Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen - Kanäle und Transporter

Zusammenfassung

Proteoliposomen werden verwendet, um gereinigte Kanäle und Transporter zu untersuchen, die in einer gut definierten biochemischen Umgebung rekonstituiert werden. Ein experimentelles Verfahren zur Messung des durch diese Proteine vermittelten Ausflusses wird veranschaulicht. Die Schritte zur Präparation von Proteoliposomen, zur Durchführung der Aufzeichnungen und zur Analyse der Daten zur quantitativen Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des rekonstituierten Proteins werden beschrieben.

Zusammenfassung

Die letzten 15 Jahre waren gekennzeichnet durch eine Explosion der Fähigkeit, Membranproteine aus prokaryotischen Organismen sowie aus Eukaryoten zu überexprimieren und zu reinigen. Dieser Anstieg ist vor allem auf den erfolgreichen Vorstoß zurückzuführen, strukturelle Informationen über Membranproteine zu erhalten. Die Fähigkeit, diese Proteine funktionell abzufragen, hat sich jedoch nicht im gleichen Tempo weiterentwickelt und ist oft auf qualitative Assays von begrenztem quantitativen Wert beschränkt, wodurch die mechanistischen Erkenntnisse, die sie liefern können, eingeschränkt werden. Es wird ein Assay zur quantitativen Untersuchung der Transportaktivität von rekonstituierten ^Cl-Kanälen bzw. Transportern beschrieben. Der Assay basiert auf der Messung der Effluxrate von Cl^- aus Proteoliposomen nach Zugabe des K⁺-Ionophors Valinomycin zur Shuntierung des Membranpotentials. Eine ionenempfindliche Elektrode wird verwendet, um den zeitlichen Verlauf des Ionenausflusses von Proteoliposomen zu verfolgen, die mit dem gewünschten Protein rekonstituiert wurden. Die Methode eignet sich hervorragend für mechanistische Studien, da sie die quantitative Bestimmung von Schlüsseleigenschaften des rekonstituierten Proteins ermöglicht, wie z.B. seine einheitliche Transportrate, den Anteil des aktiven Proteins und die Molekülmasse der funktionellen Einheit. Der Assay kann auch verwendet werden, um die Wirkung von niedermolekularen Verbindungen zu bestimmen, die das rekonstituierte Protein direkt hemmen/aktivieren, sowie um die modulatorischen Effekte der Membranzusammensetzung oder lipidmodifizierender Reagenzien zu testen. Wo immer möglich, erwies sich ein direkter Vergleich zwischen den mit dieser Methode erzielten Ergebnissen als gut übereinstimmend mit denen, die mit elektrophysiologischen Ansätzen erzielt wurden. Die Technik wird anhand von CLC-ec1, einem CLC-Typ H⁺/^{Cl-Austauscher}, als Modellsystem veranschaulicht. Der Efflux-Assay kann zur Untersuchung jedes ^Cl-leitenden Kanals/Transporters verwendet werden und kann mit minimalen Änderungen angepasst werden, um jedes ionentransportierende Protein zu untersuchen.

Einleitung

In den letzten zwei Jahrzehnten die Fähigkeit, Überexpression und Reinigung von Membrantransportproteine ​​hat sich dramatisch erhöht: Ionenkanäle, primäre und sekundäre Transporter werden nun routinemäßig von heterologen Expressionssystemen sowie natürlichen Quellen gereinigt. Neue Wege in der Ausdrucks überwachen, zu verbessern und die Extraktion und erhöhen die Stabilität dieser Proteine ​​werden ständig weiterentwickelt ^1-5. Diese technologischen Durchbrüche haben dazu beigetragen, das Auslösen der Explosion der Atomebene Informationen über die Struktur von Membranproteinen, die wiederum verbessert das Verständnis der strukturellen Grundlagen ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu können wir auch die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Proteine ​​Sonde nicht mit der gleichen Geschwindigkeit zu erhöhen, so dass in einigen Fällen hochauflösende Strukturinformation durch qualitative Funktionsdaten begleitet, wodurch die Fähigkeit zur quantitativen Test strukturbasierte Prognosen einschränkend. Daher ist die development quantitativer und verallgemeinerbare funktionellen Tests ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der mechanistischen Grundlagen von Membranproteinfunktion.

Hier beschreiben wir eine Auslauf Assay, der verwendet werden kann, wichtige Funktionseigenschaften gereinigt und wiederhergestellt Cl quantitativ zu bestimmen ^- Kanäle und Transporter. Die Prinzipien des Assays Basiswert kann auf eine Vielzahl von Transportsystemen, sowie auf nichtIonenTransportProteine ​​verallgemeinern. Kanal / Transporter in Gegenwart eines großen Cl ^{- -} ​​Liposomen werden mit gereinigtem Cl rekonstituiert Gradienten (1A, B). Cl ^- Ausfluß wird durch die Zugabe eines Ionophors initiiert, um für Gegenionenfluss zu ermöglichen, in unserem Fall der K ⁺ Ionophor Valinomycin, der die Spannung von der etablierten Cl Shunt ^- Gradienten und den ursprünglichen Membranpotential auf das Gleichgewichtspotential von K ^{+ 6,7.} Ohne ter Ionophor keine signifikante Netto Cl ^- Efflux auftritt, wie es durch die Erzeugung eines Transmembranpotentials verhindert. ^- Efflux und f _0, die Fraktion von Liposomen keine aktive Protein enthaltenden τ die Zeitkonstante von Cl: Die Daten werden quantitativ durch zwei messbare Parameter (Abbildung 1C) beschrieben. Von τ und f ₀ die unitäre Cl ^- Transportgeschwindigkeit kann der Anteil von aktiven Proteinen und die Molekularmasse des aktiven Komplexes ⁸ abgeleitet werden. Tauscher bekannter Struktur und Funktion ^- Die Technik wird hier mit Proteo mit CLC-ec1, einem gut charakterisierten CLC-Typ H ⁺ / Cl wiederhergestellt dargestellt. Dieser Assay wird leicht um Kanäle oder Transporteure mit unterschiedlicher Ionenselektivität, oder deren Aktivität von der Anwesenheit von Spannung und / oder Liganden verallgemeinert. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob kleine Moleküle unmittelbar auf die rekonstituierte Protein,um die Wirkungen dieser Verbindungen und wie die Zusammensetzung der Membran oder Lipidmodifizierungsreagenzien auf die Funktion der rekonstituierten Kanäle und Transporter zu quantifizieren.

Protokoll

1. Lipid Vorbereitung

1. Aliquot die gewünschte Menge Lipide in eine klare Glasröhre. Du Siehst. coli polaren Lipidextrakt, aber die meisten Lipidzusammensetzungen verwendet werden. Wenn die Lipide in Form von Pulver, resuspendieren sie in Chloroform bis zu einer Konzentration von 20 mg / ml. Trocknen der Lipide bei RT unter N _{2 -Gas,} bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist.
2. Resuspendieren der Lipide in Pentan und trocknen Sie es wieder einen stetigen Strom von Gas N ₂ zu übrig gebliebenen Spuren von Chloroform zu entfernen. Trocken, bis alle Lösungsmittel verdampft. Während des Trocknens, stark drehen das Rohr, so dass das Lipid in einer gleichförmigen Film, der die untere Drittel des Rohres anstelle einer Bildung einer dichten Masse am Boden verteilt.
3. Hinzufügen der Rekonstitutionspuffer enthält Detergens (300 mM KCl, 50 mM Zitronensäure, 25 mM K ₂ HPO _4, pH 4,5, 35 mM CHAPS), um die Lipide zu lösen. Benutzen Sie anderen milden Reinigungsmitteln für diesen Schritt, wenn das Protein ist schlecht, tolerant zu CHAPS.
4. Resuspend die Lipide zur Klarheit mit einem Wasserbad Sonicator. Tauchen Sie den Schlauch in der Mitte des Wassers Ultraschallbad bei maximaler Leistung in kurzen (30 sec-1 min) mit kurzen Impulsen (30 sec-1 min) unterbricht. Die Lösung sollte klar sein.
   HINWEIS: Die endgültige Grad an Klarheit erreicht, hängt von der spezifischen verwendeten Lipid-Zusammensetzung. Einige von Charge zu Charge Variation in diesem Schritt auch bei nominell identischen Lipiden ist ebenfalls möglich. Resttrübung aufgrund der Lichtstreuung durch große Partikel in der Suspension, welche durch Zentrifugation entfernt werden kann.
5. Inkubieren der resuspendierten Lipide bei RT für 20-60 min.

2. Proteoliposom Bildung

HINWEIS: Verschiedene Strategien können verwendet werden, um das Detergens-solubilisierten Protein in Liposomen einfügen. Für CLC-ec1 Dialyse funktioniert gut und ist daher das Mittel der Wahl ^6,9,10.

1. Füge das gereinigte Protein, das gewünschte Protein-zu-Lipid (P / L) Verhältnis (in ug o ausgedrückt f Protein / mg Lipid). Die Wahl von P / L-Verhältnis hängt von dem Zweck des Experiments.
   1. Wenn es das Ziel ist es, die Aktivität des Proteins von Interesse zu bewerten, zu rekonstituieren bei hohen P / L's, um das Signal zu maximieren, da jedes Liposom mehrere Kopien des Proteins enthält. Um die Aktivität und / oder einheitlichen Transportrate des Proteins zu quantifizieren, zu rekonstituieren in einer Poisson Verdünnungsregelung bei niedrigen P / L's, so daß jedes Vesikel enthalten durchschnittlich 1 Protein. Siehe Schritt 7 und Diskussion für eine tiefergehende Analyse, wann die einzelnen Regime zu nutzen.
2. Um die optimale P / L-Werte für die verschiedenen Schemata zu bestimmen, führen eine vollständige Titration der Aktivität als Funktion der Proteinkonzentration ^8,11-13. Jedoch für jedes Protein, für das das Molekulargewicht (MW, in kDa exprimiert) der aktiven Einheit ist bekannt folgende P / L-Werte als Anfangs guesstimates verwendet werden:
   pg "/>
   
3. Geladen, die das Protein und Lipidgemisch in eine vorbefeuchtete Dialyserohr oder eine Kassette. Platzieren der Dialyseeinrichtung in einem Becherglas mit 500-1,000x das Volumen der Lipid Rekonstitutionspuffer (dh 1 l Puffer für 1 ml Lipid Resuspension) unter vorsichtigem Rühren.
   1. Ändern Puffer 3-4 mal im Abstand> 3 Std. Bei jeder Lösung Wechsel, waschen Sie die Kassette / Schläuche und das Becherglas mit destilliertem Wasser und füllen Sie den Becher mit frischem Rekonstitutionspuffer. Fügen Sie 1-2 O / N Intervalle für die Lösung zu ändern. Die genaue Anzahl und die Dauer der Lösung ändert sich abhängig von der genauen Lipid und Detergentien verwendet.
4. Nachdem der letzte Schritt ist, entfernen Sie die Liposomen aus dem Dialysegefäß, aliquotieren sie in Rohre und Flash frieren sie in flüssigem N ₂ oder Einfrieren bei -80 ° C.

3. Aufnahme Set-up

Hinweis: Die Aufnahme-Setup (Abbildung 2A) besteht aus zwei Kammern (Flachboden-Zylinder, ~ 3-4 ml Volumen), eine Cl ^- (siehe unten) Elektrode, einem pH-Meter mit einem Analog- oder digitale elektrische Ausgang, einen Digitalisierer und einen Computer mit einem entsprechenden Erfassungssoftware.

1. Verbinden der Cl ^- Elektrode mit dem pH-Meter, das Ausgangssignal des pH-Meter auf dem Digitalisierer die an den Computer angeschlossen ist. Legen Sie die Referenzelektrode in einer Kammer und die Umkodierung Draht in die andere (2B).
   HINWEIS: Die Polarität der Leitungen ist korrekt, wenn AV _Cal (siehe Schritt 6.4 und 7.2) ist positiv.
2. Legen Sie die Kammern auf einer Rührplatte mit einem Rührstäbchen in den Aufnahmeraum (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, der Rührstab nicht die Elektrode berühren.
3. Schließen der Kammern mit einem Agarbrücke (2B) (100 mM KCl und 2% Agarose). Bewahren Sie die Agar-Brücken in 100 mM KCl.

4. Vorbereitung der Cl ^- Elektroden

1. Nehmen Sie einen alten und -possibly- nicht funktionierende pH-Elektrode. Brechen Sie die Glas-Beschichtung, um die Silberdrähte vollständig offenbaren.
2. Die Beschichtung vorsichtig aus der Silberdrähte mit einem Skalpell. Reinigen Sie die Drähte mit reichlich H ₂ O und EtOH.
3. Platz in einer gesättigten Lösung von FeCl ₃ (oder Bleichmittel), bis Drähte mit einem einheitlichen dunklen Mantel AgCl bedeckt.

5. Herstellung von unilamellaren Vesikeln

1. In der Nacht vor den Experimenten, schwellen 1 g Sephadex G-50-Perlen in 15 ml externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K ₂ SO _4, 25 mM Zitronensäure, pH 4,5) unter leichtem Schütteln (nicht rühren) für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Jedes Experiment erfordert ~ 3 ml geschwollene Perlen. Halten Sie die geschwollenen Perlen bei 4 ° C für ein paar Tage in den meisten.
2. Während die Liposomen bei RT aufgetaut, gießen Sie in jeder Spalte ~ 3 ml geschwollene G-50-Perlen. Lassen Sie sie trocknen durch Schwerkraft bei RT; Dies dauert in der Regel 1-2 min.
3. Bereiten unilamellare Vesikel durch Extrudieren des Proteo 11 Mal durch ein Mini-Extruder mit einer 0,4 m Teflon-Cutoff.
4. Die Säule in einem Kunststoffrundrohr. Drehen Sie die Spalten, um überschüssige Lösung zu entfernen. Zentrifugieren Sie für 20 bis 30 s bei 1400 x g in einer klinischen Zentrifuge.
5. Durchfluss verwerfen, statt Spalte in einer 13 x 100 mm Glasröhrchen und fügen Sie 100 ul der extrudierte Vesikel an der Säule. Spin Säule für 1 min bei 500 xg in einer klinischen Zentrifuge.
6. Sammeln ~ 200 ul Durchströmung zu dem Aufzeichnungskammer in Schritt 6.5 hinzugefügt wird.

6. Efflux Mess

1. Je 2 ml 100 mM KCl in der Referenz (Masse) Kammer und 1,8 ml der externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K ₂ SO _4, 25 mM Citronensäure, pH 4.5) zur Aufnahme Kammer. Der leichte osmotischen Ungleichgewicht zwischen der internenund externe Lösungen wirkt sich nicht auf
2. Starten Sie die Aufnahme-Programm. Lassen Sie die Grundlinie ins Gleichgewicht kommen, dies kann einige Minuten dauern.
3. Sobald das Signal eine stabile Basislinie (die Liposomen bereit sind und die Spalten trocknen) erreicht, startet die Aufnahme (3A).
4. Werden 15 ul einer 10 mM KCl-Lösung, um das System (2A) zu kalibrieren.
5. In Liposomen. Von Proteoliposomen (3A) ^- ein kleiner Sprung vielleicht aufgrund einer unvollständigen Entfernung der externen Cl sichtbar. Warten Sie, bis die Grundlinie stabilisiert.
6. Hinzufügen Valinomycin (1 ul 1 mg / ml in EtOH) zum Ausströmen (3A) zu initiieren.
7. Lassen Sie die Auslauf laufen ihr zeitlicher Verlauf, bis es Plateaus (3A).
8. Hinzufügen von 40 ul von 1,5 M β-Octylglucosid (β-OG) in dem externen Puffer alle Liposomen (3A) zu lösen, hergestellt. Beenden Sie die Aufnahme.

7. Daten Analyse

1. Exportieren Sie die Trace-Datei von der im ASCII- oder Text-Format und importieren Sie sie in die Analyse-Programm der Wahl.
2. Messen Sie die Spannung an den folgenden Punkten (3A):
   Zu Beginn der Aufnahme (V _0);
   Nach Zugabe des Eichpulses (V _cal);
   Nach der Zugabe der Liposomen (V _lipo);
   Am Ende des Auslauf (V _fin);
   Nach Zugabe von Reinigungsmittel (V _ges);
   Grundlinie die Spannungen so dass V ₀ = 0 ist.
3. Verwenden Sie die Nernst-Planck-Gleichung, um den experimentellen Wert bestimmen durch Messung
   
   Wo Vol _Cal ist das Volumen der Kalibrierungspuls in ul, 1.800 wird das Kammervolumen zu Beginn des Experiments in exprimiert1, l, [Cl] _{cal / in} sind die Cl ^- Konzentrationen der Kalibrierungsimpuls und der externen Puffer in mM und AV _cal ist der Sprung in mV nach dem Kalibrierungsimpuls gemessen.
   ANMERKUNG: Diese empirische Bestimmung α dient drei Zwecken: sie gewährleistet, dass das System korrekt reagiert, bietet ein Maß für die Konsistenz der Reaktion des Instruments zwischen den Experimenten als auch zu prüfen, dass keine Fehler in der Lösung Herstellung hergestellt.
4. Berechnen Sie die Cl-Konzentrationen nach jedem Schritt wie folgt:
   
   
   
   Der Faktor 3/400 kommt von der Verdünnung der 15 & mgr; l Kalibrierungspuls in die 2.000 & mgr; l Endvolumen.
5. Calculaßen die Veränderungen in [Cl] bei jedem Schritt, ΔCl _{Lipo / end / ges.}
6. Konvertieren V (t) in Cl (t) mit
   
   Die [Cl] Werte direkt zu bestimmen, an den kritischen Punkten und vergleicht sie mit den berechneten Werten als eine interne Kontrolle.
7. Normalisieren der Spur, so dass das Cl _rel ^Lipo = 0 und Cl _rel ^tot = 1
   
8. Den Auslaufzeit natürlich der folgenden Gleichung:
   
   Wobei L die Rate der Cl ^- Leck, die experimentell durch Messung bestimmt wird Cl ^- Efflux aus proteinfreien Liposomen unter den gleichen Bedingungen und τ hergestellt wird die Zeitkonstante des Prozesses.
9. Berechnen v, die Anfangsgeschwindigkeit:
   
   Wo ΔCl _Rippe in millimolaren ausgedrückt und V das Volumen der Kammer in ul.
10. Berechnen Sie die Transportgeschwindigkeit / Leitwert
    
    Wobei p der P / L, MW das Molekulargewicht des aktiven Komplexes, ausgedrückt in kDa

Ergebnisse

Wir beschreiben eine detaillierte und robuste Protokoll zu messen Cl ^- Transport von gereinigtem CLC-ec1, einem prokaryontischen CLC-Typ H ⁺ / Cl vermittelt ^- Tauscher, in Liposomen rekonstituiert. Eine schematische Darstellung des Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt Proteoliposomen mit gereinigtem CLC-EC1 und mit hohen internen Cl rekonstituiert. ^- In einer Badlösung, die geringe Cl taucht ^-. Unter diesen Bedingungen net Cl ^- Ausf...

Diskussion

Transport von gereinigtem anionenselektive Kanäle oder Transporter in Liposomen rekonstituiert vermittelt ^- haben wir ein ausführliches Protokoll zu messen Cl beschrieben. Das verwendete Beispiel war der prokaryotischen H ⁺ / Cl ^- Tauscher CLC-ec1. Jedoch kann die Methodik leicht angepasst, um Kanäle durch Liganden ^{12,13,15, 11,12} Spannung oder sportlich verschiedenen anionischen Selektivität ^15,16 durch Ersetzen des Ag gated untersuchen: AgCl-Elektrode mit einem fü...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Liposomikator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Tischgerät	Thermo Scientific
Orion Research Modell 701A Digitales pH-mV-Messgerät			Diese finden Sie bei Ebay.
Nicht funktionierende pH-Sonde			Jede pH-Messsonde mit silbernen Drähten funktioniert. Die Glas-/Kunststoffbeschichtung muss entfernt und die Drähte gereinigt werden.
DI-710 Datenlogger	DATAQ-Instrumente
WinDAQ-Erfassungssoftware	DATAQ instruments
Pierce Einweg-Kunststoffsäulen, Schwerkraftfluss, 2 ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Kulturröhrchen, Einweg, Borosilikatglas	Kimble Chase	73500-13100
Extruder-Set mit Halter/Heizblock	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer