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Methodenartikel

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

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DOI:

10.3791/52296

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19. Januar 2015

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1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in Zusammenhang mit lebenden Zellen können wichtige Informationen über die Lokalisierung, Dynamik und Interaktionspartner zu erzeugen. Diese Informationen sind im Rahmen der Wirt-Pathogen-Interaktionen besonders wertvoll. Viele Erregerproteine ​​Funktion innerhalb von Wirtszellen in einer Vielzahl von Art und Weise, wie ermöglichen Umgehung des Immunsystems des Wirts und das Überleben in der intrazellulären Umgebung. Um diese Pathogen-Protein-Host-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Ansätze häufig verwendet, unter anderem: in vivo-Infektion mit einem Stamm ein markiertes oder mutierte Protein, oder Einführung von Pathogen-Gene mittels Transfektion oder Transduktion exprimieren. Jeder dieser Ansätze hat Vorteile und Nachteile. Wir suchten ein Mittel, um exogene Proteine ​​direkt in die Zellen einzuführen. Die Elektroporation wird üblicherweise verwendet, um Nukleinsäuren in Zellen einzuführen, wurde jedoch seltener auf Proteine ​​angewandt, obwohl die biophysikalischen Basis ist genau die gleiche.Ein Standard Elektroporator wurde verwendet, um affinitätsmarkierten bakterielle Effektoren in Säugetierzellen einzuführen. Humanen epithelialen und Maus-Makrophagen-Zellen wurden durch traditionelle Methoden kultiviert, freistehend, und in 0,4 cm Abstand Elektroporationsküvetten mit einem exogenen bakteriellen Erreger Protein von Interesse (zB Salmonella Typhimurium GtgE) platziert. Nach der Elektroporation (0,3 kV) und einem kurzen (4 h) Erholungsperiode wurde die intrazelluläre Protein durch Fluoreszenzmarkierung, die das Protein über seine Affinitätsmarkierung und, die räumliche und zeitliche Verteilung von konfokaler Mikroskopie verifiziert. Die elektroporierten Protein wurde auch gezeigt funktionellen innerhalb der Zelle und in der Lage, korrekte subzelluläre Handel und Protein-Protein-Wechselwirkung zu sein. Während die exogenen Proteine ​​eher auf der Oberfläche der Zellen zu akkumulieren, war die elektroporierten Proben große Erhöhungen der intrazellulären Effektors Konzentration bezogen auf allein Inkubation. Das Protokoll ist einfach und schnell genug, um in ap geschehenarallel Mode, so dass für Hochdurchsatz-Charakterisierung der Erreger Proteine ​​in Wirtszellen einschließlich subzelluläre Targeting und Funktion Virulenzproteine.

Einleitung

Viele Gram-negative Bakterien zu verwenden spezialisierte Sekretionssysteme zur Virulenz-verwandte Proteine ​​(die als Effektoren bezeichnet) direkt in die Wirtszellen 1-5 injizieren. Diese Effektoren haben eine breite Palette von biologischen Funktionen, einschließlich: Unterdrückung der Wirtsimmunität, Zytoskelett-Änderungen, Änderung der intrazellulären Transport und Signalisierung, Transkriptionsänderungen und Gastgeber Proteasom Änderungen 9.6. Die Funktionen einiger Effektoren sind bekannt, aber die Wirts Ziele und biochemische Wirkung (en) von vielen anderen noch bestimmt werden. Beim Vergleich Wildtyp und rekombinante bakterielle Infektionen ist ein gültiger Ansatz für die intrazelluläre Effektor Virulenzmechanismen studieren, ist es oft von Vorteil, ein individuelles Effektor in die Wirtszelle einzuführen. Somit ist eine einfache Verfahren zum Einbringen und zur Charakterisierung bakterieller Effektor-Proteine ​​im Rahmen von Wirtszellen sehr wünschenswert.

Die Vereinfachung des experimentellen Analyse with eine einzige Effektor ist kritisch, da andere Effektoren können gegnerische oder redundante Funktionen haben. Um diese Vereinfachung zu erreichen, haben die Forscher bereits vorgestellten Makromolekülen in Zellen durch viele verschiedene Methoden, einschließlich der Virusübertragung 10, die Mikroinjektion 11, kratzen Laden 12,13, Zellfusion mit chemisch induzierten Mikroinjektion 14, proprietären Protein "Transfektion" Reagenzien 15, Calciumphosphat Niederschläge 16, 17-20 und Elektroporation. Die eingeführten Moleküle reichen von Nukleinsäuren, einschließlich DNA, RNA, & RNAi-Spezies auf Proteine, zellundurchlässigen Farbstoffen und Antikörpern für die intrazelluläre Targets 21,22. Einige Methoden haben ihre Grenzen, einschließlich der Art von Makromolekülen, die eingeführt werden können, und insbesondere Downstream-Analysen können durch hohe Zelltoxizität, schädlichen Wirkungsmechanismen, geringe Wirksamkeit oder Einführung Effizienz beschränkt. Transfektion, eine often-Methode zur Expression bakterieller Gene in Säugerzellen, leidet auch die Einschränkung, dass einige wichtige Wirtszelltypen, wie beispielsweise Makrophagen und primäre Zellen, sind besonders resistent gegenüber der Transfektion. Darüber hinaus ist es schwierig, das Niveau der Bakterienprotein bei Einführung von Fremd-DNA hergestellt steuern.

Viel Arbeit wurde die Elektroporation von Nukleinsäuren in beiden bakteriellen und Säugerzellen als gemeinsame Labortechnik etablierten; jedoch gibt es ständige Suche nach der besten Methoden für die Bereitstellung Proteine ​​in Zellen unter physiologischen Bedingungen. Berichte über Protein Transfektion sind vielversprechend, aber teure Reagenzien und Optimierung. Der Wunsch, die potentiell toxischen Bakterien Effektoren in eine Vielzahl von Zell Ziele mit minimalen Kosten einführen führte uns zur Elektroporation als Mittel zur Untersuchung dieser Proteine ​​in vivo zu prüfen.

Protein Elektroporation 23-25 ​​ist ein eingehaltenhod, Proteine ​​in lebenden Zellen über Elektropermeabilisierung, auch als elektro-Transfektion oder elektro-Injektion 26 bekannt vor. Diese Technik verwendet hoher Intensität elektrischer Impulse an Poren in den Zellmembranen zu erstellen. Diese reversible Poren ermöglichen Makromoleküle, die normalerweise von intrazellulären Raum ausgeschlossen sind die Zelle zu gelangen. Nach dem Entfernen des äußeren elektrischen Feldes kann die Membran verschließen, so dass die Zelle auf Moleküle, die durch die Poren 27,28 geführt zu halten.

Ein Standard-Elektroporator in dieser Studie verwendet, um bakterielle Effektoren in beiden Maus Makrophagen-ähnlichen Zellen und humane Epithelzellen konsequent einzuführen. Das Verfahren ist schnell, effizient und kostengünstig ist, ohne nennenswerte Verringerung der zellulären Lebensfähigkeit. Die eingebrachten Proteine ​​durch Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar oder für funktionelle Assays verwendet werden. Dies wurde unter Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als einen nicht-toxischen Standard gezeigt, sowiezwei Salmonella-Effektor-Proteine, SspH1 und GtgE. Wir schlagen Protein Elektroporation als zusätzliches Werkzeug in der Literatur für die Untersuchung der bakteriellen Virulenz-Proteine ​​und ihre Funktionen in eukaryotischen Wirtszellen.

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Protokoll

1. Bereiten Sie im Voraus

  1. Warme sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) auf 37 ° C.
  2. Warme Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Minimal Essential Medium (MEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin und 37 ° C. Hinweis: Diese stellen das normale Wachstum Medien (NGM) für RAW und HeLa-Zellen auf.

2. Herstellung von Zellen

  1. Wachsen RAW 264.7 Zellen 70-90% Konfluenz in NGM.
    1. Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 95% Luft / 5% CO 2 Atmosphäre.
  2. Wachsen HeLa-Zellen zu 70-90% Konfluenz in NGM.
    1. Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 95% Luft / 5% CO 2 Atmosphäre.
  3. Vor der Sammlung, waschen Zellmonolayer einmal mit sterilem PBS.
  4. Sammeln vorge konfluenten Zellen in einem sterilen konischen Röhrchen.
    1. Sanft kratzen RAW-Zellenmit einem Gummischaber in PBS, mit wiederholtes Pipettieren zu Zellverbänden zu zerstreuen.
    2. Nehmen HeLa-Zellen mit 0,25% Trypsin-Lösung, bis die visuelle Untersuchung zeigt Distanzierung von Kulturoberfläche. Verwenden Sie beispielsweise 2 bis 3 ml für eine T-75-Kolben. Stellen Sie die Lautstärke entsprechend zu, um sicherzustellen, Trypsin-Lösung deckt gesamte Wachstumsoberfläche.
      1. Stillen Sie Dissoziationsreaktion mit NGM 10% FBS enthielt.
      2. Verwenden Sie mindestens zwei Mal die Lautstärke der NGM zu Trypsin, mit wiederholtes Pipettieren zu Zellverbänden zu zerstreuen.
  5. Leicht pelletisieren Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 4 min.
  6. Resuspendieren in demselben Volumen wie Trypsin / Quench-Lösung mit sterilem PBS.
  7. Zählen von Zellen mit Hämozytometer oder Partikelzähler.
  8. Leicht pelletisieren Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 4 min.
  9. Resuspendieren in ausreichenden Volumen PBS für 5,5 x 10 6 bis 6,0 × 10 6 Zellen / ml. Hinweis: Zum Beispiel wird eine T-75-Kolben approxim AusbeuteLICH 7,5 x 10 6 Zellen 29.
  10. Halten Zellsuspension auf Eis, bis die Elektroporation.

3. Vorbereitung für die Elektroporation

  1. Vorkühlung Elektroporationsküvetten (0,4 cm Abstand) auf Eis.
  2. Schalten Sie Elektroporationseinrichtung und stellen Sie die Spannung bis 0,3 kV.
    HINWEIS: Die Kapazität und Widerstand nicht veränderbaren Einstellungen auf unserer Elektroporator (bei 10 & mgr; F und 600 Ω vom Hersteller festgelegt).
  3. Füllen Erholung Platten mit NGM und äquilibrieren in befeuchteter 95% Luft / 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C

4. Die Elektroporation

  1. Platzieren 400 ul Zellsuspension in vorgekühlte Küvetten überführen und 20 ug des ausgewählten Proteins zur Küvette (50 ug / ml).
  2. Flick Küvette vorsichtig ~ 10 Mal ohne Beschädigung Zellen mischen. Hinweis: Die Küvette kann auch mehrmals umgedreht werden, um gründlich zu mischen, aber nicht auf- und abpipettieren oder Wirbel zu beschädigen Zellen.
  3. Dry außerhalb der Küvette mit einem Papiertuch oder einem anderen Wischer um elektrische Überschläge in der Elektroporator vermeiden.
  4. Elektroporieren Probe bei 0,3 kV für 1,5 bis 1,7 ms. Hinweis: Das war typisch für diese Studie.
  5. Unmittelbar nach der Elektroporation Flick Küvette vorsichtig ~ 10-mal zu durchmischen.

5. Überzug von Zellen

  1. Shop Küvette mit elektroporierten Zellen auf Eis, bis Sie sie in stabile Seitenplatten zu platzieren.
  2. Für die meisten Downstream-Analysen, waschen Sie die Zellen 1x mit vorgewärmter NGM auf fremde Effektor-Protein zu entfernen.
    1. Entfernen Zellen für die Analyse und Aussetzung in 3-5 ml NGM.
    2. Pelle Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 4 min.
    3. Resuspendieren in angemessenen Volumens NGM für gewünschte Plattengröße (zB 2 ml für 35-mm-Schale).
  3. Entfernen Sie entsprechende Menge an Zellen für nachfolgende Analyse.
    1. Beispiel 1: Platte in Glasbodenschalen für die Mikroskopie Analyse.
    2. Beispiel 2: Platte into Zellkultur-Kunststoff für die Proteinanalyse wie Affinitätsreinigungen.
  4. Sodass die Zellen im äquilibriertem Platten in befeuchteter 95% Luft / 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden zu erholen.

6. Mikroskopie Analyse

6.1) Befestigung / Immunfluoreszenzfärbungen

  1. Waschen Sie die Zellen 1x mit sterilem PBS nach 4 Stunden Erholungsphase.
  2. Fix-Zellen in 100% Methanol für 2 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie ausreichend Methanol vollständig zu bedecken Zellen (zB 2 ml für 35-mm-Schale).
  3. Jeweils 3x mit sterilem PBS.
  4. Permeabilisieren Zellen mit 0,4% Triton X-100 in PBS für 15 min. Verwenden Sie beispielsweise 1 ml für eine 35 mm Durchmesser Teller.
    1. Einzustellen Länge Permeabilisierung und Stärke von Triton X-100 nach Epitop und Lage des Zielproteins. Hinweis: Die besten Ergebnisse müssen empirisch für jedes Ziel festgelegt werden, aber die oben genannten Bedingungen sollte für die meisten c seinytosolic Ziele.
  5. Blockieren mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 h bei RT. Verwenden Sie beispielsweise 1 ml für eine 35 mm Durchmesser Teller.
  6. Jeweils 3x mit PBS.
  7. Inkubieren primären Antikörper in Antikörperbindungslösung (0,1% Triton X-100 und 1% BSA in PBS) über Nacht bei 4   ° C unter leichtem Schütteln. Verwenden Sie beispielsweise 0,5 ml für eine 35 mm Durchmesser Teller.
    1. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für die Antikörperverdünnung. Anmerkung: Beispielsweise wurde die Streptavidin-Bindungspeptid-Tag (SBP-tag) Antikörper in einer 1: 1000 Verdünnung, während die PKN1 Antikörper wurde in 1: 200-Verdünnung.
  8. Waschen Sie 4x mit PBS.
  9. Inkubieren mit entsprechenden fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörpers in Antikörper-Bindungslösung für 1 h bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
    1. Beispielsweise verwenden Alexa 488 oder Alexa 647 für 1 h bei Raumtemperatur.
      1. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für antibody Verdünnung. (Beispielsweise etwa 1: 1.000 für diese Studie).
    2. Andere Verschmutzungen wie erforderlich, beispielsweise 5 & mgr; M Wheat germ agglutinnin (WGA) Alexa 647 oder DAPI konjugiert gemäß der Empfehlung des Herstellers, für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  10. Wash 5x mit PBS und bei 4 ° C, vor Licht geschützt, bis Sie sie Bild.

6.2) Die konfokale Mikroskopie und Bildanalyse

  1. Bild Proben auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 63x Ölimmersionsobjektiv.
    1. Bild Grün-Kanal mit dem 488 nm-Linie eines Argon-Laser, mit einer Bandbreite von 492 bis 542 nm Emission zwischen.
    2. Bild Rot-Kanal mit einem 633 nm Diodenlaser, mit einer Bandbreite von 640 bis 718 nm Emission zwischen.
    3. Bild Blau-Kanal mit einem 405 nm Diodenlaser, mit einer Bandbreite von 407 bis 453 nm Emission zwischen.
    4. Sicherstellen, dass die Mehrkanal-Z-Stapel umfassen die Gesamtheit der Zellvolumen.
  2. Prozessbilder mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware.

7. Affinitätsreinigung

  1. Nach 4 Stunden Erholungsphase waschen elektroporierten Zellen zweimal mit 4 ° C PBS.
  2. Lyse mit ~ 1,0 ml Lysepuffer (1% Triton X-100 mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor in PBS) auf Eis. Verwenden Inhibitoren gemäß Herstellerangaben. Hinweis: Zum Beispiel können sowohl die Phosphatase und Protease-Inhibitoren in dieser Studie verwendet wurden 100x zugeführt wird, aber auch andere Formulierungen sollten gleich gut funktionieren.
  3. Prompt kratzen Zellen mit Gummiwischer und sammeln in konische Röhrchen.
  4. Lyse durch kräftiges Vortexen und Ultraschall. Hinweis: Andere Lyse-Verfahren kann genauso gut funktionieren, aber die Effizienz müssen empirisch über die Eignung der Testanforderungen bestimmt werden.
    1. Beschallen 3 x 30 sec mit intermittierendem Vortexen.
  5. Zentrifuge bei 10.000 g für 10 min bei 4 ° C zu sammelnZelltrümmer und unlösliche Aggregate; speichern Sie den Überstand.
  6. Kombinieren gleicher Volumina (~ 1,0 ml) von elektroporiert Zelllysats mit 50 ul Streptavidin-Agarose-Harz Suspension bei 4 ° C über Nacht mit end-over-end-Rotation. Hinweis: Dieses Harz fängt die elektroporierten Protein (und die damit verbundenen Komplexe) über seine Streptavidin-Bindungspeptid Affinitätstag.
  7. Zentrifugieren bei 2.500 g für 2 min und Überstand verwerfen.
  8. Zweimal waschen mit 40 Bettvolumen (~ 1 ml) PBS.
  9. Zugabe von 30 & mgr; l 4x LDS-Ladepuffer (141 mM Tris-Base, 2% LDS, 10% Glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blau G, 0.175 mM Phenolrot, pH 8,5), 20 ul DIH 2 O und 1 ul 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), gleichzeitig für eine gewisse Volumen in Kügelchen bleiben.
  10. Wärme bei 95 ° C für 10 Minuten und kühle auf Eis.
  11. Spin> 10,000 × g bei 4 ° C für 5 min.
  12. Sammeln Stand.
  13. Führen Sie eine Western-Blot unter Verwendung geeigneter Antikörper Hinweis: Erre, Anti-PKN1 primären Antikörper verwendet.

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Ergebnisse

Als ersten Beweis des Konzeptes wurde gereinigtes grün fluoreszierende Protein erfolgreich in Säugerzellen unter Verwendung Elektroporation eingeführt. GFP, eine ungefähre 27 kD ein Molekulargewicht Protein wird üblicherweise in Säugerzellen (in der Regel aus dem Plasmid DNA exprimiert) als Molekularbiologie Werkzeug ohne signifikante zelluläre Toxizität eingeführt. HeLa-Zellen wurden inkubiert (Figur 1A) oder durch Elektroporation (1B) mit 25 ug / ml GFP, gefolgt von Immunfluoreszenz k...

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Diskussion

Sezerniert Effektoren aus pathogenen Bakterien entwickelt haben, um innerhalb des Wirtszellenumgebung funktionieren und somit ist es hilfreich, sie in situ in dem Wirt zu detektieren. Einführung spezifischer Effektoren von Interesse in die Wirtszellen können die relevanten Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen, in Isolation, ohne Störung von anderen bakteriellen Proteinen untersucht werden. Das Ziel war es, die Elektroporation als Mittel zur bakteriellen Effektorproteine ​​in eukaryotische Wirtszellen einzubringen, wo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Bedeutende Teile dieser Arbeit wurden im Environmental Molecular Sciences Laboratory durchgeführt, einer nationalen wissenschaftlichen Nutzereinrichtung des DOE/BER, die sich am Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) befindet. PNNL wird für das DOE von Battelle unter dem Vertrag DE-AC05-76RLO1830 betrieben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTA-LösungCellgro25-050-Cl
0,4 cm Spalt-Einweg-ElektroporationsküvettenBio-Rad165-2088
100 % MethanolBeliebigN/AEntzündliches, giftiges
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA4919
Zellzählgerät - Hämozytometer oder ScharzählerBeckman CoulterModell Z1
Zellkultur-InkubatorBeliebig/ABefeuchtet 95 % Luft/5 % CO2 Atmosphäre bei 37 &/Grad; C 
Zellkultur-KunststoffBeliebigN/AZellkulturflaschen/-platten, Pipetten, Röhrchen, Gummipolizist
Dulbecco's Modifikation von Eagle' s Medium (DMEM)Cellgro10-013Warm auf 37 ° C C 
ElektroporatorBio-RadE. coli Pulser
Fötales Rinderserum (FBS)Cellgro35-016-CV
Konfokales Fluoreszenzmikroskop ZiessModel  LSM 710 
Glasbodenschalen für die MikroskopieWilco WellsHBSt-3522
HALT Proteaseinhibitor CocktailPierce78430Korrosive, toxische
HeLa-ZelllinieATCCATCC CCL-2
LDS 4X LadepufferInvitrogenNP0007
Minimal Essential Medium (MEM) Cellgro10-010Warm auf 37 °C C 
Andere Fluoreszenzfärbungen (WGA, DAPI) in Verbindung mit Anti-Fade-ReagenzBeliebigerN/A
Penicillin/StreptomycinCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 ZelllinieATCCTIB-71
Primärer Antikörper gegen das gewünschte ZielBeliebigerN/A
Sekundärer Antikörper, konjugiert an FluorophorbeliebigerN/A
Phosphatgepufferte KochsalzlösungbeliebigN/AKälte auf 4 ° C 
Sterile phosphatgepufferte KochsalzlösungbeliebigN/Awarm auf 37 & Grad; C 
[header]
Streptavidin Agarose Harz Suspension Pierce20353
Tischzentrifuge, die konische Röhrchen aufnehmen kann (Schwingeimer bevorzugt)AlleN/A
TCEPSigma-Aldrich 646547Korrosiv, giftig
Triton X-100Sigma-AldrichT8585Reizend, giftig
N

Referenzen

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ProteineinführungKonfokalmikroskopieWestern BlotWirt-Pathogen-Interaktionensubzelluläre LokalisationProtein-Protein-InteraktionHigh-Throughput-Screening
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