Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Zusammenfassung

Das Studium der menschlichen T-Lymphozytenbiologie beinhaltet oft die Untersuchung von Reaktionen auf aktivierende Liganden. T-Zellen erkennen und reagieren auf prozessierte Peptidantigene, die von MHC-Molekülen (humaner orthologer HLA) über den T-Zell-Rezeptor (TCR) präsentiert werden, und zwar auf hochempfindliche und spezifische Weise. Während die Hauptfunktion von T-Zellen darin besteht, schützende Immunantworten auf fremde Antigene zu vermitteln, die von self-MHC präsentiert werden, reagieren T-Zellen robust auf antigene Unterschiede in allogenen Geweben. T-Zell-Antworten auf Alloantigene können entweder als direkte oder indirekte Alloreaktivität beschrieben werden. Bei der Alloreaktivität reagiert die T-Zelle durch eine hochspezifische Erkennung sowohl des vorgestellten Peptids als auch des MHC-Moleküls. Die robuste oligoklonale Reaktion von T-Zellen auf allogene Stimulation spiegelt die große Anzahl potenziell stimulierender Alloantigene wider, die in allogenen Geweben vorhanden sind. Während die Breite der alloreaktiven T-Zell-Antworten ein wichtiger Faktor bei der Initiierung und Vermittlung der Pathologie ist, die mit biologisch relevanten alloreaktiven Reaktionen wie der Graft-versus-Host-Krankheit und der Allotransplantatabstoßung verbunden ist, kann sie eine Analyse der T-Zell-Antworten auf allogene Liganden ausschließen. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll ein Verfahren zur Erzeugung alloreaktiver T-Zellen aus naiven humanen peripheren Blutleukozyten (PBL), die auf bekannte Peptid-MHC (pMHC)-Alloantigene ansprechen. Das Protokoll wendet die pMHC-Multimermarkierung, die Anreicherung magnetischer Beads und die Durchflusszytometrie auf Einzelzell-In-vitro-Kulturmethoden zur Erzeugung von Alloantigen-spezifischen T-Zell-Klonen an. Dies ermöglicht es, die Biochemie und Funktion von T-Zellen zu untersuchen, die auf allogene Stimulation reagieren.

Einleitung

T-Lymphozyten sind kritische Komponenten des adaptiven Immunsystems. T-Zellen sind nicht nur direkt Vermittlung schützende Immunantworten gegen Pathogene durch eine Vielzahl von Effektor-Mechanismen, sondern auch aktiv Aufrechterhalten immunologischen Selbsttoleranz und Lenken der Antworten von anderen Zellen des Immunsystems verantwortlich. Diese Funktionen werden durch eine Reihe von integrierten Signale, einschließlich T-Zell-Rezeptor (TCR), Ligation, Zytokine und Chemokine und Metaboliten ¹ gerichtet. Dieser Signale ist von besonderer Bedeutung der TCR, da sie die charakteristische Besonderheit, die die Rolle der T-Zellen in der adaptiven Immunität def....

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von peripheren Blutproben von Probanden. Alle Forschung mit menschlichen Probanden sollten überprüft und durch eine Menschen Studies Institutional Review Board genehmigt, um die Einhaltung der Deklaration von Helsinki (2013) und dem Health Insurance Portability and Accountability Act von 1996 zu gewährleisten.

1. Isolierung von T-Zellen aus Vollblut

1. Vor dem Start, warm das Dichtegradienten-Medium auf Raumtemperatur. Aliquot 4 ml Dichtegradienten-Medium in 2-4 sterile konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro 10 ml Gesamtvolumen verdünnt Blut verwendet werden).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung klonaler menschlichen T-Zellkulturen mit Alloantigen Spezifität über eine Magnetperle Anreicherung und Einzelzell Durchflusszytometrie Sortierstrategie festgelegt. Abbildung 1 gibt einen Überblick über den Prozess.

Figur 1: Protokoll Sicht Das hier beschriebene Protokoll stellt ein zuverlässiges Verfahr.......

Diskussion

Die T-Zell-Alloreaktivität ist ein seit langem untersuchtes und klinisch relevantes Phänomen. Die robusten proliferativen und Effektorreaktionen von T-Zellen auf allogene Stimulation haben umfangreiche Analysen der humanen T-Zell-Antworten in vitro durch relativ einfache gemischte Lymphozytenreaktionen von peripheren Blut-T-Zellen gegen inaktivierte allogene Zellen ermöglicht. Diese primären alloreaktiven T-Zell-Antworten sind jedoch oligoklonal und bestehen aus einer großen Anzahl einzelner T-Zellen, die auf sp.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natrium-Heparin-Venenblutentnahmeröhrchen 16 x 100 mm	Becton, Dickenson and Company	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit	Stemcell Technologies	15061
Dulbecco's PBS, 1x ohne Ca oder Mg	Corning	21-031-CV
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Fluorophor-markiertes pMHC-Tetramer	NIH Tetramer Facility	NA
EasySep Biotin Selection Kit	Stemcell Technologies	18553
EasySep Selection Magnet	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Humane Fc-Blockierungslösung	Biolegend	422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (Klon UCHT2)	Biolegend	300621
Anti-CD14 FITC (Klon HCD14)	Biolegend	325603
Anti-CD19 FITC (Klon HIB19)	Biolegend	302205
Iscove's DMEM, ohne b-ME oder L-Glutamin	Corning	15-016-CV
HEPES	Corning	25-060-CI
b-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
Gentamicinsulfat (50 mg/ml)	Omega Scientific	GT-50
Human-AB-Serum, männlicher Spender	Omega Scientific	HS-30
Rekombinantes humanes IL-2	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads Human-T-Aktivator CD3/CD28	Leben Technologies	11131D
Medien
Zellsortierpuffer
PBS, pH 7,4	1 L
BSA	10 g
EDTA (0,5 M)2	ml
T-Zell-Kulturmedium
Zellen DMEM von Iscove's DMEM	351,6 ml
Hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
Glutamax (100x)	4 ml
Gentamicin (50 mg/ml)	0,4 ml
b-Mercaptoethanol (14,3 M)	1,4 ml
rekombinantes humanes IL-2 (1 mg/ml)	1 ml

für humane