Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein von der Community akzeptiertes Protokoll im Multimedia-Format für die subretinale Injektion eines Bolus von RPE-Zellen in Ratten und Mäuse. Dieser Ansatz kann zur Bestimmung von Rettungspotenzialen, Sicherheitsprofilen und Überlebenskapazitäten von transplantierten RPE-Zellen nach Implantation in Tiermodellen der Netzhautdegeneration verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Umwandlung von Licht in elektrische Impulse erfolgt in der äußeren Netzhaut und wird weitgehend von Stäbchen und Zapfen-Photorezeptoren und retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen durchgeführt. RPE liefern wichtige Unterstützung für Photorezeptoren und den Tod oder Dysfunktion der RPE-Zellen ist charakteristisch für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die häufigste Ursache für dauerhafte Sehverlust bei Menschen im Alter von 55 und älter. Während keine Heilung für AMD identifiziert worden ist, kann die Implantation von gesunden RPE in erkrankten Augen sich als eine wirksame Behandlung sein, und eine große Zahl von RPE-Zellen können leicht aus pluripotenten Stammzellen erzeugt werden. Einige interessante Fragen hinsichtlich der Sicherheit und Wirksamkeit von RPE-Zell Lieferung noch in Tiermodellen untersucht werden, und gut anerkannten Protokollen zur RPE injizieren entwickelt. Die hier beschriebene Technik ist von mehreren Gruppen in verschiedenen Studien verwendet und beinhaltet zunächst ein Loch in das Auge mit einer spitzen Nadel schaffen. Dann wird eine Spritze mit einer Blunt Nadel mit Zellen beladen ist, durch das Loch eingeführt und geleitet durch den Glas bis es leicht berührt RPE. Mit dieser Einspritzverfahren, das relativ einfach und erfordert minimale Ausrüstung wir konsistente und effiziente Integration von Stammzellen abgeleiteten RPE Zellen zu erreichen zwischen dem Host RPE, die signifikante Menge an Photorezeptordegeneration verhindert in Tiermodellen. Obwohl nicht Teil der tatsächlichen Protokoll beschreiben wir auch, wie das Ausmaß des Traumas durch die Injektion und zum Überprüfen, ob die Zellen in den subretinalen Raum unter Verwendung von in vivo-Bildgebungsverfahren injiziert induziert wird. Schließlich wird die Verwendung dieses Protokoll nicht RPE Zellen begrenzt; es kann verwendet werden, um jede Verbindung oder Zelle in den subretinalen Raum zu injizieren.

Einleitung

Die sensorische Netzhaut ist in funktionelle Schichten von Neuronen, Gliazellen und Endothelzellen unterteilt. Photorezeptoren auf der Rückseite der Netzhaut werden durch Licht aktiviert; Durch Phototransduktion wandeln sie Photonen in elektrische Signale um, die von Interneuronen verfeinert und an die Sehrinde im Gehirn weitergeleitet werden. Phototransduktion kann nicht ohne die koordinierten Anstrengungen von Mueller-Gliazellen und retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) stattfinden. RPE sind in einer Monoschicht direkt hinter den Photorezeptoren organisiert und erfüllen mehrere und vielfältige Funktionen, die für die Funktion der Photorezeptoren und die Homöostase wesentlich sind. Tatsächlich sind RPE und Photorezeptoren so voneinander abhängig, dass sie als eine funktionelle Einheit betrachtet werden. Der Tod oder die Dysfunktion von RPE führt zu verheerenden Sekundärwirkungen auf die Photorezeptoren und ist mit der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) verbunden, der Hauptursache für Erblindung bei älteren Menschen^1,2.

Obwohl keine Heilung für AMD entdeckt wurde, haben mehrere klinische Studien gezeigt, dass der Ersatz von RPE-Zellen eine vielversprechende therapeutische Option sein könnte^3-13. Mit dem Aufkommen der Stammzelltechnologie ist es nun möglich, eine große Anzahl von RPE-Zellen in vitro aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen (hES und hiPS) zu erzeugen, die ihren somatischen Gegenstücken funktionell und anatomisch stark ähneln^14-26. Aus Stammzellen gewonnene RPE haben auch in vivo von mehreren unabhängigen Gruppen, einschließlich unserer eigenen, gezeigt, dass sie die Netzhautdegeneration in Ratten- und Mauslinien mit spontaner Netzhautdegeneration signifikant verlangsamen^{16,18,21,22,25,28,29}. Diese Kombination aus klinischer und präklinischer Evidenz ist so überzeugend, dass derzeit mehrere klinische Studien zur Verhinderung von Netzhautdegeneration mit aus Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen durchgeführt werden^30,31.

RPE kann leicht aus hES und/oder hiPS abgeleitet und mit verschiedenen Ableitungs- und Injektionstechniken in den subretinalen Raum von Nagetieren implantiert werden^32,33. (Siehe Westenskow et al. für ein Methodenpapier im Multimedia-Format, das das von uns verwendete gerichtete Differenzierungsprotokoll demonstriert)³⁴. Es gibt noch kritische Fragen bezüglich der Sicherheit, des Überlebens und der Funktionsfähigkeit von exogen verabreichten RPE-Zellen nach der Implantation, daher ist die Fähigkeit, subretinale Injektionen bei Nagetieren durchzuführen, eine entscheidende Fähigkeit^{16,18,21,29,36,37}. Die Verabreichung von RPE ist nicht trivial, und das Feld ist über die effektivste Injektionstechnik geteilt. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, ist eine einfache und effektive Methode zur subretinalen Abgabe des Bolus von RPE-Zellen und wurde in der ersten klinischen Studie zur Stammzelltransplantation von RPE³¹ verwendet. (Der Leser kann sich auch auf einen anderen JoVE-Artikel von Eberle et al. beziehen, um eine alternative Darstellung von subretinalen Injektionen bei Nagetieren zu erhalten. ³⁸)

Die in diesem Manuskript beschriebene Technik kann nicht visualisiert werden und ein Trauma ist unvermeidlich (wie bei jeder subretinalen Injektionstechnik). Sie wird durchgeführt, indem ein Loch direkt unter den Limbusgefäßen gebohrt und eine stumpfe Nadel auf einem transskleralen Weg eingeführt wird, um einen Zellbolus unter die diametral entgegengesetzte Netzhaut zu injizieren. Die Person, die die Injektion durchführt, spürt einen Widerstand, wenn die stumpfe Nadel die Netzhaut berührt. Die Zellen können jedoch direkt nach der Injektion sichtbar gemacht werden, und der Grad der induzierten Netzhautablösung kann bestimmt werden, indem die RPE-Zellen mit einem transienten Fluoreszenzmarker markiert und mit einem konfokalen Scanning-Ophthalmoskop (cSLO) nachgewiesen werden. Ein optisches Kohärenztomographie-System (OCT) kann ebenfalls verwendet werden, um das Trauma zu überwachen und die Injektionsstelle leicht zu identifizieren.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Scripps Research Institute gegründet behandelt.

1. Vorbereitung der Materialien für die Injektion (~ 20 min)

1. Vorwärmen Zelldissoziationslösung (vorzugsweise eine, die durch den Verdünnungs inaktiviert wird, nicht mit Serum), sterile PBS und Kulturmedien (Tabelle 1).
2. Sterilisieren Sie die Spritze mit einer stumpfen Nadel durch Demontage und es Kochen Sie die Teile in Wasser 15 min.

2. Herstellung der RPE-Zellen für die Injektion (~ 30 min bis 1 h)

1. Lösen Sie die RPE-Zellen mit vorgewärmten Zelldissoziationslösung für 5-8 Minuten bei 37 ° C.
2. Kratzen Sie die Zellen vorsichtig zu einem noch angebracht sind freizugeben.
3. Verdünnen Sie die Zellen mit einem großen Volumen von Kulturmedien (füllen einen 15-ml-Tube), um die Dissoziationslösung inaktivieren und gezählt.
4. Zentrifuge bei 800 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
5. Die Zellen auf 200.000 Zellen / ul (100.000 Zellen in einem 0,5 ul Volumen zu liefern) in sterile vorgewärmten PBS und übertragen diese in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Fügen Sie optional einen Live Cell transienten Fluoreszenzmarker und bei 37 ° C für 30-45 min.
7. Legen Sie die Spritze mit einer stumpfen Nadel mit 0,5 ul der Zellen. Injizieren die Zellen so schnell wie möglich.

3. Unternetzhaut Injection (~ 5 min pro Injektion)

HINWEIS: Wenn möglich, zu lernen, die Technik mit Erwachsenen Albinoratten, da die Limbus Gefäße sind viel einfacher zu visualisieren. Injizieren Fast Green-Lösung, wenn das Lernen (bevor Sie versuchen, Zellen injizieren), um die Visualisierung der Injektionsstelle leichter zu erleichtern.

1. Anesthetize das Nagetier. Verwenden intraperitoneale Injektionen von 100 mg / ml Ketamin und 10 mg / ml Xylazin (20 & mgr; l / 10 g Körper wacht) über Isofluoran Inhalation, da es schwierig ist, das Nagetier manövrieren und zu injizieren, in dem Auge mit der Schnauze in dem Inhalator.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Tier tief durch Kneifen einer seiner Pfoten betäubt. Wenn er zuckt zusammen, einige Minuten warten und erneut versuchen, bevor Sie den subretinalen Injektion.
2. Positionieren Sie das Nagetier auf die Seite, so dass das Auge, das injiziert wird wird mit Blick auf die Decke.
3. Unter einem Binokular sanft dehnen die Haut, so dass die Augen öffnet leicht nach oben aus dem Sockel (temporäre Exophthalmus) und leichter zugänglich, indem Sie den Kopf mit zwei Fingern direkt über dem Ohr und durch seinen Kiefer und sanft dehnen die Haut parallel zu den Augenlidern so dass das Auge springt leicht nach oben aus dem Sockel (siehe Abbildung 1C). Fassen Sie nicht die Nager zu nahe an der Kehle.
4. Mit einem 30 gis Einweg vorsterilisiert Nadel, machen Sie ein Loch direkt unter dem Limbus (wenn die Gefäße betroffen sind, werden Blutungen bE signifikant und es schwierig sein, das Loch später zu finden) und in einem Winkel zu vermeiden, berühren Sie das Objektiv mit der Nadel (1D). Berühren Sie das Objektiv mit der scharfen (oder stumpf) Nadel oder unmittelbaren Kataraktbildung auftreten.
   HINWEIS: Die Injektionen besser mit zwei Personen. Auf diese Weise kann eine Person die Spritze mit der stumpfen Nadel auf die Person, die die Injektion, nachdem sie das erste Loch mit der scharfen Nadel Einweg erstellt, um den Fokus auf das zu halten, wo das Loch spielte.
5. Fahren Sie den Einweg-spitzen Nadel aus dem Auge und gleichzeitig die Haftung auf den Kopf. Denken Sie daran, genau dort, wo das Loch ist.
6. Nachdem sowohl die Montage des vorinstallierten Spritze mit einer stumpfen Nadel auf einem Mikromanipulator oder halten Sie es von Hand, legen Sie die Spitze der Spritze mit der stumpfen Nadel durch das Loch, kümmert sich wieder das Objektiv nicht zu berühren und drücken Sie sie vorsichtig durch das Auge sehr vorsichtig, bis das Gefühl Widerstand (1D).
7. Keeping alle Bewegungen auf ein Minimum, sorgfältig zu injizieren die RPE-Zellen langsam in den subretinalen Raum.
   HINWEIS: RPE / Netzhautablösung induziert wird; dies unvermeidbar ist. Jedoch eine sauberere Injektion minimiert die Ablösung und die Chancen der Wiederbefestigung (1E) stark verbessert. Alle übertriebenen Bewegungen kann die Nadel wieder in die Netzhaut zu bewegen und Seitwärtsbewegungen kann die Netzhaut schädigen. Die Verwendung einer Einspritzpumpe ist optional, aber ermöglicht eine sehr präzise Lieferung.
8. Ziehen Sie die Spritze langsam. Bewerben Auge Feuchtigkeitstropfen auf das Auge hydratisiert.
9. Weiter, um das Tier zu überwachen, bis sie Brustlage gewinnt. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in einen Käfig mit anderen Alarm Tiere, bis sie Brustlage gewinnt.

Ergebnisse

Wir können eine Aussetzung der RPE-Zellen schnell und konsequent in den subretinalen Raum von Nagetieren zu liefern mit dem in dieser Handschrift beschriebenen Technik. Obwohl nicht erforderlich, können Traumata stark mit dem mit einem Mikromanipulator in 1A & B gezeigten Aufbau minimiert werden. Halten Sie den Nager wie in 1C für temporäre Exophthalmus gezeigt. Die Schritte sind die gleichen, wenn der Mikromanipulator oder von Hand durchgeführt wird; diese werden in der Karikatur i...

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir ein relativ einfaches Verfahren zum Durchführen subretinalen Injektion von RPE-Zellen in Suspension in Ratten und Mäusen. Das Protokoll ist einfach zu erlernen und mehr Erfahrung mit der Technik zu weniger Verletzungen zu übersetzen (3; dies stellt eine der besseren Injektionen), insbesondere wenn ein Mikromanipulator verwendet wird (1A). Jede Trauma kann in vivo mit einem cSLO und OCT-System (2), wenn vorhanden überwacht werde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Grün CMFDA	Molekulare Sonden	C34552	50 µ g x 20
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Schnelles Grün	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Mittelschwere bis schwere Gleitmittel Augentropfen	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modell 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spritze x 1
Hamilton Nadel 33 G, 0.5", Spitze 3 (304 Edelstahl)	Hamilton	7803-05	Nadeln x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Ersatz	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamin 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetischer Ständer	Leica Biosystems	39430216	Ständer x 1
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Mikromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip-Tip-Spritzen ohne Nadeln BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Packung x 1
Spezialnadeln BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzym (1X), kein Phenolrot	Gibco	12604013	100 ml x 1