Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung lebender Zellen und zur Primärkultur von myogenen und Fibroblasten-Zelllinien aus Muskel- oder Hautgewebe. Auch eine Technik zur Immortalisierung dieser Zelllinien wird beschrieben. Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Zusammenfassung

Die Erzeugung patientenspezifischer Zelllinien stellt ein unschätzbares Werkzeug für die diagnostische oder translationale Forschung dar, und diese Zellen können aus Haut- oder Muskelbiopsiegewebe entnommen werden, das während der diagnostischen Abklärung des Patienten verfügbar ist. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Isolierung lebender Zellen aus kleinen Mengen von Muskel- oder Hautgewebe für die primäre Zellkultur. Darüber hinaus bieten wir eine Technik zur Immortalisierung von myogenen Zelllinien und Fibroblastenzelllinien aus Primärzellen an. Sobald die Zelllinien immortalisiert sind, kann eine erhebliche Expansion der vom Patienten stammenden Zellen erreicht werden. Immortalisierte Zellen sind für viele nachgelagerte Anwendungen geeignet, einschließlich Wirkstoffscreening und In-vitro-Korrektur der genetischen Mutation. Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Einleitung

Die molekulare Diagnostik hat sich in den letzten 20 Jahren dramatisch weiterentwickelt. Genomische DNA wird heute routinemäßig aus Sputum oder Wangenabstrich isoliert, während in der Vergangenheit eine Blutabnahme erforderlich war. Mit der derzeit schnellen Durchlaufzeit und der einfachen Gensequenzierung werden viele Krankheitsmutationen routinemäßig identifiziert, ohne dass zusätzliche Tests erforderlich sind. Bei der Diagnostik von Muskelerkrankungen hat die Identifizierung von Dutzenden neuer Gene in den letzten zehn Jahren, die entweder für Muskeldystrophie oder Myopathie verantwortlich sind, die Art und Weise, wie diese Krankheiten diagnostiziert werden, dramatisch verändert ^1,2. Derzeit gibt es Dutzende von Genen, die als Ursachen für Muskeldystrophie und angeborene Myopathie identifiziert wurden, obwohl die Mechanismen, durch die viele dieser Gene Krankheiten hervorrufen, unklar bleiben. Insbesondere seltene Erkrankungen stellen aufgrund der geringen Größe der Patientenpopulationen eine Herausforderung dar. Für diese Fälle sowie für häufigere Krankheiten ist die Entwicklung stabiler Instrumente, die Studien über den Mechanismus der Pathogenese und das Screening von therapeutischen Arzneimitteln erleichtern, sehr wünschenswert.

Trotz dramatischer Fortschritte in der DNA-Diagnostik werden bei vielen Patienten, bei denen der Verdacht auf eine primäre Stoffwechsel- oder Muskelerkrankung besteht, immer noch Muskelbiopsien durchgeführt, um die Primärdiagnose zu stellen. Wenn eine Muskelbiopsie notwendig ist, bietet sie die Möglichkeit einer zusätzlichen diagnostischen und Forschungsgewebeentnahme mit minimalem zusätzlichem Morbiditätsrisiko für den Patienten. Da es für jede Gewebeprobe eine Reihe von Anwendungen gibt, ist es äußerst wünschenswert, Techniken für die primäre Zellkultur unter Verwendung von chirurgischem Gewebe zu etablieren, die unkompliziert und effizient sind und minimale Mengen an Gewebe erfordern. Eine ordnungsgemäße Triage von Muskel- oder Hautbiopsien ist erforderlich, um die Isolierung der Primärzellen aus dem Gewebe und die langfristige Lagerung von lebendem Material zu maximieren. Darüber hinaus sind die Stammzellforschung und das Wirkstoffscreening vielversprechend für die Entwicklung von Therapien für viele Krankheiten mit zellbasierten Assays ^3,4.

Wir beschreiben hier Methoden zur primären Zellisolierung aus menschlichen Muskel- oder Hautbiopsien. Darüber hinaus fügen wir ein Protokoll zur Immortalisierung myogener Zellen hinzu, das nützlich ist, um eine große Anzahl von Zellen aus einem Individuum zu erzeugen. Diese Zellen können für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, wie z. B. kundenspezifische Wirkstoffscreenings, die sonst mit der insgesamt geringen Anzahl von Zellen, die aus Primärgewebe gewonnen werden, nicht erreichbar wären.

Protokoll

HINWEIS: Protokolle für die Sammlung von menschlichem Gewebe muss überprüft und von der Institutional IRB Ausschuss genehmigt werden. Sammlung von verworfen, de-identifizierte menschliche Gewebe wurde von der Boston-Kinderklinik und Brigham and Womens Hospital IRB Ausschüsse zugelassen. Die nachfolgend beschriebenen Methoden zur Isolierung von myogenen Zellen aus deidentifiziert angewendet wurde, verworfen Gewebe. Die beschriebenen Verfahren sind für Gewebe von Patienten zugestimmt Material gesammelt.

1. Zellisolation

1. Die Dissoziation von Muskelbiopsie und Reinigung von myogenen Zellen
   1. Pre-wiegen 10 cm Gewebekulturplatte in einer Gewebekultur Biosicherheit Haube und dann erneut wiegen die Platte, die die Muskelbiopsie, die Menge an Gewebe zu berechnen, getrennt werden.
   2. Mit einer sterilen Skalpellen, Hackfleisch Muskelgewebe fein und fügen Sie ein paar Tropfen sterile 1x HBSS, um Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern.
   3. Jeweils Di 3,5 mlspase II und Collagenase D pro Gramm Muskelgewebe verdaut werden. Pipettieren des zerkleinerten Gewebes und Enzymlösung durch ein steriles 25 ml-Pipette ein paar mal. Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 15 min und zu verdauen Gewebe, bis die Aufschlämmung leicht wenn eine sterile 5 ml-Pipette durchläuft.
      HINWEIS: Gewebedissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Bitte lesen Sie den Abschnitt 'Repräsentative Ergebnisse "für weitere Informationen.
   4. Hinzufügen von 2 Volumina sterilem Wachstumsmedium dissoziierten Gewebe, filtriert über ein 100 & mgr; m Zellsieb über eine 50 ml konischen Röhrchen und Pellets Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) bei Raumtemperatur. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   5. Das Pellet in 1 Volumen sterilen Wachstumsmedium und fügen 7 Volumen der roten Blutkörperchen Lyselösung. Filtern der Lösung durch ein 40 & mgr; m Zellsieb dann pelle ter Zellen für 10 min bei 329 × g, Raumtemperatur.
   6. Zählen der Zellen in einem Hämozytometer und Resuspendieren der Zellen in HBSS 1x 0,5% BSA in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / 100 & mgr; l. Beiseite ~ 250.000 Zellen in einem einzigen Rohr, das als negative (ungefärbten) Steuerung verwendet wird. Beiseite zusätzliche einfarbigen gefärbt Kontrollröhrchen für Propidiumiodid und CD56, die für die ordnungsgemäße Anspritzung von CD56-positiven Zellen durch FACS-Sortierung erforderlich. Bitte beachten Sie die Sortierung Handbücher Zelle oder wenden Sie sich mit FACS-Sortierung Core Facility Experten zu entsprechenden Kontrollen zu gewährleisten enthalten sind.
   7. Färben sich die Zellen mit 5 & mgr; / 10 ⁶ Zellen von anti CD56 Antikörper sortiert werden. Alle Proben (einschließlich Kontrollen) auf Eis inkubieren für 30 Minuten.
   8. Waschproben in 10 ml 1x HBSS und Pellet-Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) in einer Kühlzentrifuge bei 4 ° C Temperatur.
   9. Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml zu der Probe zu sein sorten für den Ausschluss von toten Zellen. Reinige myogenen CD56-positiven Zellen aus nicht-myogenen Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer.
2. Die Dissoziation von Hautbiopsie
   HINWEIS: Die dermale Fibroblasten aus einer Hautstanze von Patienten isoliert werden, wenn Muskelbiopsien sind nicht verfügbar. Hautfibroblasten als Biomaterial für viele Studien, einschließlich der Transduktion mit MyoD zu myogenen Zellen zu erzeugen genutzt werden. Zusätzlich können dermale Fibroblasten verwendet, um iPS-Zellen, die in verschiedenen Zelltypen, für die weitere Untersuchung unterschieden werden können erzeugen.
   1. Transportieren Sie die Hautbiopsie an das Labor in Transportmedium. Sobald die Probe empfangen wird, führen die primäre Kultur so schnell wie möglich. Wenn die primäre Kultur nicht am selben Tag ermittelt werden, speichern die Probe bei Raumtemperatur über Nacht.
   2. Übertragen der Hautprobe auf eine sterile 35 mm Petrischale in der Sterilbank.
   3. Spülen Sie die Hautbiopsie in einer Petrischale mit steriler 1x PBS, Blut und Trümmer zu entfernen. Entfernen Sie das Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell.
   4. 2 ml Kollagenase-Lösung und zerkleinern das Gewebe mit Skalpell, Inkubation bei 37 ° C für 45 min bis 1 h, je nach der Größe des Gewebes.
   5. Übertragen Sie die verdaute Gewebe zu einem 15 ml konischen Röhrchen, spülen Sie die Petrischale mit 2 ml Fibroblasten-Kulturmedium zweimal, und sammeln Sie das Medium in der gleichen Röhre.
   6. Pelle Zellen bei 200 g für 5 min bei Raumtemperatur.
   7. Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 3 ml Fibroblastenmedium, um die Kollagenase wieder zu entfernen, dann Pellet-Zellen. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   8. Wiederholen Sie den Schritt 1.2.7 noch einmal.
   9. Re-suspend das Pellet in 5 ml Medium Fibroblasten und Plattenzellen auf einen T25 sterile Gewebekulturflasche. Der Kolben wird bei 37 ° C mit 5% CO ₂ inkubiert.
   10. Bewerten Sie die Kultur für Fibroblasten-Anhaftung und das Wachstum in den nächsten 1-3 Tagen.
       Hinweis: Einige kleine Gewebestücke können auch auf den Teller legen und Fibroblasten Migration von diesen Gewebestücken.
   11. Aufrechterhaltung der Kultur unter den gleichen Bedingungen bis Fibroblasten auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet.
   12. Sammeln Fibroblasten durch Trypsinisierung und Transfer auf frische Kulturflaschen für weitere Expansion. Führen Trypsinierung entfernt, indem die Kulturen 3-mal in 1x PBS frei von Ca ⁺⁺ und Mg ^++. Hinzufügen Trypsin-EDTA (siehe Materialien Table) zu den Zellen (2 ml / T25-Kolben) für 2 min bei 37 ° C.
   13. Split abgelösten Zellen in zusätzliche Kolben. Wenn einige Gewebestücke bleiben an der ursprünglichen T25-Kolben angebracht ist, mit 5 ml frischem Kulturmedium, um diesen Kolben und Fibroblasten erfolgt kontinuierlich zu migrieren.
       HINWEIS: Der expandierte Fibroblastenkultur setzt sich wie P1 eingefroren und in flüssigem Stickstoff für zukünftige Experimente gelagert werden.

2. Immortalisierung von myogenen Zellen

1. Platte 5 Millionen Phoenix ecotropen Verpackungszellen (PE) über Nacht in einer 10 cm sterile Gewebekulturplatte in DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, mit 10% Kälberserum ergänzt.
2. Futterzellen 30 min vor der Transfektion mit 5 ml frischem Medium mit 10 mM Koffein ergänzt.
3. Homogenisieren einer Mischung von 2 ug Plasmid-DNA aus einem Midi prep (CDK4 oder hTERT-Plasmid) und Polyjet und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min, wie vom Hersteller empfohlen.
4. Fügen Sie das Plasmid / PolyJet Mischung auf die PE-Zellen über Nacht.
5. Feed-Zellen mit frischem Medium (DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, das mit 10% Kälberserum). Zwölf Stunden später sammeln das virushaltige Überstand und filtern sie durch ein 0,45 um Porengrße-Filter.
6. Verwenden von 1 ml Überstand gesammelt, über Nacht amphotropen Verpackungszelllinie PA317 ⁵ infizieren und zu einem stabilen Virus-produzierenden Zelllinie nach der Selektion mit entweder 0,5 mg / ml Neomycin (G418) für CDK4 oder 0,5 mg / ml Hygromycin hTERT.
7. Bereiten Sie Arbeits viralen Überständen durch Wachstum der stabilen Verpackungszellen in der Nähe der Konfluenz, dann die Ernte der Überstand jeden Morgen, Abend und Morgen für drei Ernten.
8. Filtern Sie die Virusüberständen und entweder direkt verwenden oder teilen sie in 1 ml Aliquots und bei -80 ° C für die spätere Verwendung. Beachten Sie, dass Virusüberstand verliert 50% Infektionseffizienz bei jedem Frost-Tau. Denken Sie daran, die Bleichmittel waschen vor dem Wegwerfen alles, was der Viruspartikel berührt hat.
   HINWEIS: Die stabile PA317 Virus-produzierende Zelllinie kann eingefroren und bei -150 ° C für die dauerhafte Speicherung beibehalten werden (Einfriermedium 10% DMSO, 90% Serum).
9. Platte FACS-gereinigte myogenen Zellen in einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine beschichtet (in Schritten 1.1-1.9 beschrieben). Sicherzustellen, dass die Zellen an der Platte vor der Virusinfektion hend angebracht.
10. Fügen Sie 400 ul gefiltert, freshly produzierte Virusüberstand oder gefrorenen Aliquots zu jedem Sechs-Well-Platte über Nacht (halten 2 Brunnen als Kontrollen).
11. Ändern Medium durch Zuführen Zellen mit 2,5 ml / Vertiefung frisches Muskelmedien (4: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199 mit 15% fötalem Rinderserum, 0,02 M HEPES-Puffer, 1,4 mg / l Vitamin B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l Dexamethason, 2,5 ug / l Hepatozytenwachstumsfaktor und 10 ug / l basic fibroblast growth factor). Entsorgen Sie die Medien und Pipetten, die die Viruspartikel in einem Bleichbehälter. Lassen Zellen im gleichen Medium für 3 Tage, um vor Infektionen zu erholen, dann behandeln Sie zur Auswahl entweder mit 400 ug / ml Neomycin (CDK4 Infektion) oder 300 ug / ml Hygromycin (hTERT-Infektion).
12. Pflegen Zellen unter Medikamentenauswahl, bis die Zellen in der Kontrollschale Matrize (1-2 Wochen).
13. Passage-Zellen bevor sie konfluent werden (60-80% Konfluenz, unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA), selbst während der selectinach Zeitraum. Ausstrich Zellen in mehreren 10cm Gerichte mit frischen Myoblasten-Medium (wie in 2.11 beschrieben) mit der Auswahl Medikament ergänzt. Pflegen immortalisierten ausgewählte Zellen als heterogene Population oder klonieren, um eine vollständig homogene genetischen Hintergrund (das gleiche Insertion des Transgens in jeder Zelle) zu erhalten.
14. Führen klonalen Selektion mit den folgenden Schritten:
    1. Samen der Zellen bei niedriger Dichte (zB 300 bis 500 Zellen in 10 cm-Schalen) und halten sie für etwa zwei Wochen, bis kleine Kolonien werden (10-20 Zellen) gebildet.
    2. Verringert sich die Medium an dieser Stelle, so dass nur eine dünne Folie, die Zellen nicht austrocknen.
    3. Legen Sie ein Klonen Ring (mit einem Ende eingetaucht in Silikonvakuumfett) über jeden gewünschten Klon und ein paar Tropfen von Trypsin / EDTA.
    4. Ernten Sie die Zellen, wenn sie geworden durch vorsichtiges Absaugen der Zellen unter Verwendung einer 1 ml Spitze oder eine Pasteur-Pipette und ihre Übertragung auf dem kleinsten verfügbaren Multiwell-pla abgerundette (96 oder 48, 24 oder 12-Well-Platten).
    5. Erweitern Klone wie notwendig, um lokale Konfluenz zu verhindern.

Ergebnisse

1 zeigt einige der Hauptschritte in der Primär Gewebedissoziation beteiligt: ​​die genaue Menge an Gewebe in einem sterilen Gewebekulturpetrischale eingewogen (1A, B). Das Gewebe wird dann fein zerkleinert unter Verwendung von sterilen Skalpellen, bis eine Gewebe Aufschlämmung erhalten (1C, D). Nach der Zugabe der Verdauungsenzyme, primäre Muskelgewebe Dissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Das Fortschreiten der G...

Diskussion

Cells als Nützliche Ressource

Die Isolierung und Kultivierung von myogene Zellpopulationen ist äußerst nützlich bei der Festlegung Krankheitsphänotypen oder in vitro-Modelle von Erkrankungen. Die hier beschriebene myogenen Zellisolierungsverfahren erlaubt die Isolierung von Myoblasten und Fibroblasten aus der Skelettmuskulatur Proben, die dann weitergegeben werden können, unterschieden, oder sofort analysiert. Myoblasten Struktur und Funktion kann durch mikroskopische Untersuchung A...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
Gewebe  Biosicherheitshaube für Kultur	Baker Company, Inc.	Modell SterilGuard Hood
Tischzentrifuge, wie z. B. Beckman Model	Beckman Coulter	Modell Allegra 6R	Wenn eine Zellsortierung durchgeführt wird, wird eine Zentrifuge mit Kühlung bevorzugt
Mikroskop	Nikon	Modell Eclipse TS100
Gewebekultur-Inkubator, angeschlossen an eine CO2 Quelle	Forma Scientific	Serie II
Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS)	Becton Dickinson	Modell Aria
Reagenzien für die Isolierung von primären Myoblasten aus Gewebe
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Bereiten Sie eine Sockenlösung von 2,4 U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml
1x steriler Strang vor s Ausgewogene Kochsalzlösung (HBSS), kalzium- und magnesiumfrei	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Rinderserumalbumin, Fraktion V	Sigma	#05470	Bereiten Sie eine sterile  Lösung von 1X HBSS 0,5% BSA für die FACS-Sortierung vor
Steriles Wachstumsmedium für Myoblasten: Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt (4,5 g), ergänzt mit 30 % fötalem Rinderserum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Enthält L-Glutamin
RBC-Lyselösung	Qiagen	158904
Propidiumiodid Stamm 10 mg/ml	Sigma	P4170	Bereiten Sie die Stammlösung vor, indem Sie das Pulver in sterilem destilliertem Wasser verdünnen
Anti-Human-CD56-Antikörper für die Durchflusszytometrie	Biolegend	318310	APC-konjugierter Antikörper, andere Markierungen sind verfügbar
Reagenzien für die Immortalisierung von primären Myoblasten
Ökotrope Verpackungszelllinie PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotrope Verpackungszelllinie PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Schweinehautgelatine	Sigma	G1890-500g	Bereiten Sie eine Stammlösung aus 0,1 % Gelatine in Wasser vor. Bestreichen Sie die Schale mit der Lösung bei 37°; C für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie Medium hinzu.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051 pBabe-Plasmide,
die mCDK4 und hTERT enthalten,	nicht kommerziell erhältlich		Stadler et al., 2013
Qiagen Plasmid Midiprep Kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Mittel 199 (31150022)
Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast Wachstumsmedium: 4:1 Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum; 0,02 M HEPES-Puffer; 1,4 mg/l Vitamin B12; 0,03 mg/l ZnSO4, 0,055 mg/l Dexamethason, 2,5 μm; g/L Hepatozyten-Wachstumsfaktor und 10 μ g/L Beta-Fibroblasten-Wachstumsfaktor.	Lebenstechnologie (DMEM, F199); Atlanta Biologisch (FBS); Invitrogen (Hepes); Fischer (Zinksulfat); Sigma (Vitamin B12, Dexamethason); Chemicon international (HGF); Biopionier (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Bereiten Sie das Medium und die Stammlösung Vit. B12 (20 mg/ml) vor; ZinkSulfat (60&Mikro; g/ml); Dex (55&Mikro; g/µ L) Separat für eine einfachere Handhabung. HGF-Stammlösung (5µ g/ml) und FGF (20µ g/ml) sollte jede Woche frisch in der endgültigen Arbeitskonzentration zugegeben werden.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin-Schwerketten-Antikörper für die Immunfärbung	Entwicklungshybridoma Bank	MF20	Klon MF20
Desmin Antikörper für die Immunfärbung	Thermo Scientific	MS-376-S0	Klon D33
Pferdeserum	Invitrogen	26050-088
Reagenzien für die Isolierung von primären Fibroblasten
Transportmedium: RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 0,2 % Penicillin/Streptomycin	RPMI-Medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Primäres Fibroblasten-Kulturmedium für den Menschen: RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin	Fötales Rinderserum: Thermo Scientific	SH30071.03
Kollagenaselösung: Kollagenase Typ 2 (100 mg), resuspendiert in 12,5 ml Fibroblasten-Kulturmedium und filtersterilisiert	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) Calcium- und Magnesiumfrei	Lonza	17-516F
Materialien für die Isolierung von primären Myoblasten
50 ml und 15 ml sterile konische Röhrchen	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile Skalpelle	Aspen Surgical	372610
Hämozytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5-, 10- und 25-ml-Pipetten	Bellco-Glas	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)	Wiederverwendbare Pipetten werden vor Gebrauch gewaschen, mit Watte verschlossen und autoklaviert
Sterile, mit Gewebekulturen behandelte Kunststoffschalen (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile Zellsiebe aus Nylon (100 & Mikro; M und 40 &Micro; m Größe)	BD Falcon	352340 (40&Mikro; m); 352360 (100&Mikro; m)
Materialien für die Immortalisierung
Steril 0,45 &Mikro; m Filter	Millipore	SLHV013SL
Klonringe	Corning	#3166-8	Vor und nach dem Gebrauch zu reinigen und zu autoklavieren
Materialien für Fibroblasten-Zelllinien
Sterile 35 mm Gewebekultur-behandelte Kunststoffschalen	Greiner bio-one	628160
Sterile Skalpelle	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 Gewebekulturflaschen	Techno Plastic Product, TPP	90026	in den USA von MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010