Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung der Menge und Verteilung von Metallen in einer Probe mittels Synchrotron-Röntgenfluoreszenz. Wir konzentrieren uns auf adhärente Zellen und beschreiben die chemische Fixierungsmethode zur Vorbereitung dieser Probe. Anschließend beschreiben wir, wie die Probe mit Synchrotron-Röntgenstrahlen eingefasst und abgebildet wird.

Zusammenfassung

Die Röntgenfluoreszenzbildgebung ermöglicht es uns, die räumliche Verteilung und Konzentration mehrerer Elemente gleichzeitig über große oder kleine Probenbereiche zerstörungsfrei zu messen. Es wurde in vielen Bereichen der Wissenschaft angewendet, darunter in den Materialwissenschaften, in den Geowissenschaften, in der Erforschung von Werken des kulturellen Erbes und in der chemischen Biologie. Im Falle der chemischen Biologie ermöglicht die Visualisierung der Metallverteilungen innerhalb von Zellen beispielsweise, sowohl natürlich vorkommende Metallionen in den Zellen als auch exogen eingeführte Metalle wie Medikamente und Nanopartikel zu untersuchen. Aufgrund der vollständig hydratisierten Natur fast aller biologischen Proben stellt die Kryofixierung mit anschließender Bildgebung unter kryogener Temperatur die ideale derzeit verfügbare Bildgebungsmodalität dar. Unter den Umständen, unter denen eine solche Kombination nicht leicht zugänglich oder praktikabel ist, bleibt die chemische Fixierung auf Aldehydbasis nützlich und manchmal unvermeidlich. Dieser Artikel beschreibt so detailliert wie möglich die Präparation von adhärenten Säugetierzellen durch chemische Fixierung für die Röntgenfluoreszenzbildgebung.

Einleitung

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern ^1. Dadurch entsteht ein "Loch" in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein geg....

Protokoll

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte

1. Handhabung von Siliciumnitrid (Si ₃ N ₄₎ Fenster.
   1. Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand.
   2. Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. Andernfalls können die Fenster durch die Pinzette oder gebrochen werden wegfliegen von ihnen während der nachfolgenden Schritte.
   3. Entfernen Sie das....

Ergebnisse

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente - was anzeigt, daß Fi.......

Diskussion

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie ^26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der chemische.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Siliziumnitrid-Fenster	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Vereinigtes Königreich	SiRN-5.0-200-2.0-200. Ordnen Sie nach Größe. Membrangröße: 1,5 mm x 1,5 mm. Dicke: 200  Nm. Rahmengröße: 5  mm x 5 mm. Dicke des Rahmens: 200 μm.	Alternative Quelle: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse Tpinez	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultrafeine Pinzette
Gummigittermatte	Elektronenmikroskopie Sciences, Postfach 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Runde Gittermatte
Essigsäure	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	konzentrierte Essigsäure
PIPES Puffer	in SpurenmetallqualitätSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	fester PIPES Puffer
Formaldehyd-Stammlösung	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10 ml Ampullen mit 20% wässrigem Paraformaldehyd