Methodenartikel

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

DOI:

10.3791/52259

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3. Januar 2015

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1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In-vitro-Kugel-Assays werden häufig verwendet, um Krebsstammzellen zu identifizieren. Hier vergleichen wir Einzel- mit Multizell-basierten Kugel-Assays. Die aufwendigeren einzelzellbasierten Assays oder die Methylcellulose-Supplementierung liefern genauere Ergebnisse, während mehrzellige Assays, die in flüssigem Medium durchgeführt werden, stark von der Zelldichte beeinflusst werden können.

Zusammenfassung

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Jahrelange Forschung zeigt, dass Eierstockkrebs eine heterogene Mischung von Zellen beherbergt, einschließlich einer Subpopulation von sogenannten "Krebsstammzellen" (CSCs), die für die Entstehung, Aufrechterhaltung und den Rückfall von Tumoren nach konventionellen Chemotherapien verantwortlich sind. Die Identifizierung von ovarialen CSCs ist daher ein wichtiges Ziel. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung des CSC-Potenzials in vitro ist der Kugel-Assay, bei dem Zellen unter nicht adhärenten Kulturbedingungen in einem serumfreien Medium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist, plattiert und die Kugelbildung nach einigen Tagen bewertet wird. Hier überprüfen wir die derzeit verfügbaren Protokolle für Assays von menschlichen Eierstockkrebssphären und führen eine Side-by-Side-Analyse zwischen häufig verwendeten Multizell-basierten Assays und einem genaueren System auf Basis von Einzelzell-Plating durch. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl mehrzellbasierte als auch einzelzellbasierte Kugel-Assays zur Untersuchung der Kugelbildung in vitro verwendet werden können. Die aufwendigeren und teureren einzelzellbasierten Assays eignen sich besser für die funktionelle Bewertung einzelner Zellen und führen zu insgesamt genaueren Ergebnissen, während mehrzellbasierte Assays stark von der Dichte der plattierten Zellen beeinflusst werden können und im Vorfeld Titrationsexperimente erfordern. Die Methylcellulose-Supplementierung zu multizellbasierten Assays kann effektiv eingesetzt werden, um mechanische Artefakte zu reduzieren.

Einleitung

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Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Ovarialkarzinome aus heterogenen Zellmischungen bestehen und sogenannte "Krebsstammzellen" (CSCs) beherbergen, die für die Initiierung, Aufrechterhaltung und den Rückfall nach konventionellen zytotoxischen Therapien verantwortlich sind1-3. Daher ist die Entwicklung molekularer Strategien, die auf ovarielle CSCs abzielen, ein wichtiges Ziel und verspricht, die Therapie von Patientinnen mit Eierstockkrebs zu verbessern.

Eine Voraussetzung für das Verständnis der molekularen Eigenschaften von CSCs ist ihre zuverlässige Isolierung von den Nicht-CSCs. Die Identifizierung von ovarialen CSCs scheint jedoch eine Herausforderung zu sein. Während berichtet wurde, dass die CD133-Expression und die Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH)4,5 ovarielle CSCs markieren, deuten einige Daten darauf hin, dass diese Marker instabil sind6. Konsistent ist, dass bei Eierstockkrebs, anders als beispielsweise beim Mammakarzinom7, die Expression von ALDH1 mit einem günstigen Ergebnisassoziiert 8 und die Expression der vorgeschlagenen Stammzellmarker-Variante CD44 keinen prognostischen Werthat 9. In jüngerer Zeit haben wir gezeigt, dass die Expression des embryonalen Stammzellproteins SOX2 den Eierstockkarzinomzellen Stammzellen Immunität verleiht10 und eine hohe SOX2-Expression mit klinisch aggressiven Ovarial- und Mammakarzinomen assoziiertist 11,12. Daher verwenden wir in diesem Bericht ein lentivirales Reporterkonstrukt, das ein rotes Fluoreszenzprotein (RFP) enthält, dessen Expression durch eine SOX2-regulatorische Region gesteuert wird, als Methode zur Isolierung putativer ovarieller CSCs.

Per Definition können CSCs sich sowohl selbst erneuern als auch differenzieren, wodurch alle Tumorzelltypen entstehen. Mutmaßliche CSC-Populationen müssen in funktionellen Assays analysiert werden, die in vivo durchgeführt werden. Aus offensichtlichen Gründen sind solche Funktionstests in menschlichen Zellen auf Xenotransplantat-Assays beschränkt, die hauptsächlich die Transplantation menschlicher Tumorzellen in immungeschwächte Mäuse umfassen10,13.

Eine alternative in vitro-Methode wurde von Brent Reynolds und Sam Weiss angeboten, die zuerst den sogenannten Neurosphären-Assay als Surrogat-Assay zur Bewertung des Stammpotenzials in Nervenzellen berichteten14. Dontu und Kollegen bestätigten später die Verwendung dieses Assays zur Bewertung des Stammzellpotenzials in Brustzellen15,16. Hier wurden humane Brustzellen in unterschiedlicher Anzahl in serumfreiem Medium plattiert, das mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), B-27 und Heparin ergänzt wurde, und unter nicht-adhärenten Bedingungen sieben bis zehn Tage lang kultiviert, bevor die Kugelbildung mikroskopisch bewertet wurde. Nach diesem Protokoll mit einigen Anpassungen der Zellzahl, des Wachstumsmediums und der Nahrungsergänzungsmittel haben mehrere Gruppen das Potenzial von In-vitro-Stammzellen aus verschiedenen Krebsarten wie Brust17, Gehirn18, Bauchspeicheldrüse19 und Dickdarm20 untersucht. Beim Ovarialkarzinom haben wir kürzlich über die Machbarkeit des Spheres-Assays berichtet und seine Ergebnisse mit denen verglichen, die in in vivo-Xenotransplantatmodellen von Mäusen gesammelt wurden10. Wir fanden heraus, dass die Überexpression des Stammzellproteins SOX2 sowohl die in vitro Kugelbildung als auch die in vivo Tumorigenität von humanen Ovarialkarzinomzellen erhöhte10. Die Häufigkeit von Sphären-initiierenden Zellen war jedoch höher als die Häufigkeit von tumorinitiierenden Zellen, die in vivo gemessen wurden 10, was darauf hindeutet, dass entweder der Kugel-Assay aus technischen Gründen zu falsch positiven Ergebnissen führen kann oder alternativ der in vivo-Assay ineffizient sein und zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.

In diesem Bericht analysieren wir Multizell-basierte Ovarialsphären-Assays detaillierter, überprüfen die verschiedenen in der Literatur verfügbaren Protokolle und vergleichen sie mit einem einzelzellbasierten Assay. Wir zeigen, dass der einzelzellbasierte Assay genauere und reproduzierbare Ergebnisse liefert als multizellbasierte Assays, die stark von der Dichte der plattierten Zellen beeinflusst werden können, es sei denn, den Kulturen wird Methylcellulose zugesetzt, um die Zellen zu immobilisieren. Aber auch in einzelzellbasierten Assays wird das in vitro Sphären-initiierende Potential häufiger beobachtet als in vivo das tumor-initiierende Potential.

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Protokoll

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1. Erzeugung von OVCAR-3 Human Ovarialkarzinomzellen Stabil mit Lentiviren Beinhaltet den SOX2 Regulatory Region Reporterkonstrukt Transduzierte

  1. Generieren lentivirale Partikel durch Transfizieren der HEK 293T-Verpackungszelllinie mit einem Reporter-Konstrukt Erkennen eines SOX2 regulatorische Region, wie beschrieben 10,21.
    HINWEIS: Die Reporter-Konstrukt weiterhin enthält eine Destabilisierung Domäne des ProteoTuner Schild-System vor dem tdTomato fluoreszierendes Protein. Shield1 bindet zur Destabilisierung Domäne wodurch das Proteasom, das Fluoreszenzprotein 22 abbauen zu verhindern.
  2. Transduzieren OVCAR-3-Zellen mit lentivirale Partikel über einen Zeitraum von 24 Stunden. Danach das Virusüberstand und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in komplettem Medium (RPMI, ergänzt mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin).
  3. 48 Stunden später wurden 10 ug / ml puromycin wurden zu den Kulturen zugegeben und für 5 Tage gehalten, um die Auswahl richtig transduzierten Zellen zu ermöglichen.

2. Herstellung der Zellsortierung und Oberflächen

  1. Fügen Shield1 bei 1: 1.000-Verdünnung 24 Stunden vor der Zellsortierung. Verwenden stabil transduzierten OVCAR-3-Zellen ohne Shield1 Behandlung als negative Kontrollen (Figur 1). Absaugen Medien aus Kolben, waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und trypsinieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min.
  2. Stoppen Trypsin unter Verwendung Vollmedium (siehe oben), zu zählen Zellzahlen Zentrifuge Zellen bei 300 · g bei RT (15 - 25 ° C) für 5 min.
  3. Dekantieren und resuspendieren Zellen vorsichtig in 0,5-1 ml sterilem PBS.
  4. Verwenden Sie 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten.
  5. Passen Zellzahl von 5 Millionen Zellen pro ml.
  6. Bereiten ultra low-Befestigungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 & mgr; l Kugeln Medium (MEGM ergänzt mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen,B-27, Heparin-Natrium; oder DMEM / F12 mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen, B-27, Heparin-Natrium mit oder ohne Zugabe von 1% Methylcellulose ergänzt, siehe auch Tabelle 1). Gegebenenfalls Antibiotika, hinzugefügt werden zu dem Medium in einer Konzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, um das Risiko einer möglichen Kontamination minimieren.
  7. Sortieren RFP + und RFP- Zellen in vorbereitete Platten mit 96 Vertiefungen von oben, 1 Zelle pro Vertiefung (Einzelzellbasis Kugeln Assay) und 100 Zellen pro Vertiefung (multi zellbasierten Assay Kugeln) sind. Führen Art auf handelsüblichen Zellsortierer (siehe Materialien) mit Einzelzellenmodus, Setup Sortieren: 100 μ Düse, Manteldruck 20 psi und Ertrags Maske 0, Reinheit Maske 32, Phasenmaske 16.
  8. Beurteilen Plattierungseffizienz von mikroskopisch scoring Vertiefungen mit Zellen (für die einzelnen Assays auf Zellbasis) und durch Zählen der Zellzahlen in einzelnen Vertiefungen (für die Mehr Assay auf Zellbasis, Figur 2 ).
  9. Zellen unter Standardbedingungen in Bereichen mittlerer inkubieren (Zusammensetzung siehe Schritt 2.6) bei 37 ° C und 5% CO 2. Ergänzung täglich bFGF (20 ng / ml) und EGF (20 ng / ml).
  10. Nach einer Woche zählen Anzahl von Schwellentumorsphären mit einem Standard-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung oder 4X und einem Fluoreszenzmikroskop zur Fluoreszenzsignal von der integrierten Reportersystem zu erkennen. Graf Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 um als "große" Kugeln und Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 um, wie "klein" Kugeln (Abbildung 3). Achten Sie darauf, dass Sie echte Kugeln zu zählen und Cluster nicht zell.
    HINWEIS: In einzelnen Assays auf Zellbasis Kugelbildung ist einfacher zu mikroskopisch nach 10 (Vergleich 7) Tagen Kultur erzielen.
  11. Berechnen des Anteils der Kugel bildenden Zellen in RFP + bzw. RFP- Zellen in einzelnen Assays auf Zellbasis (eine Platte mit 96 Vertiefungen für jedes einzelne Experiment) oder Mehrfachzelle-baSED Kugeln Assays (Eine Vertiefung für jedes einzelne Experiment), wie von Shaw et al. 16
    HINWEIS: Anteil der Kugel bildenden Zellen (%) = (Anzahl der Kugeln) / (Zahl der ausgesäten Zellen) × 100

3. Serien Passagieren von Kugeln

  1. Platzieren Sie den Inhalt jedes Wells in einer geeigneten sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT. Bei mehrzellbasierten Assays Kugeln, sammeln gemeinsam die Kugeln von einem gut. Mit PBS und zentrifugieren 2 Minuten mehr 5 Mal - Waschen Sie die gut 3. Für einzelne zellbasierten Assays Kugeln, sammeln einzelnen Kugeln. Aufgrund der geringen Anzahl von Zellen, verwendet 1,5 ml Röhrchen für Zentrifugation und Waschschritten.
  2. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA.
  3. Um ein optimales Zelltrennung zu erreichen, Inkubation der Zellsuspension bei 37 ° C für 5 min in einem weichen Schüttler. Optimieren Trypsinierung Zeit für Ihre Zelllinie zu niedrigeren Zellsterberate: wenn keine großenSphären sichtbar verreiben vorsichtig mit einem 100 ul Pipettenspitze. Im Fall sind große Kugeln noch vorhanden, Inkubation mit Trypsin weitere 3 min und dann dem Verreiben Schritt. Bei Einzelzellbasierte Assays stellen Sie sicher, um die Zeit für eine optimale Zellausbeute von lebenden Zellen während der Trypsinierung Schritt optimieren.
  4. Um das Trypsin zu inaktivieren, 500 & mgr; l vollständiges Medium und Zentrifugation bei 300 g für 10 min, im Falle der Einzelzellassays Zentrifuge für weitere 2 min.
  5. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen vorsichtig in Sphären Medium.
  6. Verwenden Sie eine 40 um Zellsieb Kappe Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
  7. In dem Fall der Verwendung RFP + und RFP- Zellen in Mehrzellen bassed Assays beurteilt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen in jeder Vertiefung nach Resuspendierung über Durchflusszytometer Analyse.
  8. Für serielle replating Tests von Einzelzellen, Samen 1-Zelle pro Vertiefung in eine neue Ultra-Low-Befestigung Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt, wie oben beschrieben. Von einer einzelnen Kugel, Saatgut rund 20 Einzelbecken. Für replating Tests von Multi zellbasierten Primär Kugeln, von einem gut von primären Sphären erhalten Samenzellen in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen und zählen Sie die Zellzahl am nächsten Tag durch Mikroskopie.
  9. Beurteilung der Anteil der Kugel bildenden Zellen in der Sekundärkugeln Tests unter Verwendung des in Schritt 2.11 beschriebenen Formel.

4. Ergebnis-Analyse

  1. Analysieren Ergebnisse von Experimenten in unabhängigen dreifach durchgeführt und mit zweiseitigen Student-t-Test, um normal verteilt Werte und ansonsten Mann-Whitney-Tests für die statistische Analyse zu untersuchen.

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Ergebnisse

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Bei herkömmlichen Sphären Assays fast 40% der RFP + OVCAR-3-Zellen gegenüber 20% der RFP- Zellen führte zu einer individuellen Tumorbereich in der primären Kügelchen Assay (4A). Darüber hinaus waren die Bereiche, die durch RFP + Zellen gebildet Größe als die RFP- Zellen größer ausgebildet.

Beim Betrieb in Tests auf Zellbasis überzogen, RFP + Zellen ebenfalls gebildet mehr Kugeln als RFP- Zellen bestätigt die obigen Ergebnisse. Allerdings gab es eine Tendenz zur Erzeugung von...

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Diskussion

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Spheres Kulturen sind eine weit verbreitete Methode, um zu untersuchen Krebsstammzellpotential und bereichern für stielartigen Zellen in einer breiten Palette von menschlichen Tumorzellen 15,25,26. Unter diesen Kulturbedingungen werden die Krebszellen, die Selbsterneuerung Fähigkeit fehlt voraussichtlich zu differenzieren und schließlich Zelltod. Obwohl sie zunächst bilden Zellhaufen oder auch Tumorsphären vor allem in der Grund Assays, sind sie nicht in der Lage, Kugel bildende Fähigkeit auf serielle replati...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) unterstützt, das C.L. Wir danken Dr. Martina Konantz für den kritischen Input und die Begutachtung des Manuskripts. Wir danken Emmanuel Traunecker und Toni Krebs von der DBM FACS Facility (Universitätsspital Basel) für die Unterstützung bei der FACS-Sortierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Platte mit niedrigem AufsatzCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HydrocortisonLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonza CC-4136SingleQuots&trades; Kit
EGFSigmaE9644Endkonzentration: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18BEndkonzentration: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044Endkonzentration: 1X
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02Verdünnung 1:1.000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189Verdünnung 1:1.000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (Pulver)Gibco42400-010
MethylcelluloseSigmaM0387
PuromycindihydrochloridApplichemA2856
Zelle SortiererBDAria III Zellsortierer
FACS AnalysatorBDAccuri c6 Durchflusszytometer
MikroskopOlympusIX50 Osiris

Referenzen

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