Unter Verwendung dieses Protokolls konnten wir Bild 160 um dicke Gehirnschnitte von Mäusen mit dem Parasiten Toxoplasma gondii, der Visualisierung und Analyse der räumlichen Beziehung zwischen dem encysting Parasiten und der infizierten Neuronen ermöglicht infiziert.
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Methodenartikel
3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte In-vivo- Mit Toxoplasma gondii
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten mit einem breiten Wirtsbereich, einschließlich des Menschen und Nagetieren. Bei Mensch und Nager, stellt Toxoplasma eine lebenslange persistierende Infektion im Gehirn. Während dieses Gehirn-Infektion ist asymptomatisch in den meisten immunkompetenten Personen, in den sich entwickelnden Fötus oder immungeschwächten Personen wie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) Patienten, diese Vorliebe für und Persistenz im Gehirn können zu verheerenden neurologischen Krankheit führen. Somit ist es klar, dass die Hirn Toxoplasma-Wechselwirkung ist für die durch Toxoplasma hergestellt symptomatischen Erkrankungen, doch wir haben wenig Verständnis der zellulären oder molekularen Interaktion zwischen Zellen des Zentralnervensystems (ZNS) und den Parasiten. Im Mausmodell von ZNS-Toxoplasmose es seit über 30 Jahren, die Neurone sind die Zellen, in denen der Parasit besteht bekannt, aber wenig bekannt ist über dieTeil des Neurons wird in der Regel infiziert (Soma, Dendriten, Axonen) und wenn das Mobil Beziehung ändert sich zwischen den Stämmen. Teilweise ist dieses Fehlen Sekundär der Schwierigkeit Bildgebung und Visualisierung ganzen infizierten Neuronen aus einem Tier. Solche Bilder würde typischerweise erfordern Serienschnitt und Heften von Gewebe durch Elektronenmikroskopie oder konfokale Mikroskopie nach Immunfärbung abgebildet. Durch die Kombination mehrerer Methoden, die hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Verwendung von dicken Abschnitten (160 um) zu erkennen und Bild ganze Zellen, Zysten enthält, so dass eine dreidimensionale Visualisierung und Analyse von einzelnen, chronisch infizierten Neuronen ohne Immunofärbung Elektronenmikroskopie oder Serienschnitt und Nähen. Mit dieser Technik können wir damit beginnen, die zelluläre Beziehung zwischen dem Parasiten und den infizierten Neuronen zu verstehen.
Einleitung
Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist, eine hohe Auflösung, dreidimensionale Bilder von einzelnen Neuronen, die durch die obligate intrazelluläre Parasiten Toxoplasma gondii infiziert werden erhalten.
Toxoplasma wird oft als eines der erfolgreichsten Parasiten wegen seiner großen Zwischenwirtsspektrum, die Menschen und Nagetieren umfasst. Bei Mensch und Nager, nach einer akuten Infektion durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser, ist Toxoplasma der Lage, eine anhaltende Infektion des ZNS durch Umwandlung von seiner schnellen replizierenden Form (der Tachyzoiten) seiner langsamen replizieren u....
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Protokoll
HINWEIS: Die Mäuse wurden gezüchtet und in einer kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit Zimmer mit 12 h gehalten rückgängig Hell / Dunkel-Zyklen mit Futter und Wasser ad libitum an der Universität von Arizona. Die Experimente wurden unter Richtlinien und Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Arizona durchgeführt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. Die Cre-Reporter-Mäuse sind auf einem C57BL / 6 Hintergrund 11 und sind im Handel erhältlich.
1. Maus-Infektion
HINWEIS: - 12 Verfahren Maus Infektion m....
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Ergebnisse
Figur 7 enthält repräsentative Bilder von zwei Zyste haltigen GFP + Neuronen aus zwei verschiedenen 160 & mgr; m dicke Abschnitte sowie eine repräsentative Messung der Entfernung von Zysten-zu-Zell-Körper 7B dar. Die Figuren 7A und B zeigen, daß diese neue Protokoll ermöglicht die Visualisierung der infizierten Neuronen in seiner Gesamtheit. 7C zeigt, daß mit dieser Abbildungstechnik, ist es nun möglich, den Abstand zwisc.......
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Diskussion
Da die zellulären Veränderungen in infizierten Wirtszellen haben, um Krankheitsverläufe bei Infektionen mit anderen intrazellulären Organismen wie HIV, Tollwut und Chlamydia 18,19 in Verbindung gebracht worden, eine Technik, die es uns ermöglichen, die intimen Interaktionen, die zwischen dem ZNS auftreten Studie entwickelten wir Wirtszelle und Toxoplasma. Das hier beschriebene Verfahren erreicht dieses Ziel durch eine effiziente Abbildung von chronisch infizierten Neuronen. Vor der Entwicklung dieses.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken dem gesamten Koshy für die Diskussionen. Wir danken Patty Jansma und die University of Arizona Neuroscience Institut für Beratung und Hilfe bei der Bildgebung. Wir danken auch den Porreca Labor für die Nutzung ihrer Vibratom. Diese Forschung wurde von der US National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Vibratome Serie 1000 Trennsystem | Technische Produkte International, Inc. | Andere Vibratome sind kompatibel | |
| Glycerin | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Deckgläser | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Ritzer | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Konfokales Metamikroskop | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamin HCl Inj., USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injektion Xylazin 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mäuse | Jackson Laboratoires | 7906 | B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Chirurgische Geräte | Daumenzange; Feine Schere - zur Seite abgewinkelt, scharf-scharf; Scharf-scharfe Schere; Kelly-Hämostaten; Mayo-Schere; Mikro-Spatel. | ||
| Humane Vorhaut-Fibroblasten (HFF)-Zellen | Hierbei handelt es sich um Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut. Wir stellen diese im eigenen Haus her, können aber auch von externen Anbietern gekauft werden. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Lösung, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 Schräghalskolben | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x ohne Calcium und Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10x, USP Steril Ultra Pure Grade | Amresco | K813-500ml | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line-Hämozytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| Maus-Gehirn-Slicer-Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Natriumchlorid | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von Schweinen | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20 ml Einweg-Szintillationsfläschchen | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alkohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | Hauseigene | 17212945 | Dieses Produkt wird in einem hauseigenen Lager gekauft. Andere Unternehmen sind kompatibel. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Klarer Nagellack | Andere Marken sind kompatibel | ||
| 10 ml Spritze mit Luer-Lok | VWR | BD309604 | Andere Spritzen sind kompatibel |
| Drei-Wege-Absperrhahn | Jede Marke ist kompatibel | ||
| Injektionsnadel | Jede Marke ist kompatibel - wird zum Feststecken von Mäusen verwendet. | ||
| Zellschaber | Jede Marke ist kompatibel | ||
| 25 G x 12" Schlauch, Sicherheitsblutentnahmeset, mit Luer-Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Andere Marken sind kompatibel |
Referenzen
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Ei....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 9/01/2015. Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
