Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Zusammenfassung

Candida albicans Biofilm Entwicklung auf biotischen und / oder abiotischen Oberflächen stellt eine besondere Bedrohung für Krankenhaus-Patienten. Bisher C. albicans Biofilme überwiegend in vitro untersucht worden, aber es ist eine dringende Notwendigkeit für ein besseres Verständnis dieser Dynamik unter in vivo-Bedingungen. Wir entwickelten eine in vivo subkutanen Rattenmodell zu studieren C. albicans Biofilm-Bildung. In unserem Modell mehrere (bis zu 9) Candida infizierten Vorrichtungen zum Hinterteil des Tieres implantiert. Das gibt uns einen großen Vorteil gegenüber der zentralen Venenkatheter Modellsystem, da es erlaubt uns, mehrere unabhängige Biofilmen in ein Tier zu studieren. Vor kurzem hat dieses Modell, um C zu studieren wir angepasst albicans Biofilmentwicklung in BALB / c Mäusen. In diesem Modell reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden und zeigen die typische dreidimensionale Biofilmarchitektur. Die Quantifizierung von Pilz BiofilmTraditionell untersucht post mortem und erfordert Host Opfer. Da dies erfordert die Verwendung von vielen Tieren, um kinetische Untersuchungen durchzuführen, wandten wir nicht-invasiv Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) in Längsrichtung folgen in vivo reifen C. albicans Biofilme entwickeln in unserem Unterhautmodell. C. albicans-Zellen wurden entwickelt, um die Gaussia princeps Luciferasegen (Gluc) an die Zellwand gebunden auszudrücken. Die Biolumineszenz-Signal wird von der Luciferase, die das zugegebene Substrat Coelenterazin in Licht, das gemessen werden kann, wandelt hergestellt. Die BLI-Signal glich Zellzahlen aus explantierten Katheter erhalten. Nicht-invasive Bildgebung zur Quantifizierung von in vivo die Bildung von Biofilmen bietet sofortigen Anwendungen für das Screening und Validierung von Antimykotika unter in vivo Bedingungen, als auch für Studien, die auf Wirt-Pathogen-Interaktionen, hiermit einen Beitrag zu einem besseren Verständnising der Pathogenese der Katheter-assoziierten Infektionen.

Einleitung

Candida albicans ist ein kommensalen Organismus, der an verschiedenen Stellen von gesunden Personen auf der Haut oder als ein Teil des Magen-Darm- und Vaginalflora gefunden werden kann, zum Beispiel. Jedoch bei stationär und insbesondere immungeschwächten Patienten kann es zu einer Vielzahl von Infektionen ^1. In solchen Individuen, ermöglicht die Schwächung des Immunsystems Candida-Zellen in die Blutbahn zu verbreiten und die tieferen Gewebe eindringen verursacht lebensbedrohliche Infektionen. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von abiotischen Substrate wie zentralvenöse und Blasenkathetern kann künstliche Herzklappen und Gelenke eine Nis....

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Projektnummer 090/2013) genehmigt. Pflegen Tiere im Einklang mit den KU Leuven Tierpflege-Richtlinien.

1. C. albicans Wachstum

1. Vierundzwanzig Stunden vor der Einleitung der Tierexperiment vorbereitet YPD-Platten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt granuliert, 20 g bakteriologischer Pepton und 15 g granuliertes Agar. Make-up Volumen auf 900 ml mit Milli-Q-Wasser und Autoklaven.
2. 50 ml sterile 40% Glucose. Gründlich mischen und in Petrischalen gießen. Verlassen Agarplatten abzukühlen und zu verfestigen.
   HINWEIS: In dieser Studie verwen....

Ergebnisse

In dieser Studie zeigen wir, das chirurgische Verfahren der Katheter-Implantat und Explantat während der in vivo C. albicans Biofilmentwicklung in einer Maus. Darüber hinaus zeigen wir die Quantifizierung der reife Biofilme nicht nur durch klassische KBE Aufzählung, sondern auch von BLI.

Wie in 1A gezeigt, wurden nicht-phosphoreszierend Polyurethankatheter in Stücke von 1 cm geschnitten Vorrichtungen und anschließend mit Serum beschichtet. Dieser Schritt ist sehr wi.......

Diskussion

Die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere Nagermodellen, für Studien zur mikrobiellen Biofilmen gewidmet ist sehr wichtig, da die Host-Immunsystem ist ein wesentlicher Faktor für die Bildung von Biofilmen, die in vitro-Modelle nicht erklären kann. In dieser Studie wurde eine relativ einfache subkutane C. beschreiben wir albicans Biofilm Mausmodell, die leicht in einem Forschungslabor angenommen werden kann und keine starke technische Fähigkeiten. Dieses Modell wurde ursprünglich entwick.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hefeextrakt granuliert	Merck	MERC1.03753.0500
Bakteriologisches Pepton	Oxoid	LP037B
Agar granuliert	Difco	214530
D-(+)-glucose	Fluka	49159-5KG
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Im Labor		für 1L von 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4
RPMI1640 mit L-Glutamin und ohne Natriumcarbonat	Sigma	R6504-1L	Bereiten Sie sich gemäß dem Protokoll für Candida albicans-Empfindlichkeitstests vor.
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS wird verwendet, um den pH-Wert des RPMI-Mediums (pH 7,0)
fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F7524
Polyurethan-Kuttel-Lumen intravenöses Katheterstück (2,4 mm Durchmesser, Certofix Trio S730) einzustellen	BBraun	CV-15703	Polyurethan-Teil in 1 cm große Stücke geschnitten
Dexamethason	Fagron SAS, Frankreich	611139	Immunsuppressivum (Stammlösung 10 mg/ml)
Ampicillin	Duchefa Biochemie, Niederlande	A0104	Antibakterielle Prophylaxe
Ketamin 1000	Pfizer	804 119	Anästhetikum
Domitor	Pfizer	134737-1	Anästhetikum
Antisedan	Pfizer	134783-2	Umkehrung der Anästhesie
Xylocain Gel (2%) - das ist Linisol	AstraZeneca	352 1206	Lokalanästhetikum für die Haut
Terramycin/ Polymyxin-b Augensalbe Zur Vorbeugung			von Austrocknung und Infektion der Augen
Coelenterazin	Prolume (Nanolicht)	NF-CTZ-FB	Lichtempfindliches Mittel (muss im Dunkeln aufbewahrt werden)
Jodisopropanol (1%)	3M™ DuraPrep&Handel;		Desinfektionsmittel für die Haut
0,5 % Chlorhexidin in 70 % Alkohol.	Cedium		Desinfektionsmittel für die Haut
Ausrüstung
Zellzählkammer
Insulinspritzen (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Zur Injektion von Coelenterazin
Elektrischer Rasierer			Für Kleintiere
Sterile chirurgische Instrumente			Schere, 2 Paar Pinzetten,
Skalpell Heizkissen	Leica	14042321474
Hautnaht	Johnson& Johnson	K890H	Chirurgischer Faden, Nadel
Wasserbad-Ultraschallgerät	Branson 2210
BLI Kamera (IVIS Spectrum)	Perkin Elmer, Alameda	IVISSPE
Living Image Software	Perkin Elmer, Alameda		(Version 4.2)