Methodenartikel

Ein chirurgischer Eingriff zur Resektion der Maus Rib: Ein Modell für Großlangknochenreparatur

DOI:

10.3791/52375

⸱

21. Januar 2015

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1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, erfolgreich einen Teil des Knochens aus der Rippe einer Maus zu resezieren. Das Verfahren wurde als Modell entwickelt, um die großflächige Reparatur langer Knochen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt die Forscher ein neues Modell für große Knochenreparatur unter Verwendung der Maus Rippe. Das Verfahren beschreibt die folgenden: Vorbereitung des Tieres für die Chirurgie, Öffnen des Brustkörperwand, indem die gewünschte Rippe aus den umliegenden Zwischenrippenmuskeln, Ausschneiden des gewünschten Abschnitt der Rippe, ohne einen Pneumothorax, und Schließen der Schnitte. Im Vergleich zu den Knochen des Gliedmaßenskelett, die Rippen sind sehr zugänglich. Darüber hinaus ist kein interner oder externer Fixateur notwendig, da die benachbarten Rippen eine natürliche Fixierung. Die Operation nutzt kommerziell verfügbare Angebot, ist einfach zu lernen, und durch das Tier gut vertragen. Das Verfahren kann mit oder ohne Entfernung des umgebenden Knochenhaut erfolgen, und somit ist der Beitrag der Knochenhaut zu reparieren beurteilt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass, wenn die Knochenhaut gehalten wird, in 1 tritt robust Reparatur - 2 Monate. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieses Protokolls wirdFörderung von Forschung in die Rippe Reparatur und dass die Ergebnisse wird die Entwicklung von neuen Wegen, um die Knochenreparatur in anderen Orten rund um den Körper zu stimulieren, zu erleichtern.

Einleitung

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Schwächenden Skelettverletzungen, chronische Arthrose, und die schwere Probleme mit der Wiederherstellungschirurgie verbunden Auswirkungen der wirtschaftlichen Produktivität, Familie Wohlbefinden und Lebensqualität. Während kleine Pausen und Läsionen können ziemlich gut heilen, sind die Menschen nicht in der Lage zu reparieren große Defekte und muss daher auf rekonstruktive Eingriffe angewiesen, um Struktur und Funktion wiederherzustellen. Die Rekonstruktion kann es sich um allogene Transplantate oder heterogeneic, morcellized Knochen implantiert Gerüste oder Distraktionsosteogenese. Leider gibt es nicht nur hartnäckig Morbidität Faktoren mit diesen Behandlungen aber die ursprüngliche Festigkeit des reparierten Knochens selten erreicht verbunden. So werden neue klinische Ansätze erforderlich.

One-way, um innovative Methoden, um Segmentdefekte zu behandeln entwickeln zu Situationen, in denen groß angelegte Reparatur kommt in der Natur zu studieren. Amphibien können bekanntlich Skelettelemente zu regenerieren, während Säugetiere sind als begrenzt in thist die Fähigkeit. Da jedoch der Beginn des 20. Jahrhunderts, einige wenige Berichte über die Regeneration der menschlichen Rippe wurden veröffentlicht hindeutet, dass Menschen nicht so beschränkt 1-4 werden. Derzeit wird dieses Phänomen am besten plastischen Chirurgen, die Rippenmaterial für Kiefer-, Gesichts- und Gehör Rekonstruktion verwenden bekannt, aber es ist nicht mehr weit geschätzt 5. Um dieses Reparatur genauer zu untersuchen, haben wir ein chirurgisches Modell unter Verwendung der Maus entwickelt. Mit diesem Protokoll können die Forscher die angeborenen Faktoren zu identifizieren und diese Informationen benutzen, um Skelettheilung an anderen Standorten zu erleichtern.

Es gibt viele Vorteile, um mit den Rippen als Modell für die Untersuchung der Skelettreparatur. Zunächst werden die umgebenden Rippen eine natürliche Fixateur (verglichen mit der Resektion des Femurs 6,7). Dies verringert das Morbiditätsrisiko der internen und externen Fixatoren und vereinfacht die chirurgische Prozedur. Zweitens sind die dünnen Muskelschichten der Brust wawerde sorgen für einfachen Zugang und gute Sicht, die der Test vergleichbar mit dem Komfort der Schädel Resektionen 8 zu machen. Drittens, im Gegensatz zu der, die von Calvarien intramembranous Ossifikation Rippen Form durch endochondrale Ossifikation bilden und über Verlängerung an Wachstumszonen an jedem Ende eines zentralen Diaphyse angeordnet wachsen in der Länge. Daher kann die Reparatur der Rippen mehr vergleichbar Reparatur der langen Röhrenknochen der Gliedmaßenskelett sein. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass im Vergleich zu dem Femur, die Knochenhaut der Rippe dicker und kann leichter gehandhabt werden. So können Forscher, die zur Knochenreparatur zum Zweck der Untersuchung der Knochenhaut oder Testzelltherapien, pharmakologische Wirkstoffe und / oder Gewebegerüste testen möchten finden diese Operationsmodell sinnvoll. Zusammenfassend stellt diese Rippenresektion Modell ein Rahmen ist, um natürliche großen Knochenreparatur bei Säugetieren zu studieren, da kein solches Modell im allgemeinen Gebrauch derzeit existiert.

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Protokoll

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HINWEIS: Alle Verfahren sind in Übereinstimmung mit einem von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Southern California genehmigten Tier Protokoll.

1. Vorbereitung für die Chirurgie

  1. Legen Sie die notwendigen chirurgischen Werkzeuge und Materialien (sterilisiert, Einträge 1 bis 18 in der Materialliste) und vereinbaren Sie einen Binokular und einen Lichtwellenleiter transLicht in einer Haube oder einem Wartungstisch.
  2. Legen Sie eine geschlechtsreif Maus (20 - 30 g, 1-3 Monate alt) in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran Anästhesie zu induzieren.
  3. Bestätigen Anästhesie mit einer Pfote und / oder Schwanz Prise Test.
  4. Bewerben Salbe die Augen der Maus die zu Augentrockenheit während der Operation zu vermeiden.
  5. Bewegen Sie die Maus auf den Mikroskoptisch. Platzieren Sie die Maus in die Bugnase des Wartungsschlauch und seitlich zu positionieren. Geben Sie eine Erwärmung Beutel neben dem Tier zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.
    NICHTE:. Position der Maus hängt von persönlichen Vorlieben und / oder Händigkeit des Chirurgen, der rechten oder linken Seite ist in Ordnung.
  6. Passen Isofluran zu 2-3% für die Wartung, und beobachten Sie die Atemfrequenz.
  7. Injizieren Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutan (Seitenflanke des Beins) zum postoperativen Schmerz mit einer 25 G-Nadel. Das Bein kann zucken, welche eine normale Reaktion ist.

2. Öffnungs Incision

  1. Ermitteln Sie die gewünschte Rippe durch Palpation, und löschen Sie den Bereich der Haare mit einem Rasierer.
    HINWEIS: Rippen 8-10 werden empfohlen, da Rippen 1-7 sind näher an der Lunge und 11-13 sind deutlich kürzer. Zählen der Rippen sollte mit den meisten rostral Rippe als Nummer 1 beginnen.
  2. Bereiten Sie die Gegend mit wechsel PVP-Jod und Isopropanol (70%) Abtupfen (3x wird oft von Tiernutzung Protokolle empfohlen).
  3. Schneiden Sie ein 2 cm Schnitt durch die Haut, direkt über und parallel mit mittelgroßen Mikroscheren gewünschten Rippe. IncisE durch die darunter liegende Muskulatur und Fettschichten.
  4. Legen Sie alle drei Schichten (Haut, Muskeln, Fett) in eine Rückziehvorrichtung, um das Operationsfeld freizulegen, bei gleichzeitiger Minimierung der Größe des Einschnitts.

3. Ausschneiden des Rib

  1. Durch die Zwischenrippenmuskeln, die über dem gewünschten Abschnitt der Rippe mit einer 5,0 mm Skalpell. Position diesen Schnitt um 5 mm proximal der chondrocostal gemeinsame da hier die Rippe ist nicht so stark gekrümmten. Trennen Sie vorsichtig die Muskeln von den Knochen mit feiner Spitze Pinzette.
  2. Um eine Resektion zu schaffen unter Beibehaltung der Knochenhaut in der Tier, schneiden durch die Knochenhaut, über die Länge der Rippe mit einer 5,0 mm Skalpell. Trennen Sie vorsichtig das Periost von der darunter liegenden Knochen seitlich feine Spitze Pinzette. Gehen Sie mit Vorsicht, da die Knochenhaut ist sehr empfindlich und hat eine gelartige Konsistenz.
  3. Weiter stellen Sie einen Querschnitt durch den Knochen an einem Ende mit feinen Mikro Schere. Bei Bedarf messen die Resektion mitein Fadenkreuz im Mikroskop oder einem Lineal Typ Wertangabe. Dann heben Sie die Knochen von der Knochenhaut und schneiden Sie das andere Ende.
    HINWEIS: Gehen Sie mit Vorsicht. Dies ist der heikelste Schritt, wie oben ziehen, ohne Auslösen der Rippe unter die Pleura Membran reißen und zu einem Pneumothorax. Wenn der pleuralen Membran zerrissen wird dies ohne weiteres ersichtlich sein, wie das Innere der Brusthöhle sichtbar werden.
  4. Wenn die Blutung als Folge des Schneidens des Knochens auftritt, wenden Sie Druck an der Schnittende mit einem Wattestäbchen für 4-5 Sekunden, um die Blutung zu stoppen.
    HINWEIS: In den seltenen Fällen, dass Blutung anhält, kann es notwendig sein, zu stoppen und das Tier einschläfern als signifikante Blutverlust wird die Erholung gefährden (ohne Flüssigkeitsersatz ist die maximale Blutvolumen, die sicher verloren gehen können 10% des gesamten Blutvolumens oder 7.7 -. 8 ul / g für eine 25 g Maus entspricht dies rund 180 bis 200 & mgr; 9).
  5. Sofort legen Sie die entfernt Rippe in4% PFA für eine spätere Analyse.
    HINWEIS: Wenn die Resektion von sowohl dem Knochen und der Knochenhaut ist durchgeführt werden soll, lassen Sie den Knochenhaut Schnitt und Trennung (Schritt 3.2). Da die Knochenhaut ist sehr eng an die Pleura Membran angebracht gehen vorsichtig, Hänseleien der Rippe von der Pleura-Membran mit einer Pinzette, um Risse zu vermeiden.

4. Schließen der Inzision

  1. Nähen Sie die Zwischenrippenmuskeln über die Spitze des verbliebenen periostalen Hülle mit 9-0 Nahtmaterial (2 Nähte sind in der Regel ausreichend). Zeigen die Fäden direkt über die Schnittenden der Rippe, die als Indikatoren für die Chirurgie Ort handeln.
  2. Entfernen Sie die Rückziehvorrichtung. Naht der darüberliegenden Muskeln und Fett mit 9-0 Nahtmaterial (3-4 Nähte sind in der Regel ausreichend). In Mäusen, die mit besonders dicken Schichten von Muskulatur und / oder Fett, Naht jede Ebene (beispielsweise 1-Schicht von Nähten für die Muskelschicht und 1 Schicht von Nähten für die Fettschicht).
  3. Schließen Sie dieHaut mit 7-0 Nahtmaterial (4-5 Nähte sind in der Regel ausreichend).
  4. Sichern Sie den Schnitt mit Nahtkleber, Kneifen die Ränder zusammen mit großen Zangen.
  5. Langsam zu entwöhnen Sie die Maus aus Isofluran durch zunächst für einige Minuten Einstellung auf 1% und schalten Sie.
  6. Platzieren Sie die Maus unter einer Wärmelampe und verlassen, bis das Bewusstsein wiedererlangt, 5 - 10 min. Nach Bewusstsein wiedererlangt und während der Heilungsphase sollte die Maus bewegen und normal ambulate und zeigen keine Anzeichen von Leiden.

5. Wiederaufnahme und Analyse

  1. Geben postoperativen Schmerztherapie einschließlich der Anwendung von Buprenorphin in einer mündlichen Gelatineform bei 0,5 mg / kg alle 12 Stunden für 48 Stunden. Die orale Verabreichung erfordert keine Zurückhalten der Tiere, die Schmerzen für den Brustbereich verursachen könnten.
  2. Pflegen Sie die Maus in einen Käfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser während der Heilungsphase. Nachdem der Schnitt trocken ist, können weibliche Tiere zusammengebracht werden, während Männers müssen getrennt bleiben, um Kämpfe zu vermeiden.
  3. Nach der Einheilzeit, folgen Sie dem zugelassenen Verfahren für die Euthanasie. Entfernen Sie den Brustkorb zur Fixierung und Analyse.

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Ergebnisse

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Tiere in der Regel schnell wieder von diesem Verfahren, der Schnitt heilt gut, und die Tiere zeigen normales Verhalten. Die Prozedur verwendet handelsübliche Versorgung und nach dem Training, kann in weniger als 1 Stunde durchgeführt werden. Bevor Sie dieses Verfahren, um experimentelle Daten zu generieren, ist es wichtig, die Resektion am Tag 0 Zeitpunkt zu analysieren, um festzustellen, ob große Knochenfragmente könnte innerhalb der Resektion Zone bleiben. Ein Weg, um die richtige Vorgehensweise zu beurteilen ist, die...

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Diskussion

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Wenn erst zu lernen, dieses Protokoll, zu bestimmen, wo die anfänglichen Schnitt zu finden kann eine Herausforderung sein. , Praxis auf eingeschläfert Mäusen hilft jedoch dem Chirurgen erfahren, wo die anfänglichen Schnitt legen und setzen die gewünschte Rippe reseziert werden. Die Arbeit an Kadavern verbessert auch die feinmotorischen Fähigkeiten erforderlich, um den Rippenabschnitt mit oder ohne Knochenhaut zu entfernen. Zudem könnte jemand neu in diesem Verfahren finden die Manipulation der feinen Werkzeuge und dünne...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen

Danksagungen

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Wir danken den Mitgliedern des Mariani-Labors für die kritische Lektüre des Manuskripts. Unsere Finanzierungsquellen waren: das Baxter Medical Scholar Research Fellowship (an M.K.S.), USC Undergraduate Fellowships und die Provost, Dean Joan M. Schaeffer und Rose Hills Fellowships (an M.K.S.). Wir danken auch für ein CIRM BRIDGES-Stipendium durch das Pasadena City College (an T.T.T). und der James H. Zumberge Research and Innovation Fund, die USC Regenerative Medicine Initiative und das NIAMS NIH unter der Fördernummer R21AR064462 (an F.V.M).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mittelgroße Mikrodissektionsschere (Vannas-Tü bingen Federschere 5 mm)Fine Science Tools15003-08
Feine Mikrodissektionschere (Vannas Federschere - 2mm Schneide)Fine Science Tools15000-04gebogene Spitze ist vorteilhaft
Mikroskalpell 5,0 mmFine Science Tools10315-12andere feine Skalpelle können ersetzt werden
Dumont 55 PinzetteFine Science Tools11295-51
Retraktor Fine Science Tools17004-05Verstellbarkeit ist praktisch
MikronadelhalterFine Science Tools12060-01
9,0 Nylonnähte (Ethilon), Taper Point am bestenEthicon2819G oder ähnlicheTaper Point am besten, aber umgekehrtes Schneiden ist auch gut
7,0 Prolene Nähte (Prolene)Ethicon8700H oder ähnlich6-0 kann auch verwendet werden, Nadelspitze kann variieren
Große Pinzette (Adson Forceps)Fine Science Tools11006-12andere Marken sind fein
Gleitmittel Augensalbe (Akwa Tears)Akorn17478-062-35
Nahtkleber (GLUture Topical Tissue Adhesive)Abbot32046-01hat eine ausgezeichnete Verarbeitungszeit
RasiererWahl9918-6171 oder ähnlich
KlemmlampeZoo MedLF-5
Infrarot-Lampe, 75WZoo MedRS-75
RC2 Nagetier-AnästhesiesystemVetEquip 922100
IsoFlo (Isofluran)Abbot05260-05
Buprenorphin (Buprenex)Reckitt Benckiser12496-0757-1
BetadinePurdue Frederick67618015017
Aromatisierte Gelatine,B000E1FYL0fest gemacht, bis zur Konsistenz von 'Jigglern'
Himbeer-Wackelpudding

Referenzen

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  1. Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
  2. Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
  3. Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
  4. Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
  5. Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
  6. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
  7. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
  8. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  9. Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
  10. Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
  11. Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
  12. Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
  13. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
  14. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
  15. Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
  16. Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
  17. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  18. Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).

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Rippenresection bei M usenKnochenreparaturmodellPeriosterhaltRippenexzisionSkelettreparaturInterkostalmuskelThoraxchirurgieKnochenregenerationhistologische Analyse

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