Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Summary

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Abstract

Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) verwendet wird, um eine konzentrierte Population von Einzelzellen oder präzise anatomische Regionen von Gewebe aus Gewebeabschnitte auf einem Objektträger zu isolieren. Wenn mit Immunhistochemie kombiniert, LCM verwendet, um einzelne Zelltypen, basierend auf einem spezifischen Proteinmarker isolieren. Hier wird das LCM-Technik zum Sammeln einer spezifischen Population von Dopamin-Neuronen direkt mit Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie und zur Isolierung des Dopaminneurons Bereich des ventralen tegmentalen Bereich mittels indirekter Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie auf einem Abschnitt benachbart zu den für LCM verwendet enthaltenden markierten beschrieben. Ein Infrarot (IR) Lasererfassung wird sowohl verwendet sezieren einzelnen Neuronen sowie die ventrale Tegmentum aus Glasobjektträger und auf eine LCM Kappe für die Analyse. Vollständige Dehydratisierung des Gewebes mit 100% Ethanol und Xylol, ist kritisch. Die Kombination aus dem IR Erfassungslaser und der ultravioletten (UV) cutting Laser verwendet, um einzelne Dopamin-Neuronen oder die ventralen Haubengebiet bei der Verwendung von PEN-Membran gleitet isolieren. Ein PEN Membran Schieber signifikante Vorteile gegenüber einem Glasträger, wie sie bessere Konsistenz in Erfassen und Sammeln von Zellen, schneller sammeln große Gewebestücke, weniger abhängig von Dehydratisierung und führt zu einer vollständigen Entfernung des Gewebes aus der Folie. Obwohl die Entfernung von großen Flächen von Gewebe aus einem Glasobjektträger möglich ist, ist es wesentlich zeitaufwendig und häufig lässt etwas Restgewebe hinter. Hier gezeigten Daten zeigen, dass RNA in ausreichender Menge und Qualität lassen sich mit diesen Verfahren für die quantitative PCR-Messungen gewonnen werden. Obwohl RNA und DNA sind die am häufigsten isolierten Moleküle von Gewebe und Zellen mit LCM, Isolierung und Messung von Mikro-RNA, Proteine ​​und epigenetische Veränderungen in der DNA gesammelt kann auch von der verbesserten anatomischen und zellulärer Auflösung profitieren unter Verwendung von LCM.

Introduction

Alle Gewebe aus einem heterozygoten Population von Zellen. Dies ist für die Gehirngewebe besonders relevant, die aus verschiedenen morphologisch und / oder neurochemisch unterschiedlichen Neuronen durch verschiedene Arten von Gliazellen (Oligodendrocyten, Mikroglia und Astrozyten) umgeben ist. Zusätzlich unterschiedliche Bereiche im Gehirn, wie beispielsweise Teile des Kortex oder Hirnstammkernen haben spezifische Funktionen. Daher ist die Möglichkeit, bestimmte Zellpopulationen oder sehr kleine anatomisch verschiedene Bereiche zu isolieren, wenn sie mit Analysetechniken (dh Q-PCR, Microarrays, RNA-Sequenzierung und Proteomics) kombiniert wird, kann deutlich Verbesserung des Verständnisses der verschiedenen biologischen Prozessen. LCM ist eine Technik, die Fähigkeit, sehr diskreten anatomischen Bereiche oder spezifischen Zellen von Gewebe auf einem Objektträger die eine viel homogenere Quelle für die weitere Analyse verschiedener Moleküle, wie RNA, MikroRNA, DNA und Proteine ​​zu isolieren, bietet.

t "> Da LCM zuerst eingeführt wurde, wurden verschiedene Ansätze verwendet worden, um Zellen aus Gewebe ^1-3 microdissect. Die frühesten Ansätze beinhalteten die direkte Befestigung von Gewebe auf einem Objektträger unter Verwendung eines Infrarot (IR) -Laser und einen thermoplastischen Film und einem nicht- Kontaktverfahren unter Verwendung eines Ultraviolett (UV) Laserschneiden, eine Zelle oder ein Gewebe und Sammlung in ein Rohr zu lösen. Anschließend LCM wurde erfolgreich auf eine Vielzahl von Geweben und Zelltypen verwendet, und es wurde gezeigt mit Isolierung verschiedener Moleküle für nachgeschaltete Analyse kompatibel ist einschließlich RNA, MikroRNA, DNA und Proteine, einschließlich enzymatischer Aktivität ^1,4-7. Hier wird unter Verwendung des LCM ein LCM-System, die eine Schneid UV-Laser und einen Fang IR Laser zum Schneiden um Zellen oder Gewebe und Anhängen an eine nutzt nachgewiesen LCM Kappe verbunden. verwendet diese LCM Systems sowohl die IR Erfassungslaser, einen Kunststofffilm auf einer Kappe über die Zelle oder das Gewebe von Interesse, dass die Zellen an der Kunststofffolie befestigt und entfernt sie aus t schmelzener Gewebes mit der Entfernung der Kappe (1). Zusätzlich kann in Verbindung mit dem IR-Laser, ein UV-Laser ist, um ausgeschnittene Gewebe oder Zellen von Interesse von Gewebe auf Objektträgern mit einer Membran anschließend durch Befestigen des Gewebes auf die LCM Kappe unter Verwendung der IR-Laser (2) isoliert angeordnet ist. Ein kurzer Überblick über diese Techniken wird in den 1 und 2 gefunden.

Mehrere Variationen dieser Technik werden beschrieben, um entweder Isolieren spezifischer Zellen mittels direkter Fluoreszenz-Immunhistochemie und eine indirekte Immunhistochemie geführte Technik, die für die Isolierung von einem Bereich des Gewebes basierend auf der Expression eines bestimmten Proteins verwendet wird. Insbesondere wird die Isolierung von Dopamin-Neuronen der Substantia nigra und Isolierung des ventralen tegmentalen Bereich und die anschließende Isolierung von RNA aus frischem, gefrorenen Gehirngewebe gezeigt. RNA ist die labile Moleküle gemessen (im Vergleich zu DNA oder Protein), steps zur Erhaltung der Integrität der RNA enthalten sind und Daten über die Menge und die Qualität der RNA erhalten angezeigt.

Protocol

HINWEIS: Hirngewebe von Mäusen wurde in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren verwendet und Studienprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss bei der Mississippi State University zugelassen.

1. Herstellung der Folien und Gewebe

1. Verwenden Sie entweder Silan-Prep-Dias oder Polyethylennaphthalat (PEN) Membranglasobjektträger.
2. Für die RNA-Isolierung, Tauch Folien in RNase Dekontaminationslösung, 3 x waschen mit RNase-freiem Wasser dann entwässern mit einer abgestuften Reihe von RNase-freies Ethanol und Vakuumtrocken 30 min.
3. Schneiden Gewebeschnitte bei 10 & mgr; m Dicke mit Hilfe eines Kryostaten und montieren Sie auf die vorbereiteten RNase frei gleitet. Halten Sie die Abschnitte eingefroren während des Schneidens zu RNA Qualität zu erhalten.
   HINWEIS: Sicherstellen, dass das Gewebe etwa 4 mm von den Kanten der Folie als LCM kann Gewebe, das zu nahe an den Rändern des Schlittens nicht entfernen. In order, um Gewebe aus einem PEN-Membran Rutsche zu entfernen, damit das Gewebe 4 mm von der linken, oberen und unteren, und 7 mm von der rechten Seite des Schiebers, die die Abmessungen der Membran, der nicht an dem Schlitten angebracht ist, sind.
4. Zur Isolierung einzelner Zellpopulationen mit Gleich Immunhistochemie Abschnitt Gewebe entweder auf den Silan-Prep-Dias oder PEN-Membran-Folien. Für die Isolierung von Gewebebereiche mittels indirekter Immunhistochemie geführt Techniken Halterung einen Satz von Abschnitten auf einer Silan-prep Rutsche für Immunhistochemie und abwechselnde Abschnitte entweder auf einer PEN Membran Schieber und / oder ein Silan-prep Schieber für LCM verwendet werden.

2. Gewebepräparation für Laser Capture - Schnelle Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie für Direkt Laser Capture von immunreaktiven Zellen

1. Skizzieren Sie Gewebe mit einer hydrophoben Stift und trocknen lassen.
2. Fix Gewebe in Aceton-Methanol (1: 1) -Lösung bei -20 ° C für 10 min.
   HINWEIS: Our die Erfahrung hat gezeigt, daß die Aceton-Methanol-Fixierung resultiert in viel konsistenter Immunohistochemie als Aceton oder Methanol allein.
3. Rinse Folie in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 1% Triton (RNase frei).
4. Deckelabschnitte mit 100-200 ul PBS mit 1% Triton mit Tyrosinhydroxylase-Antikörper, verdünnt 1: 100 mit 400 U / ml RNasin. Inkubieren Sie für 5-10 min.
5. Kurz in PBS spülen zweimal und PBS-1% Triton.
6. Bedeckung Gewebes mit 100-200 ul Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG mit Alexa Fluor 488, verdünnt 1 markiert: 100 in PBS-1% Triton mit 400 U / ml RNasin und 50 ng / ml DAPI. Inkubation für 5 min.
7. Spülen 2 mal mit PBS dann dehydratisieren 30 s in einer abgestuften Reihe von RNase-freiem Ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
8. Inkubiere in zwei Waschungen Xylol für 1 min, dann 5 min.
9. Folien aus Xylol Entfernen unmittelbar vor der für LCM verwenden und an der Luft trocknen.

3. Gewebepräparation für Laser Capture - TyrosinHydroxylase Immunhistochemie für indirekte Laser Capture von immunreaktiven Regionen

1. Prozess eine Folie mit Abschnitten angrenzend an Abschnitte auf Silan-prep und / oder PEN-Membran-Folien für die Immunhistochemie montiert.
   HINWEIS: Die Verfahren werden dabei ähnlich wie die früher beschriebenen ^5. Für die Demonstration Bildern wurde das Diaminobenzidin (DAB) Chromagen-Reaktion verwendet, um die Tyrosin-Hydroxylase-Neuronen von Interesse zu visualisieren.
2. Für Folien für LCM verwendet, fix für 5 min in 100% Aceton bei 4 ° C.
3. Dehydratisieren Gewebe in einer abgestuften Serie von RNase-freiem Ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) für jeweils 1 min.
4. Inkubiere in zwei Waschungen Xylol für 1 min, dann 5 min.
5. Folien aus Xylol Entfernen unmittelbar vor der für LCM verwenden und an der Luft trocknen.

4. Mit dem Laser Capture Mikrodissektionssystem

HINWEIS: Das LCM-Anwendungsprogramm hat 10 Werkzeugleisten und 2 Fenster auf die KontrolleMikrodissektion Verfahren. Symbolleisten: 1. Mikroskop, 2. Erfassung Laser, 3. Schneiden Laser, 4. Studien, 5. Navigation, 6. Materialien, 7. Gruppen erfassen, 8. Mikrodissektion, 9. Font, 10. Annotation. Windows: 1. Live-Video und 2. Road Map.

1. Öffnen Sie die Tür, indem Sie auf die Registerkarte "Tür öffnen" in der Werkstoff Symbolleiste in LCM-System-Software.
2. Lastschlitten auf den drei verfügbaren Slots. Für diese Demonstration Last eine Folie mit Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie mit DAB, ein Silan-Prep-Rutsche und eine PEN-Membran jeweils für eine schnelle Fluoreszenz Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie beschriftet Schiebe visualisiert. In einem typischen Experiment wurden entweder unmarkiertem Aceton fixiert Abschnitte mit einem Referenzobjektträger für Tyrosinhydroxylase mit DAB oder Schieber direkt mit fluoreszierenden Tyrosinhydroxylase für Lasereinfang labelled.
3. Laden Sie die LCM-Kappen in den freien Steckplatz.
   HINWEIS: Makro und HS LCM Kappen sind zur Verfügung. Die Art der LCM Kappe zu bedienen dehängt von der Anzahl von Zellen oder Gewebemenge gesammelt werden. Macro Folien aufgelistet zu sammeln bis zu mehreren tausend Zellen, während HS Kappen können mehrere hundert zu sammeln. Die Makro-Folien ermöglichen eine Gewebesammlung, sondern erfordern 50 ul Lysepuffer. Der HS Kappe, wenn sie mit den Adaptern verwendet, benötigt nur 10 ul Lysepuffer, der für mehr proportional Erholung der RNA ermöglicht.
4. Schließen Sie die Tür.
5. Legen Sie die Folie, um die Road Map Fenster, das eine Arbeits Blick auf die gesamte Folie bietet aktiviert, ermöglicht diese für die Auswahl des interessierenden Bereich (Abbildung 3). Sehen Sie sich die Road Map auf Live-Video-Fenster, um den interessierenden Bereich zu navigieren.
6. In der Werkstoffwerkzeugleiste, identifizieren die PEN-Membran-Folien indem Sie das Feld über dem Schiebeschlitz. Um Kappe Eigenschaften liefern der rechten Maustaste auf den Kappen der Materialien Werkzeuge Leiste und wählen Sie "Cap Versorgung Eigenschaften". Markieren Sie die Kästchen, die die Position der Kappen und wählen Sie entweder Macro oder HS Kappen.
7. Wählen Sie die Registerkarte "Fluoreszenz" im Microscope-Symbolleiste auf die Leuchtstofflampe zu drehen und damit die Leuchtstofflampe, um sich aufzuwärmen. Mit den blauen und UV-Filter, um den Alex Fluor 488 und DAPI bzw. visualisieren. Verwenden Sie die "Adjust-Kamera", um die Empfindlichkeit des Bildes, um die Fluoreszenz-markierten Zellen sehen zu erhöhen.
8. In der Werkstoffwerkzeugleiste mit der rechten Maustaste auf eine Kappe und verschieben Sie sie mit dem Schlitten von Interesse. Klicken Sie doppelt auf eine Stelle in der Road Map, die Region, die im Live-Video-Fenster wird angezeigt auswählen. Bewegen Sie die Kappe um auf der Folie, indem Sie einen Bereich auf der Road Map (Doppel-Linksklick) und dann mit der rechten Maustaste klicken und "Platz Kappe am Mittelbereich."
9. Vor der Verwendung des IR-Capture-Laser wollen und stellen Sie für Stärke. Setzen Sie den Deckel in einer Region des Schlittens von Gewebe. Auf dem Capture-Laser Werkzeugleiste, wählen Sie "Aktivieren". Stellen Sie die Power (3-100 mW), Puls (100 bis 1.000.000 μ; S) und # Hits des Lasers. Feuern Sie die IR-Laser, wenn die Kappe über einem Teil des Schlittens ohne Gewebe und überprüfen Sie, ob der Laser ausreichend schmilzt das LCM Kappe Membran.
   HINWEIS: Dies nennt man die Benetzung Schmelzen wird die Polymermembran auf der Kappe, so dass er in Kontakt mit dem Objektträger. Ausreichende Benetzung sichtbar ist als ein dunkler Ring auf den Objektträger mit der Mitte des Rings deutlich (siehe Abbildung 4 Beispiele für ausreichend und eine unzureichende Schmelz) fusioniert. Wenn Benetzung nicht aus, wieder stellen Sie die Leistung und Puls und Test Feuer, bis dies erreicht ist. Zusätzlich können mehrere Feuer des Lasers verwendet werden.
10. Wenn die Laserintensität IR eingestellt rechten Maustaste und wählen Sie "Aufnahme Laser ist hier", um den Laser anzustreben.
    HINWEIS: Dieser Schritt teilt dem Computer mit, wo die IR-Capture-Laser auf das Gewebe ab. Dieser Schritt des Richten des Lasers ist kritisch und muss jedes Mal, wenn die Kappe bewegt wird wiederholt oder die Objektivwechsel.

5. Laser Capture Mikrodissektion einzelner Dopamin-Neuronen aus Silan-prep Slides

1. Umzug in die Region von Interesse, um Zellen zu erfassen.
   HINWEIS: Das Beispiel der Isolierung von Dopamin-Neuronen wird hier gezeigt.
2. Um einzelne Zellen aus einer Silan-prep Rutsche zu erfassen, wählen Sie die Registerkarte "LCM" wird das Symbol "Single Point" in der Mikrodissektion Symbolleiste.
3. Im Mikroskop Werkzeugleiste Verwenden Sie die Registerkarte "Jalousie", um zwischen Fluoreszenz und Hellfeld mit Fluoreszenzfiltern Registerkarten wechseln, um die geeigneten Filter wählen und die Ziele Registerkarten, um die Vergrößerung zu ändern. Sobald die Zellen von Interesse in der Live-Video-Fenster sichtbar sind, stellen Sie die Punktgröße verwendet, um Zellen von Interesse für die ungefähre Größe der Zellen zu markieren. Tun Sie dies, indem Sie auf die Registerkarte Spot on Capture Laser Werkzeugleiste dann auf eine Seite eines gefärbte Zelle, gefolgt von einem Klick auf der gegenüberliegenden Seite.
   HINWEIS: Diese berechnet dieDurchmesser des Flecks und zeigt den Wert.
4. Markieren Sie die Zellen von Interesse, indem Sie auf sie, während das Symbol "Single Point" ausgewählt ist. Tun Sie dies, um einen Platz Marker auf jede Zelle zu platzieren. Hier wird die Blaufilter und die 10X-Objektiv werden die Dopamin-Neuronen zu visualisieren. Retest und Ziel der IR-Laser auf der Kappe, wo kein Gewebe unter ihm wie in den Schritten 4.9 und 4.10 beschrieben.
5. Sobald die Zellen markiert sind, wählen Sie die "Go - Schnitt und Capture" Vorsprung auf der Mikrodissektion Symbolleiste und dem IR-Laser wird automatisch ausgelöst, um alle markierten Zellen ausgewählt. Darüber hinaus, falls erforderlich, Feuer der IR-Laser manuell an jedem Punkt von Interesse (5D).
6. Bewegen Sie die Kappe von der Sektion und auf einem offenen Bereich des Schiebers zu überprüfen, ob die Zellen auf dem LCM Kappe eingefangen. Sicherzustellen, dass die Zellen von Interesse werden von dem Schlitten (5B, E) entnommen und dem LCM Kappe (5C, F) befestigt ist. Document thist Prozess durch Klicken auf den "Bild-Digitalisierung" Registerkarte in Mikroskop Werkzeugleiste.
7. Beim Sammeln von Gewebe fertig sind, entfernen Sie die Kappe mit einem rechten Mausklick auf die Kappe, und wählen Sie "Move to", dann "Entladen".

6. Laser Capture einzelner Dopamin-Neuronen aus der PEN-Membran-Folien

1. Um einzelne Zellen erfassen aus der PEN-Membran gleitet der Verwendung der IR- und UV-Lasern, wählen Sie "Schneiden und Capture" Registerkarte in der Mikrodissektion Symbolleiste. Wählen Sie die Registerkarte "Single Point", um die Zellen von Interesse zu markieren. Verwenden Sie die Registerkarte "Schnittgrundsatz", um jede Zelle zu skizzieren. Achten Sie darauf, um den IR-Laser testen, wie in Schritt 4.9 und 4.10 beschrieben und testen Sie die UV-Laser, um die Mindestintensität notwendig, geschnitten dachte, das PEN-Membran und Gewebe zu bestimmen (Abbildung 4 und 5)
2. Wählen Sie den "Capture and Cut" Vorsprung auf der Mikrodissektion Symbolleiste. Beim Sammeln von Einzelzellen unter Verwendung dieser Technik, seisicher, dass die IR-Laser zuerst durch den UV-Laser, da diese kleinen Stücken gefolgt abfeuern kann verloren gehen, wenn sie aus, bevor es an das LCM Kappe befestigt geschnitten werden.
   Hinweis: Dieses Verfahren kann auch manuell durch Brennen der IR-Laser an einem Punkt von Interesse durchgeführt werden, und die Zellen einzeln mit dem UV-Laser beschrieben.
3. Nach dem Sammeln der Zellen von Interesse, bewegen den LCM Kappe, wie oben in Stufe 5.7 beschrieben, um zu bestimmen, ob die Zellen wurden entfernt und in die Kappe (6) befestigt ist.
4. Beim Sammeln von Gewebe fertig sind, entfernen Sie die Kappe mit einem Rechtsklick auf die Kappe und die Option "Move to", dann "Entladen".

7. Erfassen des ventralen Haubengebiet von Silan-prep Slides

1. Um die Region von Interesse zu identifizieren, verwenden Sie die für die Immunhistochemie verarbeitet Rutsche.
   HINWEIS: Für diese Demonstration der ventrale Tegmentum isoliert (7A).
2. Legen Sie eine LCM Kappe und testen Sie die Laser, wie in Schritts 4.9 und 4.10.
   HINWEIS: Normalerweise wird ein Makro LCM Kappe verwendet, sondern eine HS Kappe kann auch verwendet werden (siehe Abbildung 8).
3. Um einen Gewebebereich (dh das ventrale Tegmentum) aus dem Silan-prep Schiebe isolieren, wählen Sie die Registerkarte "LCM" in der Mikrodissektion Werkzeugleiste, wählen Sie die Registerkarte "Polygon-außen". Skizzieren Sie die Region von Interesse in der Live-Video-Fenster. Abhängig von der Größe der Fläche für die Sammlung, umreißen die Region von Interesse bei geringer Vergrößerung (2X Ziel). Bei der Erhebung, jedoch verwendet das Gerät die 10X-Objektiv so ein, und richten Sie die IR-Laser unter dem 10X-Objektiv vor der Aufnahme.
4. Wählen Sie die "Go - Erfassung und Schnitt" Registerkarte in der Mikrodissektion Symbolleiste.
   HINWEIS: Der Computer wird automatisch ausgelöst, die IR-Laser während des gesamten ausgewählten Bereich (7F, I). Wenn die LCM-Membran nicht ausreichend in der gesamten Region geschmolzen wurde, kann der Laser Fired Mann werdenviduell oder der gesamte Vorgang wiederholt.
5. Bewegen Sie den LCM Kappe vom des Gewebes, um festzustellen, wie gut das Gewebe gesammelt.
   HINWEIS: Eine Fahrt mit dieser Methode hinterlässt in der Regel einige Gewebe hinter auf dem Objektträger (siehe Figure7G). Wenn dies der Fall ist, wiederholen Sie die Auswahl und vor Schritt erfassen. Wiederholen Sie diesen Schritt können die Gewebemenge gesammelt (7J) zu erhöhen.
6. Beim Sammeln von Gewebe fertig, entladen Sie die Kappe mit einem Rechtsklick auf die Kappe und die Option "Move to", dann "Entladen".

8. Erfassen des ventralen Haubengebiet von PEN Membranfolien

1. Verwenden Sie das für die Immunhistochemie verarbeitet Rutsche als Leitfaden für die Region von Interesse aus dem Gewebe auf der PEN-Membran-Folie als hier oben aus.
2. Wählen Sie das "Ausschneiden und Capture" Registerkarte in der Mikrodissektion Symbolleiste. Wählen Sie die Registerkarte "Cut Line" und stellen die Region von Interesse mit dem immunohistochemistry beschriftet Rutsche als Leitfaden.
   HINWEIS: Das Programm wird automatisch Punkte für die IR-Laser, um das Gewebe an der Kappe zu befestigen hinzuzufügen. Verwenden Sie die Registerkarte "Single Point", um weitere Punkte hinzuzufügen, um das Gewebe an der Kappe besser zu sichern.
3. Unter dem 10X-Objektiv, Testfeuer und richten Sie die IR- und UV-Laser wie in 4.9 und 4.10 beschrieben. Prüfen Sie, dass die UV-Laser kann die Membran auf der Folie und dass diese Kürzung entspricht der Position auf dem Bildschirm zu durchdringen. Verwenden eines UV-Lasers Festigkeit, der gerade ausreicht, um die Membran und Gewebe zu schneiden ist, aber nicht in das Gewebe (5) zu beschädigen.
4. Wählen Sie die "Go - Erfassung und Schnitt" Registerkarte in der Mikrodissektion Symbolleiste.
   HINWEIS: Der Computer wird automatisch ausgelöst, die IR-Laser auf allen markierten Stellen in dem Gewebe, um sie an der Kappe zu befestigen dann feuern die UV-Laser, um die Diashow PEN-Membran und Gewebe (7C) geschnitten. Zusätzliche IR geschmolzenen Stellen kann notwendig sein, um die tis ausreichend befestigenklagen, um das LCM Kappe, die auch manuell hinzugefügt werden können.
5. Bewegen Sie den LCM Kappe ab des Gewebes zu bestimmen, ob das Gewebe wurde aus dem Abschnitt (7C) entfernt und an der Kappe (7C) verbunden.
6. Beim Sammeln von Gewebe beendet ist, die Kappe zu entfernen, klicken Sie rechts auf der Kappe, und wählen Sie "Move to", dann "Entladen".

9. Isolierung von RNA

1. RNA aus den gefangenen Zellen oder Gewebe zu sammeln, inkubieren LCM Kappenmembran in RNA Lysispuffer 30 min bei 37 ° C.
   HINWEIS: HS Kappen, ist ein Adapter zur Verfügung, die für den Einsatz von nur 10 & mgr; l Lyse-Puffer auf der Kappe ermöglicht, und wird an einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Macro Kappen erfordern 50 ul Lysepuffer und wird direkt an einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Nach der Inkubation, drehen Sie das Lyse-Puffer nach unten in die 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Um eine vollständige Lyse aller Zellen o sicherzustellen,r Gewebe, ziehen Sie weg dem LCM Kappe Membran der Kappe und in Lysepuffer.
4. Um RNA Integrität zu prüfen, die Verwendung von RNA aus dem restlichen auf der Folie nach der LCM um RNA Integrität messen Gewebe isoliert.
   Hinweis: Wegen der begrenzten Probe RNA mit LCM erhalten, ist es üblicherweise nicht praktisch, RNA Integrität auf LCM isolierte RNA testen jedoch RNA aus dem verbleibenden Gewebe ist ein guter Indikator für jede RNA-Abbaus durch Fixierung, Immunhistochemie und Zeit während der LCM Verfahren.

Results

Die Aufnahme in den Figuren 6 und 7 zeigen die Fähigkeiten zur Isolierung einzelner Dopaminneuronen. Die aktuelle anatomische Auflösung etwa 5-10 & mgr; m als die kleinste Punktgröße, die konsequent auf die LCM hergestellt werden können Kappen, um eine Zelle zu isolieren. Die einzige Einschränkung für die Isolierung von spezifischen Zelltypen ist die Fähigkeit, die Zellen sichtbar zu machen. Obwohl LCM ist fähig Isolierung einzelner Dopamin-Neuronen, wahrscheinlich auftritt Kontamination von Teilen von benachbarten unmarkierten Zellen. Daher ist die letzte Probe eine konzentrierte Ansammlung von Dopamin-Neuronen, nicht eine reine Population von Dopaminneuronen. Diese Technologie kann auch zur Isolierung von kleinen Bereichen des Gewebes, wie diskreten Kernen oder Regionen im Gehirn wie bei der Isolierung von den ventralen tegmentalen Bereich angezeigt. Früheren Veröffentlichungen haben diese Verwendung in Gehirngewebe nachgewiesen sowie pathologischen Gewebes von normalem Gewebe ^5,11 isolieren.

(9). RNA-Qualität wurde in den RNA-Proben aus Gewebe für LCM mit niedrigeren Integrität nach Immunhistochemie verwendet (RIN nicht verfügbar ist), gefolgt von Aceton Fixierung (RIN 2.6) reduziert, verglichen mit Gesamt-Hirn-RNA (RIN 8,2), wie durch eine relative Verringerung der gesehen werden Höhe der rRNA S28 Spitze im Vergleich zum S18 Höhepunkt. Allerdings hielt die RNA die 18S und 28S-Bands und Genexpression mit Q-PCR gemessen werden.

(10A) isoliert. Um RNA-Menge mit der Q-PCR, einem Bereich von Konzentrationen der Gesamthirn-RNA und RNA aus den Dopamin-Neuronen wurden revers transkribiert, und die β-Actin-Gen wurde unter Verwendung von Q-PCR wie oben beschrieben ⁵ gemessen messen. Basierend auf diesen Messungen wurde eine Konzentration von 3,55, 6,82 und 20,58 pg / & mgr; l von 50, 100 und 200 Dopamin-Neuronen, bzw. (10B) berechnet.

Um zu zeigen, wie Isolation von Dopamin-Neuronen vergleicht, um die Isolierung des gesamten ventral tegmentalen Bereich mit LCM, Dopamin-Neuronen spezifische Gene (Nurr1 Tyrosinhydroxylase und Dopamin-Transporter) wurden mit Q-PCR in diesen zwei verschiedenen Arten von Proben gemessen und verglichen, um die Expression von β-Actin (Abbildung 11). Da niedrigere C _t-Werte mit einer höheren Konzentration an dem Gen von Interesse erzeugt wird, eine Abnahme in der & Dgr; C _T zeigt eine erhöhte Expression des Dopaminneurons Gene relativ zu β-Aktin. Dies zeigt, dass die Isolierung der einzelnen Dopaminneuronen konzentriert die Expression von Dopamin-Neuronen spezifischen Genen. In der ventralen Tegmentum Proben werden Dopamin Neuronen spezifische Gene als andere Zellen (nicht-dopaminergen Neuronen und Gliazellen) werden auch gesammelt werden, die β-Aktin ausdrücken, aber nicht Dopamin-Neuronen exprimieren, verdünnt.

Abbildung 2. Laser Capture mittels Infrarot (IR) Erfassungslaser und die Ultraviolett- (UV) Laserschneiden. Um größere Gewebebereiche zu erwerben oder Erleichterung der Rückgewinnung der Zellen unter Verwendung des UV-Lasers wird Gewebe auf einem Objektträger mit einer Membran angebracht ist auf den Schlitten entlang der Außenecke (PEN Membran Dias) verbunden ist. Das LCM Kappe auf t gesetzter Gewebe und die IR-Capture-Laser verwendet wird, um die Kappe Membran schmelzen und bringen Sie das Gewebe an den LCM Kappe (Stufe 1 und 2). Der UV-Laserschneid wird dann verwendet, um durch den Schieber Membran und Gewebe (Schritt 3 und 4), so dass, wenn die Kappe entfernt wird das Gewebe vom Schlitten entfernt und verbleibt auf dem LCM Kappe (Schritt 5) zu schneiden.

Abbildung 3. Die Laser Capture Mikrodissektionssystem Road Map. Diese Laser Capture Mikrodissektion Systems bietet Platz für 3 Dias auf einmal. Wenn Objektträger werden in das Mikroskop eingelegt werden geringer Vergrößerung Road Map Bilder für jede Folie erzeugt. Bei Auswahl eines Bereichs auf der Roadmap Bild bewegt das Live-Bild-Fenster in dieser Region. Zu Demonstrationszwecken wurde die Maus Hirn in 10 & mgr; m Abschnitt auf 3 Rutschen geschnitten. Die erste Folie wurde für Tyrosin-Hydroxylase immunoreactivi gekennzeichnetty mit Diaminobenzidin als Chromogen (A). Die Schnitte wurden entweder Silane-Prep-Objektträger (B) oder PEN Membran Schlitten (C) befestigt ist. Beide Objektträger wurden unter Verwendung des schnellen Fluoreszenz Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie markiert. Pfeile in (C) zeigen die Befestigung des PEN-Membran auf den Objektträger. Kein Gewebe außerhalb dieser Grenze kann mit LCM gesammelt werden.

Abbildung 4. Mit dem IR-Capture-Laser. Die IR-Capture-Laser verwendet wird, um das LCM Kappe Membran, um das Gewebe zu dem LCM Kappe anbringen und entfernen Sie sie vom Rest des Gewebes zu schmelzen. Die IR-Capture-Laser muss stabil genug sein, um das LCM Kappe Membran ausreichend zu schmelzen, um das darunter liegende Gewebe und Glasobjektträger zu kontaktieren. Das Bild oben zeigt, wenn der Laser nicht ausreichend war, um die Membran zu schmelzenmit dem Schlitten (linke zwei Stellen). Wenn das geschmolzene Membranglasrutsche berührt, kann ein dicker schwarzer Umriss beachten (richtigen Stelle). Die Intensität des Lasers kann durch Änderung der Leistung (3-100 mW), Impuls (100-1,000,000 us) und # Hits des Lasers eingestellt werden. Zusätzlich wiederholt Brennen des IR-Laser an der gleichen Stelle kann auch die Membran weiterhin schmelzen. Das Ziel der IR-Laser muss angepasst zeit das LCM Kappe bewegt wird oder wenn das Ziel verändert wird. Balken = 100 um.

Abbildung 5. Verwendung des UV-Laserschneiden. Die UV-Schneiden Laser verwendet wird, um durch die PEN-Membran und Gewebe zu schneiden. Vor der Mindestintensität erforderlich, um durch die Membran geschnitten und Gewebe benötigt, um zu bestimmen, da die UV-Lasergewebeschäden verwendet werden. Oben sind die drei Punkte (Pfeile) verschiedener UV-Laserintensitäten mit der gezeigt links Fleckgröße ausreichend für 10 & mgr; m Abschnitte, der Mitte Platz für dickere Abschnitte und die richtige Stelle zeigt eine UV-Laserintensität, die zu hoch ist. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 6. direkte Isolierung von Tyrosin Hydroxylase immunreaktiven Neuronen mit Hilfe der IR-Laser. Dopamin-Neuronen nach einer schnellen Fluoreszenzmarkierung für Tyrosinhydroxylase (A) gezeigt. Wenn der IR-Laser gezündet Schmelzen des LCM Kappenmembran über dieser Neuronen (D), Entfernen der Kappe greift diese Zellen vom Objektträger (B, E). Diese Neurone können dann visualisiert, wie auf den LCM Kappe (C, F) angebracht werden. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 7. Direkte Isolierung von Tyrosin-Hydroxylase immunreaktiven Neuronen aus PEN Membran gleitet über die IR- und UV-Lasern. Tyrosinhydroxylase markierten Neuronen sind oben (A) gezeigt. Diese Neurone können an das LCM Kappe mit dem IR-Laser angebracht und von der PEN-Membran Rutsche mit dem UV-Laser (B) geschnitten werden. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 8. Indirekte Isolierung des ventralen tegmentalen Bereich mit Tyrosinhydroxylase-Immunreaktivität. Der Ort der Dopamin-Neuronen im ventral tegmentalen Bereich wurde in einem Abschnitt unter Verwendung von Standardtechniken Immunhistochemie (A und E) sichtbar gemacht. Diese immunhistochemischen markierten Abschnitt wurde als eine Matrize verwendet, um den ventralen tegmentalen Bereich im ungefärbten benachbarten Abschnitten (B und F) zu lokalisieren. Verwendung des UV-Lasers wurde die ventralen tegmentalen Bereich zum LCM Kappe mit dem IR-Laser befestigt und von dem Objektträger mit dem UV-Laser (C und D) ausgeschnitten und an einen HS LCM Kappe (D) gezeigt befestigt. Die ventralen Haubengebiet von Silan-prep Dias isoliert nur mit dem IR-Laser wird auch gezeigt, dass ein Makro Kappe (FK) befestigt. Man beachte, dass mehr als ein Versuch war erforderlich, um die meisten der Gewebe von diesem Bereich (Vergleichs G und J) zu sammeln. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m.pload / 52.336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 9. RNA Qualität. Repräsentative Elektropherogramme und zugehörige Gelbilder von kommerziell erhältlichen Gesamt-Hirn-RNA (A) und RNA aus Abschnitten isoliert nach Acetonfixierung und LCM (B) oder schnelle Fluoreszenz Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie und LCM (C). Obwohl RNA Qualität wurde in den Abschnitten für die Immunhistochemie verarbeitet, im Vergleich zum gesamten Gehirn RNA verringert, die Elektropherogramme zeigen überwiegend intakter RNA auf der Basis der Anwesenheit der rRNA S18 und S28 Spitzen. Whole-Brain-RNA-Konzentration betrug 6,487 pg / ul mit einem RIN von 8,2. Aceton fixierten Gewebe RNA-Konzentration betrug 5,036 pg / ul mit einem RIN von 2,6. RNA nach Immunhistochemie h erhalten Anzeige einer Konzentration von 4,474 pg / ul und RIN nicht verfügbar war.

Abbildung 10. RNA-Menge. Um die Menge an RNA in Neuronen mit LCM erhalten zu bestimmen, wurde eine Standardkurve der RNA-Konzentrationen mit einem fluorospectrometer und Q-PCR hergestellt. Für die fluorospectrometer Messungen (A), zeigt das große Grafik den höheren Bereich der RNA-Mengen und die kleine Grafik zeigt die Sensitivität dieses Tests bis zu 10 pg / ul. Konzentrationen von RNA aus 50, 100 und 200 Dopaminneuronen betrug 17,3, 24,8 und 50,9 pg / & mgr; l auf. Verwendung von Q-PCR auf RNA Mengen (B) zu messen, die Konzentrationen von RNA, die aus 50, 100 und 200 Dopaminneuronen betrug 3,55, 6,82 und 20,58 pg / & mgr; l auf.

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Abbildung 11. Die Konzentration von Dopamin-Neuronen spezifischen Genen mit der Isolierung von einzelnen Dopaminneuronen. Der Unterschied in C _t (& Dgr; _t) zwischen Dopamin neuronenspezifische Gene (Nurr1 Tyrosinhydroxylase und Dopamin-Transporter) und β-Aktin in Proben von Dopamin-Neuronen im ventralen Tegmentum mit LCM isoliert gegenüber Ausdruck in Dissektionen der gesamten ventralen Hauben Region angezeigt. Da niedrigere C _t-Werte mit einer höheren Konzentration an dem Gen von Interesse erzeugt wird, eine Abnahme in der & Dgr; C _T zeigt eine erhöhte Expression des Dopaminneurons Gene relativ zu β-Aktin als andere Zellen (nicht-dopaminergen Neuronen und Gliazellen) wird im ventralen Tegmentum Proben, die β-Actin-Ausdruck, aber nicht Dopamin-Neuronen exprimieren, aufgefangen werden.

Discussion

LCM ist eine leistungsfähige Technik für die Präparation von diskreten Populationen von Zellen oder Gewebebereiche von Gewebeschnitten auf einem Objektträger und die anschließende Isolierung von RNA, MikroRNA, DNA und Proteinen. Die Verwendung von LCM in Verbindung mit der Analyse unter Verwendung von Hochdurchsatz-Technologien wie Mikroarray, der nächsten Generation RNA-Sequenzierung, epigenetische Analyse von DNA und Proteomik wird mehr und mehr üblich, die Empfindlichkeit dieser Verfahren verbessert und die Menge des benötigten Ausgangsmaterials wird reduziert ^8-12. Mit LCM wird eine bessere anatomische Auflösung für eine Probe erreicht, und das Verständnis von nachgeschalteten Maßnahmen dieser Proben wesentlich verbessert. Eine Einschränkung mit LCM ist, dass es eine konzentrierte Probe der Zellen von Interesse, aber nicht notwendigerweise eine reine Population von Zellen. Die Grenzen der Präzision, dass es eine gewisse Kontamination von benachbarten Gewebe sein. Allerdings ist diese Technik zu konzentrieren, die Zellen von InteresseEffekte mit dem umgebenden Gewebe und Zellen zu minimieren und die experimentellen Effekte auf die Zellen von Interesse.

Direkte versus indirekte Immunhistochemie

Seit LCM wird derzeit vor allem für die Isolierung und Messung von RNA verwendet werden, halten RNA intakt ist ein sehr wichtiges Kriterium. Aufrechterhalten RNA Integrität ist das Hauptprinzip hinter der Verwendung indirekter Immunhistochemie Gewebedissektion, die die Notwendigkeit, das Gewebe direkt zu färben, die die RNA abbauen kann entfernt führen (Abbildung 10). Wenn die experimentellen Frage jedoch erfordert die Isolierung einer Population von Zellen, wie beispielsweise Dopamin-Neuronen, wird direkte Fluoreszenz Immunhistochemie erforderlich. Verwendung eines schnellen Immunhistochemie Markierungsprotokoll kann den Abbau der RNA während des Verfahrens zu minimieren. Aufgrund der Verwendung von hohen Konzentrationen an primären und sekundären Anti die kurzen InkubationszeitenKörper, Konzentrationen, die um 10 bis 20 mal höher sind als das, was für konventionelle Immunhistochemie mit einer 2-stündigen Inkubation notwendig ist. Wenn jedoch längere Inkubationszeiten erforderlich sind, Brown und Smith verwendet Hochsalzpuffer, um RNA-Abbau hemmen und erhalten gute Qualität RNA mit langen Inkubationszeiten (bis zu 20 h) ^13. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, wenn es beträchtliche Zeit zwischen Kennzeichnung des Gewebes und Zugriff auf einen LCM Systems erforderlich.

Wahl der Folien - PEN-Membran, Silan-prep und unbeschichteten Glasträger

Die Verwendung von unbeschichteten Glasträger für LCM berichtet worden ^14. In unserem Labor haben Silane-Prep-Folien wurde gefunden, dass die optimale Wahl, da diese Beschichtung ausreichend befestigt das Gewebe auf dem Objektträger für die Immunhistochemie, ohne Verlust von Gewebe erlaubt aber für die Befestigung des Gewebes an den LCM Kappen und der Entnahme aus dem Schlitten . Unbeschichtete Glasobjektträger habenzeigte einige Gewebeverlust mit dem immunhistochemischen Verfahren. Wenn indirekten Immunhistochemie verwendet wird, wird jedoch Gewebeerhalt weniger ein Problem. Mit der richtigen Wasserentzug, die Erfassung von Zellen oder Gewebe aus Silan-Prep-Folien war nicht ein Problem. Jede der verschiedenen Ansätze für die in diesem Dokument beschriebenen Isolierung Neuronen oder Hirnregionen hat Vorteile und Nachteile. Zur Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen, die Verwendung von Silan-prep Folien hat den Vorteil einer besseren Optik und ist weniger teuer als die PEN Membran gleitet. Der Nachteil ist, dass manchmal die Erfassung Zellen schwierig sein kann, wenn nicht genügend Dehydratisierung (siehe unten) und einige Gewebe kann auf der Folie verbleiben. Der Vorteil der PEN Membranen Folien besteht darin, dass mit der Kombination aus dem Laser und UV-Laser IR sichergestellt, dass die Dopamin-Neuronen werden gesammelt. Nicht Zellen aus einem PEN-Membran gleitet sammeln fast nie auftritt, da es weniger abhängig von Austrocknung als die Glasobjektträger ist. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die UV-Laser verwendet werden kann, um die Form der Neurone von Interesse enger anzunähern, als im Vergleich zu einem Kreis zur Erfassung von Neuronen aus der Glasobjektträger mit dem IR-Laser. Für die Isolierung von Gewebebereiche sind die PEN-Membran-Folien weit überlegen und rechtfertigen die zusätzlichen Kosten. Dieser Ansatz führt zu einer vollständigen Entfernung des gesamten Gewebes auf die Membran geschnitten wird, ist viel schneller als die Erfassung einen großen Bereich von Gewebe unter Verwendung des IR-Laser allein und dickere Gewebeabschnitte gesammelt werden können. Nur unter Verwendung der IR-Laser erfordert, dass das LCM Kappenmembran vollständig über den gesamten Gewebebereich aufgeschmolzen. Darüber hinaus ist unvollständige Sammlung des Gewebes typischen und erfordert in der Regel mehrere Versuche. Obwohl diese länger als Trenngewebe aus dem PEN Membran Rutsche, ist, wenn die verfügbare Gewebe ist bereits auf einem Glasträger oder einem UV-Laser nicht verfügbar ist, ist dies eine gangbare Option, da die meisten Gewebe gesammelt werden können (Figur 8J).

ove_content "> Kritische Schritte

Die 100% Ethanol Inkubationen sind eine der wichtigsten Schritte. Um Zellen aus Silan-prep gleitet sammeln vollständige Dehydratisierung des Gewebes erforderlich ist. Deshalb wird jede Wasser nicht entfernt, die vor allem mit der 100% Ethanol Inkubation verbunden ist, beeinflussen die Fähigkeit zu holen Zellen aus den Folien. Um dieses Problem zu beheben, ändern sich häufig die 100% Ethanol-Lösungen wie Wasseraufnahme aus der Luft oder die Übertragung der letzten Waschschritten kann die Entwässerung beeinflussen. Zusätzlich werden Molekularsiebe verwendet, um jede Wasserverschmutzung zu absorbieren. Die LCM-System sollte idealerweise in einem kleinen Raum mit einem Entfeuchter zu niedriger Luftfeuchtigkeit zu halten sein.

Gute Kryostatschnitten sind entscheidend für die richtige LCM. Bereiche müssen flach mit Falten im Gewebe minimiert werden. Falten in dem Gewebe wird die Entfernung zwischen dem LCM Kappe erhöhen und verhindern, dass es in Kontakt ter Gewebe. Es wird dann schwierig, die Membrankappe auf das Gewebe ausreichend zu schmelzen. Für Glasträger, typischerweise Schnittdicke sollte zwischen 6 und 12 um liegen. Dickere Querschnitte können mit den PEN-Membran Folien erfasst werden.

LCM bietet eine technische Kapazität, sehr genaue Sezieren von Gewebe und Zellen, die aus Objektträgern zu machen. Dies erhöht die Auflösung der weiteren Analyse im Vergleich zu Brutto-Dissektion der Gewebestücke. Obwohl, LCM können zeit- und arbeitsintensiv sein, ist es nicht eine umfassende Ausbildung und Know-how und erfordern, wenn sie mit anderen Hochdurchsatztechnologien, stark das Verständnis eines biologischen Prozesses zu verbessern, wenn einzelne Zellen oder anatomischen Regionen eingesetzt werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Mikrodissektionssystem	Life Technologies, Grand Island, NY	Neueres Modell wird jetzt verkauft
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membranfolien	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silan-Präparate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase-frei	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase-frei	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
RNASE-frei Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Molekularsieb	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Anti-Tyrosin-Hydroxyase-Antikörper	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
2100 Bioanalysator	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	401513
Nanodrop 3300 Fluorspektrometer	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, NY	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780