Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen von zwei (oder mehr) synaptisch verbunden Neuronen (gepaart Aufnahmen) in akuten Hirnschnittpräparate mit gleichzeitiger intrazellulären Biocytin Füllung ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Mit diesem Verfahren ist es möglich, durch ihre Morphologie und elektrophysiologische Antwort-Muster zu identifizieren und zu charakterisieren sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen. Gepaart Aufnahmen erlauben die Untersuchung der Verbindungsmuster zwischen diesen Neuronen sowie die Eigenschaften von sowohl chemischen und elektrischen synaptischen Übertragung. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der erforderlich ist, um zuverlässige gepaart Aufnahmen zusammen mit einer optimalen Erholung des Neurons Morphologie zu erhalten Verfahren. Wir beschreiben, wie Paare von Neuronen über chemische Synapsen oder Gap Junctions verbunden sind in Hirnschnittpräparate identifiziert. Wir werden darlegen, wie Nervenzellen wieder aufgebaut, um ihre 3D-Morphologie des dendrit erhaltenic und axonalen Domain und wie synaptische Kontakte identifiziert und lokalisiert. Wir diskutieren auch die Vorbehalte und Einschränkungen des gekoppelten Aufnahmetechnik, insbesondere solche mit dendritischen und axonalen Verkürzungen bei der Herstellung von Hirnschnitten verbunden, da diese stark beeinflussen Konnektivität Schätzungen. Jedoch wegen der Vielseitigkeit der gepaarten Aufzeichnungs Ansatz wird ein wertvolles Werkzeug bei der Charakterisierung verschiedener Aspekte der synaptischen Übertragung an identifizierten neuronaler Schaltkreise im Gehirn sein.
Einleitung
Neuronaler Schaltkreise zwischen zwei synaptisch gekoppelt Neuronen sind die Bausteine von großer Netzwerke im Gehirn und sind die Grundeinheiten der synaptischen Informationsverarbeitung. Eine Voraussetzung für die Charakterisierung solcher neuronaler Schaltkreise ist, um die Morphologie und funktionellen Eigenschaften sowohl der prä- und postsynaptischen Neuronen Partner, die Art der synaptischen Verbindung (en) und dessen Aufbau und Funktionsmechanismus kennen. In vielen Studien synaptischer Verbindungen zumindest eines der Neuronen in einer Mikroschaltung ist nicht gut charakterisiert. Dies resultiert aus den relativ unspezifisch Stimulationsprotokolle....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über den Schutz der Tiere, des Deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz) und den Richtlinien des Bundesverbandes der europäischen Versuchstierkunde durchgeführt.
1. Set-up für die Elektrophysiologie
Vor Beginn gepaart Aufnahme muss ein Elektro Set-up gebaut werden. Eine kurze Zusammenfassung, wie eine solche Einrichtung zusammengesetzt ist wie folgt:
- Installieren eines Antischwingungstisches, auf dem das Mikroskop die Manipulatoren und alle anderen Geräte platziert werden.
HINWEIS: Vibration oder jede andere Ar....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Gepaart Aufnahmen sind das Mittel der Wahl für eine eingehende Charakterisierung von morphologisch identifiziert uni- oder bidirektional synaptischen Verbindungen sowie Gap Junction (elektrische) Anschlüsse (Abbildung 1). Ein Beispiel für ein gekoppeltes Aufzeichnungsschicht 4 in der somatosensorischen Kortex Lauf ist in 1A gezeigt. Sowohl unidirektionale exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen (1B, C) charakterisiert werden. Weiterhin gepaart Aufna.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Gekoppelte Aufnahmen von synaptisch gekoppelt erregenden und / oder hemmenden Neuronen eine sehr vielseitige Vorgehensweise für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise erlauben es, synaptische Verbindungen zwischen Neuronen-Typen schätzen, sondern ermöglicht auch die Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Verbindung und der Morphologie der prä- und postsynaptischen Neuronen. Außerdem Agonisten und / oder Antagonisten kann leicht an Neuronen im Schnittpräparate angewendet we.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken allen Mitgliedern der Gruppe 'Funktion neuronaler Mikroschaltkreise' am Institut für Neurowissenschaften und Medizin, INM-2, Forschungszentrum Jülich und der Gruppe 'Funktion kortikaler Mikroschaltkreise' in der Klinik für Psychiatrie, Psychotherapie und Psychosomatik, Medizinische Fakultät, JARA, RWTH Aachen für die fruchtbaren Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der DFG-Forschergruppe zur Fassrindenfunktion (BaCoFun) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Verstärker | HEKA | EPC 10 USB Triple | mit 2 - 3 Vorverstärkern |
| Mikroskop | Olympus BX51WI | mit 2 Kameraanschlüssen, einem 4X Objektiv und einem 40X Wasser-Immersionsobjektiv | |
| Kamera | TILL Photonics | VX55 | Infrarot CCD Kamera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | mit einem motorisierten x-y-Tisch und einer motorisierten Fokusachse für das Mikroskop |
| Mikromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z Manipulatoren für 2 - 3 Vorverstärker |
| Faradayscher Käfig | Luigs & Neumann | ||
| Anti-Vibrations-Tisch | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Mikrotom | Microm International | HM650V | |
| Mikropipettenabzieher | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida System | Mikrohellfeld | mit Neurolucida und Neuroexplorer Software |
Referenzen
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of bi....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
