersucht. Hier beschreiben wir die EMSA-Protokoll für die Analyse der IRE-Bindungsaktivität von IRP1 und irp2, die generali können, um die Aktivität von anderen RNA-bindenden Proteinen und zu beurteilen. A Rohprotein Lysat eine RNA-Bindungsprotein, oder ein gereinigtes Präparat des Proteins enthält, wird mit einem Überschuss von 32 P-markierten RNA-Sonde inkubiert, wobei zur Komplexbildung. Heparin zugesetzt wird, um nicht-spezifische Protein ausschließen zu Sondenbindung. Anschließend wird die Mischung durch nicht-denaturierende Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die freien Sondewandert schnell, während die RNA / Proteinkomplex Exponate verzögert Mobilität; daher wird das Verfahren auch als "Gelretardation" oder "Bandshift" -Assay. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel getrocknet und RNA / Protein-Komplexe, sowie freier Sonde durch Autoradiographie detektiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, nachzuweisen und zu quantifizieren IRE / IRP und andere RNA / Protein-Interaktionen. Außerdem kann EMSA verwendet, um die Spezifität, Affinität und Stöchiometrie des RNA / Protein-Wechselwirkung untersucht bestimmen.

Einleitung

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Die EMSA wurde ursprünglich entwickelt, um die Assoziation von DNA-bindenden Proteinen mit DNA-Zielsequenzen 1,2 studieren. Das Prinzip ist ähnlich für RNA / Protein-Interaktionen 3, die im Mittelpunkt dieses Artikels ist. Kurz gesagt wird RNA negativ geladen und werden in Richtung der Anode während der nicht-denaturierenden Elektrophorese in Polyacrylamid (oder Agarose) Gelen wandern. Migration innerhalb des Gels hängt von der Größe der RNA, die proportional zu ihrer Ladung ist. Spezifische Bindung eines Proteins an RNA verändert seine Mobilität und der Komplex wandert langsamer als das freie RNA. Dies ist vor allem auf eine Erhöhung der Molekularmasse, sondern auch Änderungen in der Ladung und ggf. Konformation. Mit Hilfe eines markierten RNA als Sonde ermöglicht eine einfache Überwachung des "Gelretardation" oder "Bandshift". Verwendung von 32 P-markierten RNA-Sonden ist sehr verbreitet und bietet hohe Empfindlichkeit. Die Migration von RNA / Protein-Komplexen und freien RNA nachgewiesen werdendurch Autoradiographie. Nachteile sind die kurze Halbwertszeit von 32 P (14,29 Tage), die allmähliche Verschlechterung der Qualität der Sonde durch Radiolyse, das Erfordernis einer Radioaktivität Lizenz und die Infrastruktur für die Radioaktivität der Arbeit, und potentielle biologische Sicherheit betrifft. Daher alternative nichtisotopische Methoden zur Markierung der RNA-Sonde entwickelt, zum Beispiel mit Fluorophoren oder Biotin, der Nachweis durch Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Abbildungs ​​4,5 ermöglichen. Beschränkungen dieser Verfahren sind die höheren Kosten und oft eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Isotopenmarkierung, und das Potential des nicht-isotopische Markierungen, mit der RNA / Protein-Wechselwirkung stören. Nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen sind für die meisten Anwendungen EMSA und werden häufig verwendet. Gelegentlich kann Agarosegelen eine Alternative für die Analyse von großen Komplexen darstellen.

Der große Vorteil der EMSA ist, dass es kombiniert Einfachheit, Sensitivität und Robustheit 4 </ Sup>. Der Test kann innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden kann und keine ausgeklügelte Instrumentierung erforderlich. RNA / Protein-Interaktionen können von der EMSA bei Konzentrationen von nur 0,1 nM oder weniger erkannt werden, und in einem weiten Bereich von Bindungsbedingungen (pH 4,0 bis 9,5, monovalente Salzkonzentration von 1 bis 300 mM, und die Temperatur 0 - 60 ° C).

RNA / Protein-Komplexbildung kann ebenfalls durch den Filter-Bindungsassay untersucht werden. Dies ist ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren auf der Basis der Beibehaltung der RNA / Protein-Komplexen in einem Nitrocellulose-Filter, während eine freie RNA Sonde durch 6 durchläuft. Im Vergleich zu EMSA, ist es in Fällen, wo die RNA-Sonde enthält mehrere Bindungsstellen oder der Rohextrakt enthält mehrere RNA-Bindeproteine, die an die Sonde binden, an der gleichen Stelle begrenzt ist. Während mehrere RNA / Protein-Interaktionen werden Erkennung durch den Filter-Bindungstest entgehen, können sie leicht durch EMSA visualisiert werden. In einigen Fällen ist die Visualisierung Vorabendn möglich, wenn zwei RNA / Protein-Komplexe co-migrieren (zum Beispiel menschliche IRP1 / IRE und irp2 / IRE-Komplexe), durch Zugabe eines Antikörpers gegen eines der RNA-Bindeproteine ​​zu der EMSA Reaktion, wodurch man weitere Retardierung auf dem Gel ( "Supershift") 7.

Die EMSA wurde weithin verwendet, um IRP1 und irp2, die nach der Transkriptionsregulatoren des Eisenstoffwechsels 8-10 sind zu studieren. Sie funktionieren über die Bindung an IREs phylogenetisch konservierten Haarnadelstrukturen innerhalb der UTRs mehrerer mRNAs 11. IREs wurden zuerst in den mRNAs Ferritin 12 und Transferrin-Rezeptor 1 (TfR1) 13, Proteinen von Eisen Lagerung und Aufnahme beziehungsweise kodiert entdeckt. Später IREs wurden in erythroiden spezifische Aminolaevulinat Synthase (ALAS2) 14, mitochondrialen Aconitase 15. Ferroportin 16, zweiwertige Metall Transporter 1 (DMT1) 17, Hypoxie-induzierbaren Faktors 2 gefunden α (HIF2α) 18 und anderen mRNAs 19-21. Der Prototyp H- und L-Ferritin-mRNAs enthalten ein IRE in ihren 5'-UTR, während TfR1 mRNA enthält mehrere IREs in ihrem 3'-UTR. IRE / IRP Wechselwirkungen spezifisch hemmen Ferritin-mRNA-Translation durch sterisch Sperrung der Assoziation der 43S ribosomalen Untereinheit; Darüber hinaus stabilisieren sie TfR1 mRNA gegen endonukleolytische Spaltung. IRP1 und irp2 Aktien umfassende Sequenzähnlichkeit und weisen eine hohe IRE-Bindungsaktivität in eisenversorgten Zellen. In eisenversorgten Zellen versammelt IRP1 eine Cuban Fe-S-Cluster, der es um cytosolische Aconitase wandelt auf Kosten der IRE-Bindungsaktivität, während irp2 erfährt proteasomalen Abbau. Somit hängen die IRE / IRP Wechselwirkung bei der zellulären Eisenstatus, sondern auch durch andere Signale, wie zum Beispiel H 2 O 2, Stickstoffmonoxid (NO) oder Hypoxie. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Beurteilung der IRE-Bindungsaktivität von Rohöl Zell- und Gewebeextrakten von EMSA. Wir verwendeten eine 32 P-markiertem H-Ferritin-IRE-Sonde, die durch in vitro-Transkription von Plasmid-DNA-Matrize (I-12.CAT), wobei der IRE-Sequenz wurde ursprünglich in Sense-Orientierung stromabwärts des T7-RNA-Polymerase-Stelle durch eingeführten generated Klonen von geglüht synthetische Oligonukleotide 22.

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Protokoll

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Experimentelle Verfahren mit Mäusen wurden von der Animal Care Committee der McGill University (Protokoll 4966) zugelassen.

1. Herstellung von Proteinextrakten aus kultivierten Zellen

  1. Waschen kultivierten Zellen zweimal mit 10 ml eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  2. Kratzen Sie anhaftenden Zellen entweder mit einem Gummiwischer oder einem Kunststoffzellschaber in 1 ml eiskaltem PBS, Transfer Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. In einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 700 × g bei 4 ° C. Absaugen PBS.
  4. 100 l eiskaltem Zytoplasma-Lysepuffer (Tabelle 1) pro 10 7 Zellen und Pipette auf und ab.
  5. Inkubieren auf Eis für 20 min.
  6. Spin für 10 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C.
  7. Verwerfen Pellet. Überstand in neue 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten.
  8. DetHermelins Proteinkonzentration (gewöhnlich 1 - 10 & mgr; g / & mgr; l) unter Verwendung des Bradford-Assay 23.
  9. Aliquot und Speichern von Zellextrakten bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Herstellung von Proteinextrakten aus Maus Leber und Milz

  1. Euthanize eine Maus mit CO 2 Inhalation.
  2. Legen Sie das Tier eingeschläfert auf eine saubere Unterlage über einen Seziersaal Bord. Öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere.
  3. Präparieren Sie die Leber und die Milz mit einer Schere und Pinzette, und spülen Sie jedes Gewebe in ca. 50 ml eiskaltem PBS.
  4. Unmittelbar geschnitten Gewebe in kleine Stücke mit einem Skalpell (zB etwa 1-2 mm 3).
  5. Unverzüglich, legte Stücke von Gewebe in einem frischen Kryoröhrchen und Schnapp frieren sie in flüssigem Stickstoff dann. Shop schockgefroren Gewebe Aliquots bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  6. Homogenisieren einem Stück gefrorenes Gewebe (ungefähr 1 bis 2 mm 3) in 0,25 bis 0,5 mleiskaltem zytoplasmatischen Lysepuffer (Tabelle 1) mit einem Gewebe-Homogenisator 10 sec.
  7. Übertragen Homogenat 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Chill auf Eis für 20 min.
  8. Spin für 10 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C.
  9. Entsorgen Pellet und Überstand in neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie auf dem Eis.
  10. Bestimmen Proteinkonzentration (gewöhnlich 1 - 10 & mgr; g / & mgr; l) unter Verwendung des Bradford-Assay 23.
  11. Aliquot und Speichern von Zellextrakten bei -80 ° C bis zur Verwendung.

3. Herstellung von radioaktiv markierten IRE-Sonde

  1. Linearisieren des IRE-haltigen Plasmid I-12.CAT 22 durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde mit der Restriktionsendonuklease XbaI (1 U pro ug Plasmid), spalt hinter der IRE-Sequenz. Das linearisierte Plasmid wird als Matrize für die in vitro-Transkription verwendet werden.
  2. Richten Sie einn in vitro-Transkriptions-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Verwenden Sie die in Tabelle 2 angegebenen Stammlösungen und hinzuzufügen: 1 ul linearisierte Plasmid-Vorlage, 4 ul Transkriptionspuffer; 1 & mgr; l Mischung aus ATP / CTP / GTP-Mix, 10 & mgr; l [α- 32 P] -UTP, 2 & mgr; l Dithiothreitol, 1 ul RNase-Inhibitor und 1 ul T7 RNA-Polymerase. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
  3. Inkubiere bei 40 ° C für 1 h 24.

4. Reinigung von radioaktiv markierten IRE-Sonde

  1. Enden in vitro-Transkriptions-Reaktion durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA, pH 8 Mix durch Auf- und Abpipettieren.
  2. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml tRNA, die als Träger für eine bessere Niederschlag. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
  3. Hinzufügen 82,5 ul 3 M Ammoniumacetat. Durch Vortexen mischen.
  4. Hinzufügen 273 ul Ethanol. Durch Vortexen mischen.
  5. Stehen lassen bei Raumtemperatur für 5 min.
  6. Spin für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei RT. Überstand verwerfen.
  7. Waschen Sie das Pellet mit 100 ul 70% Ethanol.
  8. Spin für 10 Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei RT. Überstand verwerfen.
  9. Luft trocknen Pellet für 10 min.
  10. Pellet in 100 & mgr; l doppelt destilliertes, zuvor autoklaviert H 2 O.
  11. Quantifizierung der Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler, aliquoten radioaktiv markierten IRE Sonde und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Gefrorene Aliquots für 3 Wochen verwendet werden.

5. Herstellung von einem nativen Polyacrylamidgel für die EMSA

  1. Montieren Sie das Gel (16 x 16 cm) unter Verwendung von 1,5 mm Abstandshalter und Kamm.
  2. Um eine 6% nativen Polyacrylamidgel vorzubereiten, mit den in Tabelle 3 gezeigten Stammlösungen mischen 7,5 ml 40% Acrylamid. Bisacrylamid, 5 ml 5 x TBE und 37,5 mldoppelt destilliertem H 2 O.
  3. 0,5 ml von 10% frisch zubereitet Ammoniumpersulfat (APS) und 25 ul Tetramethylethylendiamin (TEMED).
  4. Gießen Sie sofort die Acrylamidlösung zum Gel und lassen Sie es zu polymerisieren. Warten für ungefähr 30 min.
  5. Montieren Sie die Elektrophorese-Vorrichtung mit dem Gel, füllen Sie die Tanks mit 0,5x TBE und eine Verbindung mit der Stromversorgung.

6. Electrophoretic Mobility Shift Assay

  1. Verdünne 25 & mgr; g Proteinextrakt aus Zellen oder Geweben mit der zytoplasmatischen Lysepuffer (Tabelle 1) in einem Gesamtvolumen von 10 ul (niedrigeren Proteinkonzentrationen können auch angewandt werden). Halten Sie auf dem Eis. Falls erforderlich, fügen Sie 1 ul 1: 4 verdünnt 2-Mercaptoethanol (2-ME) zum ruhenden IRP1 (Endkonzentration: 2%) aktivieren 25.
  2. Verdünnen Sie die radioaktiv markierten Sonde IRE in doppelt destilliertem H 2 O zu 200.000 cpm / ul, Hitze denaturieren bei 95 °C für 1 min und Abkühlen bei Raumtemperatur für mindestens 5 min.
  3. Bis ein EMSA Reaktion durch Zugabe von 1 ul radioaktiv markierten Sonde an die IRE Proteinextrakt ein.
  4. Inkubieren für 20 min bei RT.
  5. 1 ul 50 mg / ml Heparin zu dem Reaktions (um nicht-spezifische Protein-Wechselwirkungen mit der Sonde 9 inhibieren) angeschlossen und die Inkubation für weitere 10 min. Aliquot der Stammlösung von Heparin (50 mg / ml) und bei -80 ° C.
  6. Wenn lange radiomarkierten Sonden (> 60 Nukleotide), Zugabe von 1 & mgr; l RNase T1 (1 U / ul) und Inkubation für 10 min bei RT, um unspezifische Proteinbindung zu reduzieren, um die Sonde und eine bessere Trennung des RNA / Protein ermöglichen Komplex während der Elektrophorese.
  7. In 3 ul Auftragspuffer (80% Glycerin + Bromphenolblau), mischen und Last auf der 6% nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel.
  8. Führen Sie das Gel für 60 min bei 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer das Gel auf eine große Filterpapier und trocken.
  10. Expose an einen Film und entwickeln Autoradiographie. Belichtungszeit kann von 1 Stunde (oder weniger) bis O / N liegen.

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Ergebnisse

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Ein radioaktiv markiertes IRE Sonde hergestellt wurde, wie in den Abschnitten 3 und 4 des Protokolls beschrieben. Die Sequenz der Sonde war 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; die fettgedruckten Nukleotide stellen einen ungepaarten C-Rest und die Schleife, die kritische IRE Merkmale sind. Die spezifische Radioaktivität der Probe betrug 4,5 x 10 & sup9; cpm / ug RNA.

Um die Auswirkungen von Störungen auf ...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die IRE-Bindungsaktivitäten von IRP1 und irp2 studieren, und wir zeigen repräsentative Daten. Durch die Verwendung von verschiedenen Sonden, kann dieses Protokoll auch für die Untersuchung von anderen RNA-bindenden Proteinen eingestellt werden. Ein kritischer Schritt ist die Größe der Sonde. Verwendung von langen Sonden, die gemeinsam ist, wenn die genaue Bindungsstelle nicht bekannt ist, kann in der RNA / Protein-Komplexe, die nicht anders migrieren als die f...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LeupeptinSIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad Protein AssayBIORAD500-0006
T7 RNA-PolymeraseThermowissenschaftlichesEPO111,
RNase-InhibitorInvitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-Elmer
SzintillationsflüssigkeitBeckman Coulter141349
HeparinSIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
Name des Geräts
Tissue RuptorQiagen9001271
SzintillationszählerBeckman CoulterLS6500
Protean II xi CellBIORAD165-1834
20 Wells KämmeBIORAD165-18681,5 mm dicke
1,5 mm AbstandshalterBIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070
: , , , , : , NEG507H

Referenzen

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Schlagwörter

Iron Regulatory ProteinsIron Responsive ElementsNon Denaturing GelAutoradiography DetectionCytoplasmic Extract PreparationRNA Probe SynthesisHeparin CompetitionBradford Assay

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