Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Zusammenfassung

Candida albicans Biofilm Entwicklung auf biotischen und / oder abiotischen Oberflächen stellt eine besondere Bedrohung für Krankenhaus-Patienten. Bisher C. albicans Biofilme überwiegend in vitro untersucht worden, aber es ist eine dringende Notwendigkeit für ein besseres Verständnis dieser Dynamik unter in vivo-Bedingungen. Wir entwickelten eine in vivo subkutanen Rattenmodell zu studieren C. albicans Biofilm-Bildung. In unserem Modell mehrere (bis zu 9) Candida infizierten Vorrichtungen zum Hinterteil des Tieres implantiert. Das gibt uns einen großen Vorteil gegenüber der zentralen Venenkatheter Modellsystem, da es erlaubt uns, mehrere unabhängige Biofilmen in ein Tier zu studieren. Vor kurzem hat dieses Modell, um C zu studieren wir angepasst albicans Biofilmentwicklung in BALB / c Mäusen. In diesem Modell reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden und zeigen die typische dreidimensionale Biofilmarchitektur. Die Quantifizierung von Pilz BiofilmTraditionell untersucht post mortem und erfordert Host Opfer. Da dies erfordert die Verwendung von vielen Tieren, um kinetische Untersuchungen durchzuführen, wandten wir nicht-invasiv Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) in Längsrichtung folgen in vivo reifen C. albicans Biofilme entwickeln in unserem Unterhautmodell. C. albicans-Zellen wurden entwickelt, um die Gaussia princeps Luciferasegen (Gluc) an die Zellwand gebunden auszudrücken. Die Biolumineszenz-Signal wird von der Luciferase, die das zugegebene Substrat Coelenterazin in Licht, das gemessen werden kann, wandelt hergestellt. Die BLI-Signal glich Zellzahlen aus explantierten Katheter erhalten. Nicht-invasive Bildgebung zur Quantifizierung von in vivo die Bildung von Biofilmen bietet sofortigen Anwendungen für das Screening und Validierung von Antimykotika unter in vivo Bedingungen, als auch für Studien, die auf Wirt-Pathogen-Interaktionen, hiermit einen Beitrag zu einem besseren Verständnising der Pathogenese der Katheter-assoziierten Infektionen.

Einleitung

Candida albicans ist ein kommensalen Organismus, der an verschiedenen Stellen von gesunden Personen auf der Haut oder als ein Teil des Magen-Darm- und Vaginalflora gefunden werden kann, zum Beispiel. Jedoch bei stationär und insbesondere immungeschwächten Patienten kann es zu einer Vielzahl von Infektionen ^1. In solchen Individuen, ermöglicht die Schwächung des Immunsystems Candida-Zellen in die Blutbahn zu verbreiten und die tieferen Gewebe eindringen verursacht lebensbedrohliche Infektionen. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von abiotischen Substrate wie zentralvenöse und Blasenkathetern kann künstliche Herzklappen und Gelenke eine Nische für Candida Anlage ^2. Die Haftung an solchen Substraten ist eine Voraussetzung für die weitere Entwicklung von Biofilmen, die eine Schicht aus Hefe und Hyphenzellen in extrazellulären polymeren Material eingebettet darstellt, die hauptsächlich aus Polysacchariden. ² C. albicans Katheter-assoziierte Infektionensind mit hohen Sterblichkeit verbunden. Ein allgemeines Merkmal von Biofilmen ist ihre verminderte Empfindlichkeit gegenüber bekannten Antimykotika, wie Azole ^3,4. Nur neuere Klassen von Antimykotika, wie Echinocandine und liposomale Formulierung von Amphotericin B bewiesen gegen Katheter-assoziierten Infektionen ^5-7 aktiv zu sein. Aufgrund der Biofilm Widerstandsfähigkeit gegenüber Antimykotika, therapeutische Ansätze sehr begrenzt, oft Katheterentfernung und die anschließende Austausch als alleinige Lösung führt.

Die meisten unserer aktuellen Verständnis C. albicans Biofilmentwicklung aus in vitro-Untersuchungen über abiotischen Substrate wie Polystyrol oder Kunststoffen zur Herstellung von oben genannten Geräte, das heißt, Silikon, Polyurethan ² verwendet. Diese Modelle sind schon recht weit fortgeschritten und versuchen, die Situation in vivo so eng wie möglich zu imitieren. Allerdings sind diese Systeme nicht den kontinuierlichen Blutfluss und t bedeutener das Immunsystem des Wirts. Dies führte zur Entwicklung von in-vivo-Modellsysteme, wie beispielsweise die Zentralvenenkatheter (CVC) Modell ^8-10, der Prothesenstomatitis Modell orale Candidiasis ¹¹ und einem Mausmodell für katheterassoziierten Candidurie ^12. Zusätzlich C. albicans Biofilmentwicklung wurde in vivo an den Schleimhautoberflächen, wie sie aus der Scheide ¹³ und der Mundhöhle ¹⁴ untersucht. Unser Labor trug mit der Einrichtung einer subkutanen C. albicans Biofilm Modell, das auf dem Implantat von infizierten Katheters Stücke auf der Rückseite des Sprague-Dawley-Ratten ¹⁵ basiert. Dieses Modell wurde erfolgreich im Labor verwendet, um Biofilmanfälligkeit Fluconazol testen und Echinocandin Arzneimittel ^5,16, um die Wirkung der kombinatorischen Behandlung von Diclofenac und Caspofungin ¹⁷ zu studieren. In jüngerer Zeit hat dieses System, angepasst zur Verwendung in BALB / c-Mäusen, ^18,19. InVergleich mit anderen in-vivo-Modellen ist der Hauptvorteil dieser subkutanen Modell die Möglichkeit, mehrere Biofilmen pro Tier innerhalb des Lumens des Katheters implantiert Stücke entwickelt studieren.

Um die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren, haben wir dieses Modell, um die Entwicklung von C studieren angepasst albicans Biofilme nicht-invasiv mit Hilfe Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ^18,19. Dieses Verfahren erwies sich als ein leistungsfähiges Verfahren, das verwendet werden kann, um Biofilme durch Messung der spezifischen BLI Signal an dem interessierenden Bereich (in diesem Fall der Bereich des implantierten Katheter) zu quantifizieren, die Vermeidung Tier zu opfern. Im Vergleich zu Bakterien, die sowohl das Gen als auch das für die Biolumineszenz-Reaktion erforderlich Substrat aufgrund der Einführung eines spezifischen lux-Operon ²⁰ exprimieren kann, werden die meisten eukaryotischen Organismen, einschließlich C. albicans, sind abhängig von der heterologen Expression eines Luciferase-Gens in Verbindung mit derexterne Verabreichung eines spezifischen Substrats, wie D-Luciferin oder Coelenterazin ^21. Wahrscheinlich aufgrund der Gegenwart der pilzlichen Zellwand und C. albicans Morphogenese, die intrazelluläre Abgabe des Substrats für die Luciferase-Enzym war eine Hauptaufgabe ^21. Um dieses Problem zu lösen, Enjalbert et al. ²² entwickelt eine Spannung, wo ein synthetisches C. albicans codon-optimierte Version des Gens für das natürlich sezerniert Gaussia princeps Luciferase (Gluc) wurde zu der C verschmolzen albicans PGA59 Gen, verankert ein GPI-Zellwandprotein. Wegen der Anwesenheit von Luciferase in der Zellwand, könnte Probleme hinsichtlich der intrazellulären Verfügbarkeit des Substrats vermieden werden. Dieses spezielle System wurde verwendet, um oberflächliche Infektionen durch C. verursacht studieren albicans ^22. Vor kurzem BLI wurde auch verwendet, um das Fortschreiten von oropharyngealen Candidosen und seine possibl folgene-Behandlung ^23. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von BLI als vielversprechende Technik, um Infektionen, die durch frei lebende Zellen, sondern auch geräteassoziierte Infektionen verursacht studieren.

In dieser Studie beschreiben wir die C. albicans Biofilmentwicklung auf Polyurethankatheterstücke in BALB / c-Mäuse und ihre Quantifizierung mittels BLI. Wir stellen ein ausführliches Protokoll der in vitro Besiedlung von Polyurethankathetern während der Dauer der Anhaftung, gefolgt von der Implantation in Mäuse und anschließende Entwicklung von Biofilmen in lebenden Tieren. Neben der Messung der BLI-Signal von der C emittiert albicans-Zellen, ermitteln wir die Kolonie bildenden Einheiten für den Vergleich mit der Standardtechnik zur Biofilmpilzbelastung Quantifizierung.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Projektnummer 090/2013) genehmigt. Pflegen Tiere im Einklang mit den KU Leuven Tierpflege-Richtlinien.

1. C. albicans Wachstum

1. Vierundzwanzig Stunden vor der Einleitung der Tierexperiment vorbereitet YPD-Platten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt granuliert, 20 g bakteriologischer Pepton und 15 g granuliertes Agar. Make-up Volumen auf 900 ml mit Milli-Q-Wasser und Autoklaven.
2. 50 ml sterile 40% Glucose. Gründlich mischen und in Petrischalen gießen. Verlassen Agarplatten abzukühlen und zu verfestigen.
   HINWEIS: In dieser Studie verwenden zwei Stämme, nämlich Wildtyp C. albicans SC5314 - Gluc negativen Stamm (als WT bezeichnet) und C albicans SKCA23-Stamm, der ein Wildtyp C ist albicans SC5314 mit Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid ²² .In diesem Stamm (benannt SKCA23- Eine transformierteCTgLuc) Gluc wurde unter die Kontrolle des ACT1 (Aktin) Promotor des endogenen PGA59 Gens fusioniert (dieser Promotor aktiv in der Hefe sowie hyphalen Stufe des Pilzwachstums). Dieser Stamm kann aus dem Labor von Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien beantragt werden. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid ²² wurde freundlicherweise von Prof. C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankreich gespendet.
3. Halten Sie beide Stämme in Glycerin Lager und bei -80 ° C.
4. Vor jeder Versuch Streifen Stämme auf eine YPD-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht.

2. Katheter Stück Vorbereitung

1. Vor dem Versuch, zu bestimmen, wie viele Katheter benötigt werden. Es ist möglich, den Katheter 6 Stück pro Maus (3-Katheter an der linken und 3 Katheters auf der rechten Seite des Tieres (2A) bis zu implantieren.
2. Vierundzwanzig Stunden vor der Tierchirurgie, öffnen Sie die PackungAlter, die Triple-Lumen-Katheter unter der biologischen Sicherheitsschrank. Alle nicht benötigten Teile mit einer sterilen Pinzette entfernen und schneiden Sie die mit einem sterilen Skalpell an den Katheter angebracht Teil. Zeigen Herrscher unter dem Kunststoffgehäuse und schneiden Polyurethan Katheter Stücke aus genau 1 cm nach der Skala auf dem Lineal (Abbildung 1).
   Hinweis: Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Art von Katheter Stück nicht phosphoreszierenden und daher für BLI ^18,19.
3. Legen Sie ein Maximum von 15 Schnitt Katheterstücke (Schritt. 2.2) in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Immer bereiten 3 Stück zusätzliche, die verwendet werden, um die Menge der beigefügten Candida-Zellen auf dem Gerät nach Ablauf der Haft aufzuzählen.
4. Ergänzen Kathetern mit etwa 1,8 ml 100% igem fötalem Rinderserum (FBS).
5. Kräftig vortexen und zusätzliche 100 bis 200 ul 100% FBS. Decken Sie alle Katheterstücke mit Serum.
6. Bei 37 ° C über Nacht.

3. Tiere und Unterdrückung des Immunsystems

1. Halten weiblichen BALB / c-Mäuse (ca. 8 Wochen alt) in einzeln belüfteten Filterober Käfigen mit freiem Zugang zu Standard-Futter und Wasser ad libitum.
2. Initiieren Suppression des Immunsystems 24 h vor Tierchirurgie durch Zugabe von Dexamethason (0,4 mg / L), um dem Trinkwasser der Tiere. Um jede bakterielle Kontamination des Wirts zu vermeiden, ergänzen das Trinkwasser mit einer Antibiotika, beispielsweise Ampicillin Natriumpulver (0,5 g / L).
3. Halten Immunsuppression von Tieren während des gesamten Experiments (bis 6 Tage).

4. Ex vivo C. albicans Haftung auf FBS beschichtet Polyurethan-Substrate

1. Übertragen Sie jede Serum beschichteten Katheter Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Kratzen Sie einige C albicans Zellen auf YPD-Platten (Schritt 1) angebaut und suspendieren diese in 1 ml PBS.
3. Verwässern können,dida Zellen (1: 100) in einem separaten Reaktionsgefäß. Nehmen Sie 10 ul der verdünnten Probe und wenden es auf eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie mindestens 16 kleine Quadrate.
4. Bereiten Candida-Zellen (jeder Stamm separat) in RPMI 1640-Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 ⁴ Zellen / ml.
5. 1 ml der Zellsuspension in jede Serum beschichteten Katheterstück.
6. Kräftig vortexen und sicherzustellen, dass die Katheter in das Medium eingetaucht und nicht oben schwimmen.
7. Katheter bei 37 ° C für 90 min (Zeit der Adhäsion).
8. Katheter mit einer sterilen Pinzette entfernen und zweimal waschen Sie sie mit 1 ml PBS. Während dieses Schrittes wird sicherstellen, dass die Waschflüssigkeit geht durch den Hohlraum, indem der Katheter in der vertikalen Position während sehr sanft Spülen der Katheter. Wichtig ist, nicht mit einem starken Strömung, die auf die Entfernung von anhaftenden Zellen führen kann.
9. Übertragen Sie jede gewaschen Katheter in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen (ein Stück pro tusein).
10. Zeigen auf Eis und dort zu halten, bis der Operation.

5. Anästhesie

1. Bereiten Anästhesie durch Mischen von 75 ul von Ketamin (100 mg / ml) mit 100 ul Medetomidin (1 mg / ml) und 825 & mgr; l steriler Kochsalzlösung. Verabreichen intraperitoneal (ip) 60-80 ul Narkosecocktail pro 10 g Körpergewicht, was einer Dosis von 45-60 mg / kg Ketamin und 0,6-0,8 mg / kg Medetomidin.
2. Zum Umlegen der Anästhesie, verdünnter 50 ul Atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml Kochsalzlösung, zu verabreichen ip 100 ul pro 10 g Körpergewicht als Antidot, was in einer Dosis von 0,5 mg / kg.
3. Nach dem Einspritzen der Anästhesie, legen Sie das Tier in einen separaten Käfig und warten Sie, bis es vollständig eingeschlafen.
4. Überprüfen Sie die Betäubung des Tieres durch helle Haut und Zehen Prise Prise, die Schäden an der Haut verursachen. Jeder beobachtete Bewegung zeigt an, dass das Tier nicht ausreichend betäubt eine Operation durchzuführen. Wenn dies geschieht, warten Sie eine couB. von Minuten länger, bis das Tier keine Anzeichen für eine Bewegung auf der Haut oder Zehen Prise zu zeigen.

6. Tierchirurgie

1. Transfer narkotisiert Tieres aus dem Käfig auf einer sauberen Gewebes auf Heizkissen gelegt, auf 37 ° C vorgewärmt (2A, (1)).
   ANMERKUNG: Eine billigere Alternative ist es, elektrisch beheizten Decken benutzen. Es ist auch möglich, isotherme Pads, die in der Mikrowelle vor dem Tierchirurgie erwärmt werden muss verwenden.
2. Bewerben Augensalbe auf die Augen.
3. Rasieren Sie den unteren Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasierer. Entfernen Sie alle Tierhaare und übertragen Tier auf einem sauberen Tuch ab. Desinfizieren Sie die Haut (zB mit 1% Jod Isopropanol oder 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol) und lassen Sie das desinfizierte Bereich für etwa 1 min trocknen (2A, (2)).
4. Einen kleinen Einschnitt in der Haut (eine auf der linken und auf der rechten Seite des Tieres) (ungefähr 0,5 &# 8211; 1 cm) (2A, (3)).
5. Präparieren Sie die Unterhaut mit einer Schere auf zwei subkutanen Tunnel zu erstellen. Jeder Tunnel ist ca. 1,5 cm lang und 1 cm breit sein.
6. Legen Sie drei Katheterstücke, die zuvor mit Candida infiziert ist, in jeden Tunnel. Sicherzustellen, dass die Katheter liegen nebeneinander in einer horizontalen Anordnung und dass sie sich nicht gegenseitig abdecken, um die Implantation von sechs Katheter Fragmente insgesamt ermöglichen (2A, (4)).
7. Schließen Sie die Schnitte mit Nähten. Alternativ können Sie Dermabond, um die Wunde zu schließen.
8. Desinfizieren Sie die Wunde sehr vorsichtig mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%).
9. Bewerben Lokalanästhetikum (Xylocain-Gel, 2%) direkt auf die Wunde.
10. Verabreichen Umkehr Anästhesie (Protokoll 5, Schritt 2): intraperitoneal 100 & mgr; l pro 10 g Körpergewicht.
11. Übertragungs Tier in einen sauberen Käfig zuvor auf eine Heizplatte gelegt. Halten Sie das Tiergetrennte und warm, bis das Tier ganz wach. Inzwischen weiterhin mit dem Betrieb und Implantat der nächste Tier. Sobald alle operierten Tiere sind ganz wach. Transfer zu einem Käfig. Überwachen Tiere regelmäßig.

7. Biolumineszenz Imaging: Darstellung von Coelenterazin (CTZ), dem Substrat für G. princeps Luciferase

1. Bereiten Sie frische Coelenterazin (CTZ) Stammlösung durch Auflösen von 5 mg / ml in CTZ angesäuert Ethanol oder nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Bereiten 1,2 mM Arbeitslösung durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 in steriler PBS.
   HINWEIS: Injizieren Sie 100 ul CTZ Arbeitslösungen subkutan in der Umgebung der Katheter. Verwenden Insulinspritzen zur subkutanen Injektion von CTZ.
3. Halten Sie CTZ im Dunkeln (zB decken Mikrozentrifugenröhrchen, die CTZ mit Aluminiumfolie). Speicherung der Stammlösung bei -80 ° C für die Dauer der Experimente.

8. Biolumineszenz Imaging

1. Initialisieren Sie die BLI-Kamera.
2. Betäuben die Tiere unter Verwendung eines Induktionsfeld. Verwenden eines Gasgemisches von Isofluran in Sauerstoff, N ₂ O / O ₂ oder Luft bei 2-3%.
3. Nach der Induktion, Aufrechterhaltung einer Narkose in der Induktionsfeld und in der Abbildungskammer bei 1,5-2%.
4. Vor dem Start des Bildgebungssitzung, legen Sie die Speicherfolie in Position A, die zu einem Sichtfeld von 10 cm entspricht. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position der Anästhesie Stellen und Tier, indem Sie einen Schlaf Tier in der Box.
5. Nehmen einige Fotografien bis Tier in der gewünschten Abbildungsstellung, in der FOV direkt unter der Kamera.
6. Bereiten Sie zwei Insulinspritzen mit je 100 ul der CTZ Arbeitslösung.
7. Legen Sie ein Tier auf der Bank und halten Sie sie schläft mit Hilfe einer Nasenkegel Bereitstellung Gasnarkose.
8. Bringen Sie die Nadel der Spritze in einem Ort umgebenden Katheter subkutan und spritzenCTZ gleichzeitig auf der Oberseite der Katheter.
9. Unmittelbar nach der Injektion, legen Sie das Tier auf der Warmhalteplatte in der Kamera Box und starten Sie die Bild Biolumineszenz Erwerb.
10. Erwerben aufeinanderfolgenden Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 s (abhängig von der Signalintensität), bis die maximale Signalintensität erreicht wird. Bei der Übernahme des nächsten Rahmens, messen Sie die BLI Signalintensität der zuvor erworbenen Rahmen, indem Sie einen ROI in jedem Katheter Trio und die Messung der Photonenfluss durch diese ROI.
11. Wiederholen Sie ab Schritt 7 für das nächste Tier (e).
12. Nach der Bilderzeugung zurück Tiere in ihren Käfig. Wiederholen BLI im Verlauf eines Experiments zur Längs, nicht-invasive Verfolgung von Biofilm-Bildung.
13. Analysieren Sie die BLI Daten mit Wohnzimmer Bild-Software. Legen Sie eine rechteckige ROI fester Größe auf jedem Katheter Trio und Messung der Photonenfluss (Ausstrahlung) durch jede ROI. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier.
14. Berichtdie BLI-Signal Intensität jedes Katheters Trio als Photonenfluss pro Sekunde. Stellen die BLI-Daten auf einer logarithmischen Skala, indem die Mittelwerte und Standardabweichungen von der Photonenfluss pro Sekunde für jede Gruppe. Statistische Analyse an den log ₁₀ transformierten Daten.

9. Katheter Explantation

1. Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS, eine für jede Kathetervorrichtung und halten sie auf Eis.
2. Euthanize die Tiere durch Genickbruch (2B) (1).
3. Desinfizieren Sie die Haut des Rückens mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%).
4. Einen Einschnitt (ca. 3 cm) über den Katheter.
5. Schneiden subkutane Gewebe und entfernen Sie den Katheter Fragmente eins nach dem anderen unter Verwendung einer sterilen Pinzette das subkutane Gewebe (2B, (2)).
6. Griff Katheter vorsichtig in vertikaler Position und waschen Sie ihn zweimal mit 1 ml sterilem PBS. Setzen Sie jeden KatheterStück in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen (hergestellt in Schritt 1).

10. Die Quantifizierung der Biofilm-assoziierte Zellen durch Koloniebildende Einheiten Count (KBE) und statistische Analysen der Ergebnisse

1. Mit Ultraschall-Katheter zuvor in 1 ml PBS für 10 min bei 40.000 Hz in einem Wasserbad Beschallungsgerät platziert und sie auf Eis.
2. Nach der Ultraschallbehandlung kräftig für 30 Sekunden und Platz vortexen wieder auf Eis.
3. Bereiten Sie zwei weitere Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul PBS.
4. Achten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen von Ihrem ursprünglichen Probe (die, die den Katheter enthält) und alle Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis zu halten.
5. Platte 100 ul der ursprünglichen Proben, 1:10 und 1: 100 Verdünnungen auf YPD-Agar-Platten in zweifacher Ausfertigung.
6. Inkubation erfolgt für 2 Tage bei 37 ° C und zählen KBE.
7. Zählen Sie die auf YPD-Agarplatten Kolonien (zählbare Menge von Kolonien, maximal 300 Kolonien / Platte) und multiplizieren Sie sie mit der richtigen DiluFaktors (1x-Original, 10x oder 100x Verdünnung). Ferner multiplizieren jedes Katheters Stück 10x, die der endgültigen Höhe der Kolonien in 1 ml Röhrchen mit dem Katheter entspricht. Bringen Sie die endgültige Höhe der Kolonien bis ₁₀ Zellen / Katheterstück mit Standardabweichung (SD) anmelden. Express-Daten als Mittelwert ± SD.
8. Legen Sie alle Werte für jeden Katheters und spezifische Gruppe in eine Tabellenkalkulation und / oder statistischen Programms, um die oben erwähnten Berechnungen und statistischen Analysen durchzuführen. Geben Sie an, bestimmte Gruppen zu vergleichen, dh WT vs. Mutante oder 2 Tage vs. 6 Tage die Biofilmbildung und führen ungepaarter t-Test und ANOVA mit Tukey post-Test auf den log10-transformierten Daten.
   1. Express das Signifikanzniveau von einem p-Wert. In dieser Studie zeigen, Bedeutung, wenn p-Wert <0,05, wie folgt vertreten: * p <0,05, ** p <0.005, *** p <0,0005.

Ergebnisse

In dieser Studie zeigen wir, das chirurgische Verfahren der Katheter-Implantat und Explantat während der in vivo C. albicans Biofilmentwicklung in einer Maus. Darüber hinaus zeigen wir die Quantifizierung der reife Biofilme nicht nur durch klassische KBE Aufzählung, sondern auch von BLI.

Wie in 1A gezeigt, wurden nicht-phosphoreszierend Polyurethankatheter in Stücke von 1 cm geschnitten Vorrichtungen und anschließend mit Serum beschichtet. Dieser Schritt ist sehr wi...

Diskussion

Die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere Nagermodellen, für Studien zur mikrobiellen Biofilmen gewidmet ist sehr wichtig, da die Host-Immunsystem ist ein wesentlicher Faktor für die Bildung von Biofilmen, die in vitro-Modelle nicht erklären kann. In dieser Studie wurde eine relativ einfache subkutane C. beschreiben wir albicans Biofilm Mausmodell, die leicht in einem Forschungslabor angenommen werden kann und keine starke technische Fähigkeiten. Dieses Modell wurde ursprünglich entwick...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hefeextrakt granuliert	Merck	MERC1.03753.0500
Bakteriologisches Pepton	Oxoid	LP037B
Agar granuliert	Difco	214530
D-(+)-glucose	Fluka	49159-5KG
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Im Labor		für 1L von 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4
RPMI1640 mit L-Glutamin und ohne Natriumcarbonat	Sigma	R6504-1L	Bereiten Sie sich gemäß dem Protokoll für Candida albicans-Empfindlichkeitstests vor.
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS wird verwendet, um den pH-Wert des RPMI-Mediums (pH 7,0)
fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F7524
Polyurethan-Kuttel-Lumen intravenöses Katheterstück (2,4 mm Durchmesser, Certofix Trio S730) einzustellen	BBraun	CV-15703	Polyurethan-Teil in 1 cm große Stücke geschnitten
Dexamethason	Fagron SAS, Frankreich	611139	Immunsuppressivum (Stammlösung 10 mg/ml)
Ampicillin	Duchefa Biochemie, Niederlande	A0104	Antibakterielle Prophylaxe
Ketamin 1000	Pfizer	804 119	Anästhetikum
Domitor	Pfizer	134737-1	Anästhetikum
Antisedan	Pfizer	134783-2	Umkehrung der Anästhesie
Xylocain Gel (2%) - das ist Linisol	AstraZeneca	352 1206	Lokalanästhetikum für die Haut
Terramycin/ Polymyxin-b Augensalbe Zur Vorbeugung			von Austrocknung und Infektion der Augen
Coelenterazin	Prolume (Nanolicht)	NF-CTZ-FB	Lichtempfindliches Mittel (muss im Dunkeln aufbewahrt werden)
Jodisopropanol (1%)	3M™ DuraPrep&Handel;		Desinfektionsmittel für die Haut
0,5 % Chlorhexidin in 70 % Alkohol.	Cedium		Desinfektionsmittel für die Haut
Ausrüstung
Zellzählkammer
Insulinspritzen (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Zur Injektion von Coelenterazin
Elektrischer Rasierer			Für Kleintiere
Sterile chirurgische Instrumente			Schere, 2 Paar Pinzetten,
Skalpell Heizkissen	Leica	14042321474
Hautnaht	Johnson& Johnson	K890H	Chirurgischer Faden, Nadel
Wasserbad-Ultraschallgerät	Branson 2210
BLI Kamera (IVIS Spectrum)	Perkin Elmer, Alameda	IVISSPE
Living Image Software	Perkin Elmer, Alameda		(Version 4.2)