Methodenartikel

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

DOI:

10.3791/52385

⸱

28. Februar 2015

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1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen

werden können.

Zusammenfassung

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Die Anopheles gambiae Artenkomplex umfasst die wichtigsten Malariatragenden Mücken in Afrika. Da diese Arten solcher medizinischer Bedeutung, werden mehrere Merkmale in der Regel mit Hilfe molekularer Tests in epidemiologischen Studien zu helfen aus. Diese Eigenschaften umfassen Artbestimmung, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion Status und Wirtspräferenz. Seit Populationen der Anopheles gambiae komplexe morphologisch nicht zu unterscheiden ist eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) traditionell genutzt, um Arten zu identifizieren. Sobald die Arten bekannt ist, werden mehrere Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um weitere Eigenschaften zu erklären. Zum Beispiel Mutationen KDR in einer para-Gen bekannt Resistenz gegen DDT und Pyrethroid-Insektiziden. Zusätzlich werden Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) oder Plasmodium Parasiten-DNA Nachweis-PCR-Assays verwendet werden, um in Moskito Geweben vorhandenen Parasiten erkennen. Schließlich a combination der PCR und Restriktionsenzym verdaut, kann verwendet werden, um Wirtspräferenz (zB menschliche vs. Tierblut) durch Screening der Moskitoblutmehl für Host-spezifische DNA aufzuklären. Wir haben eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle der oben genannten Assays zu einer Zeit verbindet, in einer einzigen Multiplex-Reaktion Genotypisierung 33SNPs für 96 oder 384 Proben entwickelt. Da die MDA umfasst mehrere Marker für Arten, Plasmodium Erkennung und Gastgeber Blut Identifikation, wird die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von falschen Positiven oder Negativen stark von vorherigen Tests, die nur eine Markierung pro Merkmal sind reduziert. Diese robusten und einfachen Test kann diese Schlüsselmoskito Eigenschaften kostengünstig und in einem Bruchteil der Zeit bestehender Assays.

Einleitung

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Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii und Anopheles gambiae sind die wichtigsten Vektoren für Malaria-Übertragung in Afrika 1 verantwortlich. Diese drei Arten sind morphologisch nicht 2 und nur durch molekularen Assays 3-9 unterscheiden. Darüber hinaus gibt es viele Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen zu unterstützen. Diese umfassen (1) eine Genotypisierungsassay für Speziation Inseln 10-12, (2) eine Genotypisierungsassay Anerkennung nicht gleichbedeutend SNPs in der 1014 th Aminosäurecodon Position para-Gen (der Knock-down-Widerstand oder kdr, SNP) 13 -18, (3) Parasitenerkennung PCR 19-23, und (4) Screening von wirtsspezifischen DNA in Moskito midguts 24,25.

Wir entwickelten eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle diese Assays in einer einzigen Multiplex-Reaktion mit dem Ziel, eine Kombinationalyzing epidemiologisch wichtige Eigenschaften der Malariavektoren in Afrika. Die MDA-Assay umfasst mehrere Marker zum Detektieren (1) Art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii oder andere (keiner der drei)), (2), Insektizidresistenz in kdr SNPs dargestellt (beide L1014F und L1014S) , (3) auf zwei wesentliche Malaria-Parasiten, Plasmodium falciparum und P. vivax, und (4) Blutquelle von einem aviären und sechs Säugetierwirten.

Traditionell wurden diese Assays in separaten Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Wenn all diese Tests werden unter Verwendung einer herkömmlichen PCR-Plattform erfolgt, bedarf es der Durchführung 8-10 PCR-Assays und Begleit Gelelektrophorese Schritte. Jeder einzelne PCR-Reaktion von der Vorbereitung bis Dokumentation der Ergebnisse dauert 4-5 Stunden, während der hier vorgestellten MDA Verfahren dauert etwa 5 Stunden in der Gesamtheit. Dies entspricht einer 90% Einsparungen bei den Arbeitskosten allein. Der MDA präsentiert hier kostet $ 5pro Probe, um alle 33 SNPs Genotyp. Dies ist erheblich weniger teuer als die einzigen Agarosegel basierenden Assays, die ungefähr $ 1,50 pro Probe kostet. Assays Erkennen alle Merkmale durch die MDA abgedeckt würde ein Minimum von 8-10 verschiedenen Agarose-Gel-basierte Assays zu einem Preis von $ 15.12 pro Probe erforderlich. Darüber hinaus ist die MDA stark die Möglichkeit der Erzeugung eines falschen positiven oder negativen durch die Verwendung von mindestens drei Marker für jeden Parasiten oder Host Quellenerkennung reduziert.

Die Plattform verwendeten wir nicht an Malaria Vektoren beschränkt, sondern kann in einer Vielzahl von Anwendungen, wie der Medizin, Veterinärmedizin, und grundlegende Biologie 26-28 verwendet werden. Vertiefte Assoziationsstudien oder Populationsgenetik Studien mit einer großen (in der Reihenfolge der 100s) Anzahl der Proben erfordern kosteneffiziente Tests Screening für mehrere Marker gleichzeitig. Die meisten Studien, die zwei oder mehr getrennten PCR-Assays konnte MDA für schnellere Ergebnisse zu geringeren Kosten zu realisieren.

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Protokoll

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1. PCR-Amplifikation

  1. Mischen Sie alle PCR-Primer (Siehe zusätzliche Tabelle S1) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. Jeder SNP hat zwei Primer (vorwärts und rückwärts). Sicherzustellen, dass der Stammkonzentration von jedem PCR-Primer wird bei 100 & mgr; M gehalten. Stellen Sie genug Primer Mix für 500-1.000 Reaktionen zur Verringerung Pipettieren Fehler und Zeit auf der Bank (siehe ergänzende Tabelle S2). Auf Wunsch bereiten Aliquots für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C.
  2. Bereiten PCR-Cocktail nach dem Protokoll des Herstellers (Tabelle 1) beschrieben. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. Vortex die Röhrchen mit der PCR-Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g.
  3. Verzichtet werden 3 ul der PCR-Cocktail in jede Vertiefung einer ohne Rahmen 96 Well-Platte. Ein Repeater-Pipette kann Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  4. Add 2 ul der entsprechenden genomischen DNA von Moskitos in jede Vertiefung geben.
    HINWEIS: Prozess zur Gewinnung von genomischer DNA aus m osquito Gewebe (Head / Thorax, Abdomen oder Ganzkörper) wird in anderen Literaturen 29-32 beschrieben. Wählen Sie einen geeigneten DNA-Extraktionsprotokoll zu denen mit Plasmodium im Blut (Abdomen) von infektiösen Mücken (im Head / Thorax-Plasmodium) zu differenzieren. Wir verwenden in der Regel von Körperteilen (Head / Thorax oder Abdomen) Mücken extrahierten DNA, so dass DNA-Konzentration variiert von 0.05-2ng / ul. Obwohl die Gesamt-DNA-Eingang unter der Herstellerempfehlung (5-10ng / Reaktion) ist, wir in der Regel erhalten, robust SNP Anrufe von 98% der DNA-Proben ohne Amplifikation des gesamten Genoms.
  5. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g.
  6. Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Protokoll zur Durchführung von PCR-Amplifikation: (1) 94 ° C für 2 min, (2) 94 ° C für 30 Sekunden, (3) 56 ° C für 30 Sekunden, (4) 72 ° C für 1 min (5) Wiederholen der Stufe (2) - (4) für 45 Zyklen (6) 72 ° C für 1 min und 4 ° C gehalten.
_title "> 2. SAP-Behandlung

  1. Bereiten Sie die SAP Enzymlösung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (siehe Tabelle 2). Prozess 96 Proben in einer Platte. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%.
  2. Vortex die Röhre von SAP Enzymlösung leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des SAP Enzymlösung in jedes Well. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  3. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Inkubieren der Platte wie folgt: (1) 37 ° C für 40 min, (2) 85 ° C für 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, (3) 4 ° C gehalten. Bei Beendigung dieser Stufe, speichern Sie die Platte bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren. Verarbeiten Sie die gespeicherten Platte innerhalb von 2 Wochen.

3. SNP-Erweiterung

  1. Wenn die Probenplatte nach SAP Behandlung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren.
  2. Bereiten Sie die Verlängerungsprimer Mix (Supplemental Tabelle S2). Jeder SNP hat einen extension Primer. Bewahren Sie die Lager Konzentration jedes Verlängerungsprimer bei 500 uM. Optional aliquoten für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C.
  3. Bereiten Verlängerungsmischung, wie in Tabelle 3 Reaktionsvolumen 96 enthält einen Überhang von 20% beschrieben.
  4. Vortex die Röhre der Erweiterung Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des Verlängerungs Cocktail in jede Vertiefung. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern.
  5. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Thermozyklus der Platte wie in Abbildung 1 dargestellt. An diesem Punkt der Massenspektrometrie gehen oder lagern Sie die Platte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen.

4. Auswertung der SNP-Verlängerungsprodukt zu Massenspektrometrie Analyse Optimieren

  1. Wenn die Probenplatte nach SNP-Erweiterung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren.
  2. Übertragen Sie 15 mg Harz von seiner container auf die Grübchen Platte mit einem langgestreckten Löffel. Verwenden Sie den Schaber, um Harz in die Vertiefungen der Vertiefung Platte verteilt. Fegen Sie den Schaber von der Seite, über die Noppenplatte her, um den Harz zu verbreiten. Vergewissern Sie sich, Harz in jedem Well.
  3. Kratzen Sie überschüssiges Harz aus der Vertiefung Platte mit dem Schaber. Lass das Harz stehen Grübchens Platte für mindestens 20 min. Während der Vermietung das Harz stehen in der Vertiefung Platte, fügen Sie 41 ul der HPLC-Wasser in jedes Well der Probenplatte.
  4. Legen Sie vorsichtig die Probenplatte auf den Kopf, auf den Grübchen Platte. Sicherstellen, dass die Probenplatte setzt gegen den kleinen runden Beitrag der Vertiefung Platte, die die Brunnen in der Probenplatte mit den Bohrungen in der Vertiefung Platte richtet.
  5. Halten der Probenplatte und die Grübchen Platte zusammen, sanft Flip sie über so das Harz fällt aus dem Vertiefungsplatte in die Vertiefungen der Probenplatte. Tippen Sie auf die Noppenplatte so das Harz fällt in die Probenplatte. Sicherstellen, dass alle das Harz in dem dimple Platte fällt aus auf die Probenplatte Brunnen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 3200 g für 30 Sek.
  6. Drehen Sie den Probenteller auf einem Rotator für 5 min bei RT. Rotator muss der Probenplatte um 360 ° um die Längsachse.
  7. Zentrifugieren Sie die Probe Platte bei 3200 xg für 5 min. Nach diesem Schritt speichern Sie die Probenplatte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt.

5. MALDI-TOF-Massenspektrometrie

  1. Übertragen Sie die Anlage SNP Verlängerungsprodukt auf eine Bioarray wie SpectroCHIP nach Herstellerangaben. Wir verwenden Massarray Nanodispenser für diesen Schritt.
  2. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, festzulegen, wie Tests und Platten sind in der Testdatenbank eingerichtet werden. Nennen Sie den Test und Platten, so dass jede Platte eindeutige Kennung, die spezifischen Assay-Design (Supplemental Tabelle S3) verbindet.
  3. Nach dem Test und Platte festgelegt sind, zu erwerben Spektren mit einem Massenspektrometer.

6. Datenanalyse

  1. Führen Sie die Datenanalyse unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Analyse der Dateninterpretation Software wie Typer Analyzer oder TyperViewer (Sequenom). Erhalten von Daten in .xml-Format, die die Probe Layout Massenspektrogramm für jede Vertiefung enthält, die Marker-Informationen wie Name, erwartete Masse für jede Variante des entsprechenden SNP, und jeder Fehler oder Warnungen bei jeder Reaktion verbunden. Abbildung 2 zeigt die resultierende Massenspektrogramm.
  2. Durchführung SNP-Genotyp Clustering-Analyse durch Einstellen des Erfassungsschwellenwert (Größe oder Signal-Rausch-Verhältnis) und die Toleranz / Varianz für jeden Genotyp erlaubt, Fig. 3 zeigt ein Beispiel für ein 04707-KDR # 2 SNP-Genotyp Clustern.
  3. Exportieren Sie die resultierenden SNP-Genotyp Anrufe in ein Tabellenkalkulationsprogramm.

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Ergebnisse

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Artbestimmung:

Die folgenden 5 SNPs zusammen identifizieren drei Arten (A. arabiensis, A. coluzzii und A. gambiae) (Tabelle 4). Wenn eine Probe nicht einer der drei Arten, die drei SNPs (01.073-213, 04.679 bis 157 und 10.313 -052) nicht zu verstärken.

kdr Genotyp zur Ableitung Insektizidresistenz:

Die 1014 th Codon der para spannungsabhängigen Natriumkan...

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Diskussion

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- Flugzeit (MALDI-TOF) -Massenspektrometrie 33-37 PCR-Amplifikation shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) Reaktion SNP Verlängerung Verlängerungsprodukt Anlage und Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation: Das MDA ist aus fünf Hauptschritten zusammengesetzt. Die erste PCR-Amplifikation Schritt verstärkt DNA flankieren jedes SNP damit genügend Template-DNA wird an der SNP Verlängerungsschritt verfügbar. Der SAP-Reaktion neutralisiert ungenutzte dNTPs, die mit der folgenden SNP Verlängerungsschritt stör...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Drs. Anthony Cornel und Laura Norris an der UC Davis und Dr. Katharina Kreppel an der Universität von Glasgow für die Bereitstellung von Moskito Proben aus Tansania. Wir danken Frau Smita Das und Dr. Douglas Norris von der Johns Hopkins School of Public Health für den Austausch von Moskito Proben aus Sambia. Wir danken auch Mr. Lee V. Millon an der Tierärztlichen Genetics Laboratory für das Training auf Assay-Design. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health gewähren R01AI 078.183 und R21AI062929.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MassARRAY Analyzer CompactSequenomMT9MALDI-TOF Massenspektrometrie für genomische Anwendungen zur Analyse von Nukleinsäuren.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000Überträgt fertige iPLEX-Reaktionsprodukte auf das SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent SetSequenom10158Reagenzien, die für den iPLEX-Assay verwendet werden, einschließlich SAP-Kit.

Referenzen

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  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215(2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163(2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112(2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285(2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

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Anopheles gambiaeMalaria bertragungMultiplex PCR AssaySNP GenotypisierungSpeziesidentifizierungInsektizidresistenzParasitennachweisAnalyse der Wirtspr ferenzBlutmahlzeiten ScreeningRestriktionsenzymverdau

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