Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten

Zusammenfassung

Unter Verwendung optimierter ex vivo Assays aus humanen mononukleären Blutzellen (PBMC) haben wir gezeigt, dass ein brennbares Tabakprodukt die rezeptorvermittelten intrazellulär sekretierten Zytokine und die zytolytische Fähigkeit von Effektor-PBMCs deutlich unterdrückt. Diese Schnelltests können bei der Produktbewertung und dem Verständnis der potenziellen Langzeitwirkungen der Tabakexposition nützlich sein.

Zusammenfassung

Unter anderen pathophysiologischen Veränderungen, chronische Exposition gegenüber Zigarettenrauch verursacht Entzündungen und Immununterdrückung, die mit einer erhöhten Anfälligkeit von Rauchern um mikrobielle Infektionen und Tumorhäufigkeit in Verbindung gebracht wurden. Ex-vivo-Unterdrückung der Rezeptor-vermittelten Immunantworten in humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit Rauchbestandteile behandelt ist ein attraktiver Ansatz für die Mechanismen untersuchen und bewerten die möglichen langfristigen Auswirkungen der Exposition gegenüber Tabakwaren. Hier optimierten wir Methoden zur Ex-vivo-Tests unter Verwendung von PBMCs durch bakterielles Lipopolysaccharid, ein Toll-like Rezeptor-4-Liganden stimuliert durchzuführen. Die Auswirkungen der ganze Rauch-konditioniertes Medium (WS-CM) wurde eine brennbare Tabakprodukt Zubereitung (TPP) und Nikotin auf die Zytokinsekretion und die Zielzelle Tötung durch PBMCs in den ex-vivo-Tests untersucht. Wir zeigen, dass Zytokine IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 und IL-8 und intrazellulären Cytokinen IFN-47 ;, TNF-α und MIP-1α in WS-CM-belichteten PBMCs drückt. Die cytolytische Funktion von Effektorzellen PBMCs, wie durch einen K562 Targetzelle töten Assay bestimmt wurde ebenfalls durch Einwirkung von WS-cm verringert; Nikotin war minimal wirksam in diesen Assays. Zusammenfassend stellen wir eine Reihe von verbesserten Assays, um die Auswirkungen TPPs in ex-vivo-Untersuchungen zu bewerten und diese Methoden ohne weiteres zur Prüfung andere Produkte von Interesse angepasst werden.

Einleitung

Ein wesentlicher Körper des Wissens verweist auf die negativen gesundheitlichen Auswirkungen von chronischen Zigarettenrauchen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und Krebs ^1,2. Chronischen Rauchens ist bekannt, Entzündung und Immunsuppression verursachen, und diese Veränderungen werden berichtet, um zu einer erhöhten Gefahr der mikrobiellen Infektion und Krebs bei Rauchern ³ beitragen. In-vitro- und ex-vivo-Techniken nützlich sind bei der Aufklärung der molekularen Grundlage der pathophysiologischen Wirkungen Zigarettenrauch ^4-9 (Tabelle 1) und werden als wichtige Instrumente zur Führung des Schwellen Regulierung verschiedener Tabakwaren ^10,11 anerkannt.

Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass brennbare Tabakprodukt Zubereitungen (TPPs) wie Vollrauch konditioniertes Medium (WS-CM) und die Gesamtpartikelmaterial (TPM) sind weitaus zytotoxische und schädlich fürDNA als nichtbrennbar TPPs oder Nikotin ^12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten wurde kürzlich berichtet, dass brennbare TPPs oder Nikotin ^12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten, die wir vor kurzem berichtet, dass brennbare TPPs verursacht deutliche Immunsuppression. Dies wurde durch die Suppression der Toll-like Rezeptor (TLR) -Liganden belegt, stimuliert Zytokinsekretion und Zielzelle (K562) Tötung durch PBMCs in einem ex vivo-Modell ^14. Angesichts der Bedeutung der Entzündung im Zigarettenrauch induzierten Krankheitsprozesse wird eine weitere Optimierung der Testbedingungen, die immunmodulatorische Wirkung von Zigarettenrauch zu bewerten in diesem Bericht.

Die ex-vivo-Untersuchungen in der Regel gemessen und intrazelluläre Zytokine sowie die zytolytische Funktion von zytotoxischen T und NK-Zellen in K562-Zellen zu töten Assays ^14. Die Assays beteiligt Vorinkubation mit WS-CM und Nikotin und nachfolgende Stimulation von PBMCs mit TLR-Agonisten über einen Zeitraum von 3 Tagen; die endgültige Auslesen durchgeführt werden unter Verwendung von Enzym-Immuntests (ELISAs) und / oder Durchflusszytometrie. Wir verwendeten bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS), die TLR-4-Rezeptoren bindet und stimuliert PBMCs, was zur Produktion von intrazellulären Cytokinen und Sekretion von Zytokinen. Zusätzlich zur Optimierung der verschiedenen Assayschritte zum Auswerten der immunmodulatorischen Wirkung von TPPS präsentieren wir auch Verfahren zur Isolierung von PBMCs, Zelltodassays und IL-8 Quantifizierung. Diese Methoden angewendet werden, um andere Forschungsfragen anzugehen und weiter verfeinert, um Tabakwaren in der Regelungszusammenhang zu bewerten.

Tabelle 1 veröffentlichte Berichte über In-vitro- und Ex-vivo-Methoden zur Varilux pathophysiologischen Wirkungen von Tabakprodukt Vorbereitungen studieren CS, Zigarettenrauch Medium. CSC, Zigarettenrauch Kondensat; CSE, Zigarettenrauch-Extrakt; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; qPCR, quantitative Polymerase-Kettenreaktion; RT, Echtzeit quantitative Polymerase-Kettenreaktion; TS, Tabakrauch.

Autor (Studienjahr)	Laan et al. (2004)	Moodie et al. (2004)	Oltmanns et al. (2005)	Vayssier (1998)	Erden et al. (2004)	Birrell et al. (2008)
Verwendeten Zellen	Menschen bronchiale Endothelzellen (BEAS-2B), humanen Neutrophilen	Menschen Alveolarepithelzellen (A549)	Menschlichen glatten Atemwegsmuskulatur (HASMC)	Menschen premonocytic U937-Zellen, menschlichen Monozyten	Alveolaren Typ II Epithelzellen (ATII)	Humanen monozytärenZellinie (THP-1), menschliche Lungenmakrophagen
TPP verwendet	CSE	CSC	CSE	TS	CSE	CS
Methode verwendet	ELISA, qPCR, Migration, Elektroschalt	Immunhistochemische Chemie, Elektrophorese Array Kit, RT-PCR, ELISA	ELISA, RT-PCR, qPCR, Elektrophorese	Gel-Mobility-Shift-	Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Elektrophorese, ELISA	qPCR, ELISA, E-toxate Kits (Sigma), p65-Platten-Assay (TransAM), Elektrophorese, verschiedenen Immunoassay-Kits
Maßnahme	IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, Migration	Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, NF-kappaB, IL-8, pI & kgr; B-α, GADPH	HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, Eotaxin	Hitzeschock / Stressproteine ​​(HSP / Hsp70), HF-Transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α	Surfactant Protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ	IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-Phosphorylierung cJun: DNA-Bindung, Glutathion, p65: DNA-Bindung
Endergebnis	CSE herunterreguliert Zytokin-Produktion durch Unterdrückung der AP-1-Aktivierung.	H 2 O 2 und CSC verbessern Acetylierung von Histon-Proteine, zu verringern Histon-Deacetylase-Aktivität, differenziell reguliert proinflammatorische Zytokin-Freisetzung.	Zigarettenrauch kann die Freisetzung von IL-8 aus HASMC, durch TNF-α, 20% CSE weniger IL-8-Freisetzung, Hemmung der Eotaxin und RANTES erweitert durch Zigarettenrauch verursacht.	TS aktiviert HF Transkriptionsfaktor, der mit Hsp70-Überexpression und Hemmung der NFkB-Bindungsaktivität und TNF-α Freisetzung assoziiert war.	Reduzierte ATII Zellen abgeleiteten Chemokin Ebenen Kompromisse alveolar Reparatur, einen Beitrag zur Zigarettenrauch induzierten Alveolarschaden und Emphysem.	Daten liefern mechanistische Erklärung dafür, warum Raucher haben erhöhte Atmungsinfektionen. Unterdrückung des unspezifischen Reaktion wird durch einen Anstieg der IL-8 begleitet.

Protokoll

HINWEIS: Eine schriftliche Einverständniserklärung, diese Studie zu tun, wurde in einem örtlichen klinischen Forschergruppe unter IRB-Zulassung erhalten, pro Good Clinical Practices. Verarbeitung von Blut, werden Isolierung von PBMCs und andere Zellkulturexperimenten unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung von mikrobiologisch Sterilgut und Reagenzien.

1. WS-CM Herstellung

1. Generieren WS-CM, wie zuvor beschrieben ^12.
   1. Bereiten Sie WS-CM, indem Rauch von vier 3R4F Referenz Zigaretten über Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium ohne Phenolrot mit dem folgenden Raucher-Regime: 35-60-2, puff Volumen in ml, Blätterteig-Intervall in Sekunden, und puff Dauer in Sekunden auf. Jedes Präparat erzeugt eine 20 ml Probe.
2. Label-Röhre (n) mit Datum, Uhrzeit abgeschlossen und Zigaretten Name und Nummer. Bewahren Sie die 500 ul Aliquots bei -80 ° C unmittelbar nach dem Rauchen beendet ist.
3. Analysieren Sie Teilmengen von gefrorenem WS-CM, Um die Mengen an Nikotin, spezifischen Nitrosamine und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben ^12.

2. Isolierung von PBMCs

1. Sammeln Sie frisches Blut von gesunden Spendern (der nicht-Konsumenten von Tabakerzeugnissen sind) Isolieren PBMCs von frischem Blut, wie nachstehend unter einer separaten Genehmigung von der Wake Forest Baptist Health IRB ¹⁵ beschrieben.
   1. Vor der Ankunft des Blutbeutels, eine 500 ml Flasche, Schere, Isolationspuffer und Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (RT) bereit, in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Zellkultur Kapuze. Isolation Puffer muss vor Licht geschützt werden.
   2. Halten Sie den Blutbeutel auf den Kopf und schneiden Sie das Rohr direkt unter, wo es eingespannt worden ist, bleibt mindestens 3 cm Schlauch.
   3. Entfernen Sie die Kappe von der 500 ml Flasche und halten Sie den Schlauch über der Flaschenöffnung. Nehmen Sie den Blutbeutel und invertieren, damit das Blut ungehindert aus dem Beutel in t fließener die Flasche, bis der Beutel leer ist. Lassen Sie das Blut auf die Innenwand der Flasche gegenüber gerade nach unten zu fließen, wie um zu vermeiden, Blasen.
   4. Gießen Sie Isolierungspuffer in die Flasche zu einem 1: 5-Verhältnis von Isolierungspuffer, um Blut. Verschließen Sie die Flasche fest und vorsichtig umdrehen es, end-over-end, 10-mal. Lassen Sie die Flasche in der Zellkultur Haube mit Beleuchtung inkubiert aus, für 1 h bei RT.
   5. Ein leichtes, strohgelbe Schicht wird über dem Blut aufzubauen. Entfernen Sie diese Schicht unter Verwendung einer 25 ml serologische Pipette in 50 ml konische Röhrchen. Der gesammelte Betrag kann variieren von 50 - 300 ml, je nach dem Gegenstand, die Blut gespendet.
   6. Zentrifugiere die Röhrchen bei 200 x g für 10 min bei RT.
   7. Saugen Sie das durchscheinende Überstand, so dass die dunkle Blutfarbenen Pellets. Das Pellet wird lose aber viskos sein.
   8. Pipette 3 ml Isolationspuffer in 15 ml konische Röhrchen.
   9. Zu dem Pellet, 20 ml DPBS für je 50 ml strohfarbene Flüssigkeit in s gesammelttep 2.1.5. Vortex, um gründlich zu mischen, und Konsolidierung des resuspendierten Flüssigkeit aus mehreren Rohren. Diese Flüssigkeit suspendiert Blutkörperchen enthält.
   10. Mit einer Transferpipette Transfer 5 ml der suspendierten Blutzellen auf 3 ml Isolationspuffer in Schritt 2.1.8. Kippen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, die die Zellsuspension enthält langsam und sanft, zwei getrennte Schichten zu schaffen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 400 × g für 40 min bei RT mit minimalen Beschleunigungs- und ohne Bremse.
   11. Verwenden einer Transferpipette, die entstehende trübe Mittelschicht (buffy coat) enthält PBMCs in ein 50 ml konisches Röhrchen zu entfernen. Vermeiden Zeichnung andere klare Schichten darunter. Bringen Sie nicht mehr als 25 ml in jede 50 ml konischen Röhrchen.
   12. 25 ml kaltem Puffer, um die Zellen zu waschen (oder mehr, die gesamte Restvolumen der 50 ml konischen Röhrchen zu füllen). Zentrifugiere die Zellen bei 400 g für 10 min bei 4 ° C.
   13. Das Pellet mit 10 ml Laufpuffer. Diese enthält PBMCs. Zählen Sie die Zellen, und verwenden Sie immittelbar oder auf Eis zum Einfrieren.

3. Einfrieren und Auftauen der PBMCs

1. Zentrifugation der PBMCs, die in Schritt 2.1.13 für 10 min bei 400 x g gesammelt wurden.
2. Füllen Sie den Gefrierbehälter mit Isopropylalkohol pro Anweisungen des Herstellers. ACHTUNG: Isopropylalkohol ist brennbar und akut toxisch.
3. Das Pellet mit RPMI 1640-Medium (4 ° C), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Dies ist RPMI 1640 Einfriermedium. Das Pellet mit einer Menge an Gefriermedium, das in einer Suspension mit ca. 5 x 10 ⁷ Zellen / ml auf. Die Anzahl der Zellen zum Einfrieren kann abweichen.
4. Dispense 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 2 ml Kryoröhrchen und legen Sie die Kryoröhrchen im Gefrierbehälter. Stellen Sie das Gefrierbehälter mit Kryoröhrchen in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis O / N zu speichern und entfernen Sie die Kryoröhrchen und Transfer zum in einem GeschäftTiefkühlschranks zwischen -150 ° C bis -190 ° C.
5. Entfernen der Kryoröhrchen aus kryogenen Lagerung und Auftauen rasch unter leichtem Rühren in einem Wasserbad bei 37 ° C.
6. Die aufgetauten PBMCs in Kryoröhrchen sofortige Umsetzen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640 Komplettmedium (4 ° C), das 10% FBS, 1% Pen / Strep und 1% L-Glutamin. Der Inhalt des aufgetauten Kryoröhrchen sollte so schnell wie möglich übertragen werden, um eine maximale Lebensfähigkeit der Zellen ¹⁵ zu erhalten.
7. Zentrifugieren PBMCs bei 400 × g für 10 min.
8. Das Pellet mit 5 ml RPMI 1640 Komplettmedium und zählen Sie die Zellen.
9. Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch etablierte Verfahren wie Trypanblau-Ausschluss-Verfahren. Allgemein Zellviabilität bei dieser Methode ist zu 90 bis 95%. Die PBMCs können nun in Experimenten verwendet werden.

4. Cell Death Bestimmung

HINWEIS: Verdünnungen hier aufgeführten sind für die Zwecke dieses study. Die Verdünnungen können entsprechend geändert werden.

1. Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung, wie unten angegeben.
2. Verdünne WS-CM auf die folgenden Konzentrationen: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, und 5 ug / ml in gleichem Nikotin Einheiten (basierend auf der Nikotingehalt in WS-CM) ^12.
3. Verdünne Nikotin in RPMI-Medium mit den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
4. 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
5. Für die Zwecke dieser Studie bereiten zwei Sätze von Platten, wie oben. Decken Sie die Platten und Inkubation eine Platte für 24 Stunden und eine Platte für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2. Passen Zeitpunkte wie nötig.
6. Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt.
7. Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 & mgr; l 7-Aminoactinomycin D (7AAD) in jede Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min.
8. 100 l Laufpuffer zum Cluster Rohre. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und erwerben die Proben am Durchflusszytometer.
9. Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software.

5. EC ₅₀ Bestimmung

1. Die EC _{50 -Werte} von WS-CM und Nikotin werden von 7AAD-positive Färbung von PBMCs bestimmt.
2. Der EC ₅₀ Wert wird als konzentrierte definiertentration, bei der 50% der Zellen wurden in einem 24-Stunden-Test nicht mehr lebensfähig, und die Werte sind als & mgr; g equi-Nikotin-Einheiten / ml ausgedrückt.
3. Für die Zwecke dieser Studie wurden die EC _{50 -Werte} bestimmt als 1,56 & mgr; g / ml und 1,650 & mgr; g / ml für WS-CM und Nikotin auf.

6. Zytokine

HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden.

1. Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten.
2. Verdünne Nikotin an den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
3. 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / Vertiefung.Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
4. Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte bedeckt und schließlich Suspendieren der Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer und Wiederholen der Waschschritt noch einmal.
6. Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt.
7. Nach Zugabe von 200 ul von 10 ug / ml LPS Medium zu jeder Vertiefung.
8. Die Platte und Inkubation für 4 h, 24 h, 48 h oder 72 h bei 37 ° C und 5% CO _2. Einzustellen Inkubationszeiten wie nötig.
9. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min.
10. Nehmen Sie 175 ul des Überstands aus jeder Vertiefung und an einem Gefrierschrank bei -80 ° C, um die Tests in den Schritten 7 und 8 durchzuführen.

7. Cytometric Bead Array Assay

1. Tauen die Zellüberstände aus Schritt 6.10 und den Einsatz in der CBA Assay vorbereitet. Führen Sie die Cytometric Bead Array (CBA) Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.

8. IL-8-ELISA

1. Tauen die Zellüberstände aus Schritt 6.10 und den Einsatz in der IL-8-ELISA. Führen der ELISA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.

9. intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie

HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden.

1. Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten.
2. In der gleichen Platte, verdünnten Nikotin den folgenden Konzentrationen: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 und 4000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umwelt hazardous.
3. 100 l PBMCs in RPMI-Vollmedium suspendiert bei einer Konzentration von 1 × 10 ⁶ Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
4. Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt.
6. Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium auf die Platte, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt.
7. Bereiten Sie die Arbeitskonzentrationen von 2 ul / ml GolgiPlug und 10 ug / ml LPS mit RPMI Komplettmedium und 200 ul in jede Vertiefung.
8. Inkubieren der Platte für 6 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
9. Am Ende von Schritt 9.8, Waschen der Zellen mit Laufpuffer (4 ° C) und Schleudern bei 300g für 3 min bei 4 ° C.
10. 100 l Cytofix in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 4 ° C.
11. Die Zellen werden 3 Mal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben.
12. Hinzufügen 45 ul 1x Cytoperm zu jeder Vertiefung, gefolgt von 5 ul jeder einer der folgenden Antikörper zu jeder Vertiefung: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min.
13. Waschen Sie die Zellen zweimal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) und einmal mit Laufpuffer (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben.
14. Die Zellen werden mit 200 ul 2% igem Paraformaldehyd (4 ° C). Übertragen Sie die Zellen in 12 × 75 mm Rohre, und die Proben auf Flow Cytometer analysiert. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ätzend, akut giftig und gesundheitsschädlich.

10. K562 Töten Assay

HINWEIS: K562 Zellen sollten kultiviert werdenin der Kultur bei 37 ° C und 5% CO ₂ mit RPMI Komplettmedium, bis sie bis zu 80% Konfluenz vor dem Assay.

1. Bereiten Sie eine 5 mM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) Stammlösung durch Zugabe von 18 & mgr; l DMSO in das Fläschchen.
2. Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung zu den gewünschten gleichwinklig Nikotineinheiten oder Nikotinkonzentrationen für jede Vertiefung zu erzielen. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
3. 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium in einer Konzentration von 1,5 x 10 ⁶ Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen, die mit WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
4. Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Waschen Sie die K562-Zellen durch Zugabe von 10 ml DPBS und Zentrifuge bei 400 × g für 8 Minuten bei RT.
6. Die Zellen mit 10 ml DPBS und zählen Sie die K562-Zellen.
7. Bereiten CFSE working Lösung durch Zugabe von 1 ul CFSE-Stammlösung zu 1 ml DPBS.
8. 1 ml des CFSE-Arbeitslösung in 1 ml der K562-Zellsuspension, die 1 - 2 x 10 ⁷ Zellen. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT.
9. Sofort im 200 ul FBS. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT.
10. 10 ml RPMI Komplettmedium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Entfernen Sie den Überstand RPMI und brechen die Pellets und die Zellen werden mit 10 ml RPMI Komplettmedium und zählen Sie die CFSE-markierte K562-Zellen.
12. Durch Zentrifugieren der Platte bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der PBMCs. Saugen Sie den Überstand durch Dekantieren der Flüssigkeit. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte. Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium und ein weiteres Mal wiederholen Waschschritt.
13. Hinzufügen CFSE-markierte K562-Zellen in einem Verhältnis von 1:15 (100.000 K562s: 1.5 x 10 ⁶ PBMCs) in jede Probenvertiefung der PBMC Platte und weiteren incubate 5 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
14. Durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der Zellmischung. Saugen Sie den Überstand durch die Flüssigkeit verworfen. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte.
15. Fügen Sie 200 ul des Laufpuffers und wiederholen Sie die in Schritt 10,14 noch einmal beschrieben Waschschritt.
16. Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 ul 7AAD zu jeder Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min.
17. Füge 100 ul Laufpuffer in jede Vertiefung und übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und Zytometer erwerben die Proben auf Fluss.
18. Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positive und CFSE-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software.

Ergebnisse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (vier Spenderproben) dargestellt. Des Studenten-t-Tests zwischen den behandelten und unbehandelten Kontrollproben wurde unter Verwendung von Excel-Software sowie die T-Testvergleiche für alle Behandlungen mit ihren entsprechenden Kontrollen. Die statistische Signifikanz wurde angegeben: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.

Um den Effekt der Einwirkung von WS-CM und Nikotin zu messen, wurden PBMCs mit verschieden...

Diskussion

Wir und andere haben vorher gezeigt, dass die Behandlung der PBMCs mit TPPs drückt mehreren Antworten, von denen die Expression und Sekretion von Zytokinen und funktionellen Maßnahmen wie Ziel zelltötende ^14. Die in der bisherigen Arbeit beschriebenen experimentellen Methoden erfordern längere Inkubationszeiten und waren bescheiden in der Größe ^14. Angesichts der potentiellen Anwendungen dieser attraktiven ex vivo Modell für Grundlagen- und angewandten Forschung haben wir untersucht, ob ei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12 x 75 mm Röhrchen	BD Falcon	352058
15 ml konische Röhrchen	Corning	430790
2 ml Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C-S
3R4F Referenzzigaretten	Univ. of Kentucky, College of Agriculture	3R4F
50 ml konische Röhrchen	Corning	430828
500 ml Flasche	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96-Well-Flachbodenplatte	Termo Nunc	439454
96-Well-Rundbodenplatten	BD Falcon	353077
Zellkulturhaube	Thermo Scientific	1300 Series A2
Zentrifuge	Eppendorf	58110R
CFSE	Molekulare Sonden Life Technologies	C34554
Cluster-Röhrchen	Corning	4401	Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, krebserregend
Cytofix/Cytoperm (Permwash)	BD Biosciences	555028	Entzündliches
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FCAP Array	BD Biosciences	652099	Software analysiert CBA-Daten
Filtereinheit	Nalgene	156-4020
Durchflusszytometer	BD Biosciences	FACS Canto II	8 Farben, bei Ex 405 und Em 785.
Durchflusszytometer	BD Biosciences	FACS Calibur	4 Farben bei Ex 495 und Em 785.
Software für die Durchflusszytometrie-Analyse	Tree Star	FlowJo
Gefrierbehälter	Nalgene	5100-0001	Enthält DMSO, Reizstoff
GogliPlug	BD Biosciences	555029	Karzinogen, reizend, ätzend
H2SO4	Sigma-Aldrich	339741
Humanes entzündliches Zytokin Kit	BD Biosciences	551811
IFN-γ V-500 Antikörper	BD Horizon	561980	Hautsensibilisator
IL-8 ELISA Kit	R and D Systems	DY208
Isolationspuffer	Isolymphe, CTL Scientific Corp.	1114868	Entzündbare Flüssigkeit, reizend
Isopropylalkohol	Sigma-Aldrich	W292907
L-Glutamin	Gibco Life Technologies	25030-081
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
MIP1-α PE Antikörper	BD Pharmingen	554730	Akute Toxizität, oral
Monensin	Sigma-Aldrich	M5273
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Nikotin	Sigma-Aldrich	N3876	Akute Toxizität, Umweltgefahr
Parafilm	Bemis	" M"
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Entzündlich, Hautreizung
Stift/Streptokokken	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Laufpuffer	MACS Laufpuffer, Miltenyi Biotech	130-091-221
Th1/Th2 CBA Kit	BD Biosciences	551809
TNF-α Alexa Fluor 488 Antikörper	BioLegend	502915
Transferpipette	Fisher Scientific	13-711-20
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503