Methodenartikel

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

DOI:

10.3791/52392

⸱

6. Dezember 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die schnelle nicht-enzymatische Dissoziation von frischen menschlichen Gewebefragmenten zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von CD45+ Zellen (Lymphozyten/Leukozyten), die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem primären Gewebehomogenat gewonnene Überstand gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden.

Zusammenfassung

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Die Fähigkeit von Tumorzellen, das Immunsystem, gekennzeichnet durch Tumorflucht sowohl angeborenen und erworbenen Immunreaktionen entziehen wird nun als ein wichtiges Merkmal von Krebs angenommen. Unsere Forschung zu Brustkrebs konzentriert sich auf die aktive Rolle, die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten in der Tumorprogression und der Behandlungserfolg spielen. Auf dieses Ziel, eine Methodik für die schnelle Isolierung von intakten lymphatischen Zellen von normalen und abnormalen Geweben haben wir in dem Bemühen, zu bewerten nahe ihrem nativen Zustand. Homogenate mit einem mechanischen Dissoziator zeigen sowohl erhöhte Lebensfähigkeit und Zellgewinnung unter Beibehaltung Oberflächenrezeptorexpression im Vergleich zum Enzym verdaute Gewebe vorbereitet. Außerdem hatte enzymatische Verdauung der verbleibenden unlöslichen Materials zusätzliche CD45 + Zellen anzeigt, dass qualitative und quantitative Messungen im Primär Homogenat wahrscheinlich wirklich infiltrieren Subpopulationen im Gewebe fragm reflektieren nicht wiederherstellenEintr. Die lymphoiden Zellen in diesen Homogenaten man einfach mit immunologischen (Phänotyp, Proliferation usw.) oder Molekular (DNA, RNA und / oder Protein), gekennzeichnet nähert. CD45 + Zellen können auch für die Reinigung Subpopulation, in vitro Expansion oder Kryokonservierung verwendet werden. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Primärgewebe Stand aus den Homogenaten kann verwendet werden, um in normalen und malignen Geweben zu charakterisieren und zu vergleichen, Cytokine, Chemokine, Immunglobuline und Antigenen werden. Diese Protokoll-Funktionen sehr gut für den menschlichen Brustgewebe und sollte für eine breite Vielzahl von normalen und abnormalen Geweben.

Einleitung

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Die Mikroumgebung des Tumors besteht aus verschiedenen Zelltypen, wobei zahlreiche Studien zeigen, dass sie jeweils unterschiedliche und wichtige Rollen bei der Tumorentstehung spielen1,2. Dazu gehören unter anderem infiltrierende Immunzellen, Stromazellen, Endothelzellen und Tumorzellen3. Ex-vivo-Studien an tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL; CD45+-Zellen oder Leukozyten, bei denen es sich bei Brusttumoren überwiegend um Lymphozyten handelt) aus frischen menschlichen Gewebeproben wird durch ihre geringe Häufigkeit, die oft für die Forschung verfügbaren kleinen Probengrößen und den möglichen Verlust der Lebensfähigkeit während der Extraktion erschwert. Da Immunzellen, die in Tumore eindringen, in der Regel als Passagiere und nicht als ständige Bewohner anwesend sind, lassen sie sich im Allgemeinen leichter aus der Gewebematrix lösen.

Die Dissoziation von Tumorgewebe unter Beibehaltung der zellulären Integrität ist eine technische Herausforderung und wurde traditionell mit einer Kombination aus mechanischen und enzymatischen Schritten durchgeführt, um Einzelzellsuspensionen4-8 herzustellen. Dieser Ansatz ist mit langen Inkubationszeiten verbunden und ist mit einer signifikanten Verringerung der Zellviabilität sowie dem Verlust von Zelloberflächenrezeptoren durch enzymatische Spaltung verbunden. Qualitativ hochwertige durchflusszytometrische Studien zur Charakterisierung von TIL in der Tumormikroumgebung sowie saubere Aufreinigungen von CD45+-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie oder Antikörper-beschichtete Kügelchen sind aus enzymverdautem Tumorgewebe schwieriger zu erreichen. Darüber hinaus ist der Überstand (SN) aus dem resultierenden Tumorhomogenat aufgrund des Potenzials für den Proteinabbau in den enzymatischen Digesten nicht für eine weitere Analyse einschließlich der Quantifizierung von sezernierten Proteinen (Zytokine, Chemokine, Immunglobuline oder Tumorantigene) oder eine experimentelle Behandlung normaler Zellen zugänglich.

Auf unserer Suche nach einer Methode zur Herstellung von einzelligen Homogenaten aus Brustgewebe [einschließlich Tumorgewebe, nicht-benachbartem Nicht-Tumor (NANT) und normalem (aus Brustverkleinerungen) Brustgewebe] ohne enzymatischen Verdau, haben wir eine Vielzahl von mechanischen Homogenisierungstechniken getestet. Homogenate, die mit einem mechanischen Dissoziator hergestellt wurden, erhöhten die Zellviabilität (2-fach) und die Gesamtzellrückgewinnung (2-fach) bei gleichzeitiger Beibehaltung der Oberflächenrezeptorexpression. Der enzymatische Verdau des verbleibenden unlöslichen Materials führte nicht zu weiteren CD45+-Zellen, was darauf hindeutet, dass sie alle im ursprünglichen Homogenat freigesetzt wurden. Dieser schnelle und einfache Ansatz ermöglicht somit sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Bewertung der CD45+-Subpopulationen, die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorkommen. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass das SN aus dem ursprünglichen Homogenat (primäres Gewebe-SN) gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden kann.

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Protokoll

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HINWEIS: Alle Proben wurden unter Verwendung eines Protokolls von der Medizinischen Ethik-Kommission des Instituts Jules Bordet mit schriftlicher Einwilligung von jedem Patienten erhalten genehmigt erworben.

1. Herstellung des Gewebehomogenats

  1. Sezieren resezierten Gewebe (malignen und normalen Gewebe aus dem OP-Saal resezierten) sind in der Pathologie-Labor durch geschultes Personal zur sofortigen Abholung. Tumor, NANT (aufgenommen am weitesten Abstand von der Tumor wie möglich) und Normalgewebefragmente werden routinemäßig auf 1 bearbeitet - 3 h chirurgische Exzision in einem BSL2 Labor unter Verwendung von Standardverfahren der biologischen Sicherheit für menschliche Gewebe. Ein Ablaufdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Wiegen Sie alle Gewebestücke (normal, NANT und Tumor) und messen Sie die Länge, Breite und Höhe (Länge x Breite x Höhe). Dies ist ein wichtiger Schritt für die anschließende Normalisierung des Zellpopulationen, extrahierte RNA usw.
    NEINTE: Der Bereich der Stichprobengröße ist 100 bis 10.000 mm 3 ohne Fett, wenn möglich.
  3. Impressum der Tumorfragment auf einem Objektträger für H & E Färbung, um zu überprüfen, dass das Gewebe ist eigentlich ein Teil des Tumors.
    1. Tun Sie dies, indem Sie einen Glasobjektträger auf den Tumor-Fragment und mit leichtem Druck mit den Fingern für ein paar Sekunden.
    2. Befestigen Sie die Folie mit Isopropanol für 2 Minuten, gefolgt von einem Waschschritt in Wasser. Gegenfärbung des Gewebes für 30 Sekunden mit Mayers Hämatoxylin.
    3. In sechs Bäder Wasser Waschen Sie den Objektträger. Fleck in Phloxin B 2% für 15 Sekunden.
    4. In einem Bad aus Wasser, gefolgt von vier Bäder Isopropanol und Finish mit einem Bad aus Wasser waschen.
    5. Inkubiere in Isopropanol für 1 min und Drain. Klar in zwei Bäder Xylol.
    6. Montieren Sie mit Xylol basiert Eindeckmedium. Untersuchen der Tumorzellzahl (Abbildung 2).
      HINWEIS: Vor allem, Tumorzellen haften an der aufgedruckten Rutsche - das Stroma, lymphatischen oder Ad-ipose Zellen selten bleiben, so dass Zwischenräume zwischen den Tumorzellen (Abbildung 2).
  4. Mit einer sterilen - Legen Sie die Gewebefragment in einer kleinen Kulturschale mit 1 ml der chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmedium bei Raumtemperatur in kleine Stücke (2 mm 2 bis 1) (im Folgenden als Medium bezeichnet), und in Würfel schneiden Skalpell.
  5. Bringen Sie alles, was (Gewebefragmente + Medium) zu einer mechanischen Dissoziator C Rohr.
  6. Mit 2 ml Medium mit einer Pasteurpipette gründlich die Petrischale und Skalpell und addieren sie zum C Rohr (Volumen des Mediums für die Dissoziation = 3 ml).
  7. Verwenden Sie die mechanische Dissoziator Programm A.01 für C Rohre (die schonendste Programm), um die Gewebefragmente in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Stellen Sie das C-Rohr in der Vorrichtung und zweimal das Programm in Folge (ein Zyklus = 25 sec).
    HINWEIS: Diese Homogenisierung Verfahren hergestellt wurde und für den menschlichen Brustgewebe, andere tum validiertoder oder Gewebetypen müssen vielleicht ein anderes Programm verwenden und sollten zuerst getestet werden.
  8. Entfernen Sie das C-Rohr aus dem Gerät und dekantiert die Homogenat direkt in ein 40 um Zellsieb auf einem 50-ml-Tube sitzt. Mit der gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, übertragen jede in der C-Rohr in die Zelle Sieb zurückbleibende Flüssigkeit.
  9. Übertragen Sie die gefilterte Flüssigkeit in einen 15-ml-Röhrchen mit einem 1 ml Mikropipettenspitze. Vorübergehend halten die Zellsieb und seine 50-ml-Tube.
  10. Mit weiteren 3 ml Medium spülen C Röhrchen sammeln und diese wieder mit dem gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, auf die Zellsieb noch auf dem 50-ml-Tube sitzt. Drücken Sie eine maximale Menge der Restflüssigkeit in der nicht homogenisierten Gewebe eingeklemmt in die 50-ml-Röhrchen durch leichtes Verschieben der ganzen Sieb mit einem sauberen Pasteurpipette oder 1 ml-Spitze, die dann weggeworfen wird, um zu vermeiden, eine Verunreinigung des Eluats.
  11. Legen Sie die Zellsieb kopfüber auf ter Original C Rohr und spülen Sie mit 3 ml Medium, so dass die nicht homogenisierten Gewebe fällt zurück in die C-Rohr.
  12. Re-Homogenisierung, wie in Schritt 1.7 für zwei Zyklen des A.01 Programms.
  13. Gießen Sie diese zweite Homogenat durch die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt, spülen Sie das C-Rohr wieder mit 3 ml Medium (wie in Schritt 1.10) und Transfer mit dem Pasteur-Pipette an die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt wieder drückte maximal Flüssigkeitsmenge aus dem Rest Bindegewebes im Zellsieb gefangen.
  14. Zu diesem Zeitpunkt ist ein Volumen von ~ 2,5 ml in 15 ml-Röhrchen und ~ 9 ml in 50-ml-Röhrchen.

2. Trennung der Gewebeüberstand und Zellen

  1. Zentrifugieren Homogenate in 15 ml und 50 ml-Röhrchen für 15 min bei 600 × g bei Raumtemperatur.
  2. Dekantiert man die SN aus dem 15-ml-Röhrchen in ein sauberes Röhrchen und vorübergehend bei 4 ° C zu lagern. Dieser Überstand = Primärtumor, NANT oder normale tiUSGABE SN (Endvolumen 2,5 ml) wird anschließend geklärt und aliquotiert vor der Lagerung bei -80 ° C für zukünftige Analysen (siehe unten).
  3. Überstand verwerfen aus dem 50-ml-Tube.
  4. Vorsichtig resuspendieren beiden Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml Medium. Kurz gesagt, zuerst sanft brechen die Zellpellets in beiden Röhren (durch Tippen auf das Rohr auf eine harte Oberfläche). Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in den 50 ml mit 500 ul Medium und übertragen diese Zellsuspension in die 15-ml-Tube, um die zweite Pellet resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit der zweiten 500 ul Medium für maximale Rückgewinnung von Zellen.
  5. Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau (Verdünnung 1: 1) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers.
    HINWEIS: An diesem Punkt eine Fraktion der Zellsuspension können auch mittels Durchflusscytometrie analysiert, um die Zellgröße, Granularität zu bewerten und, falls gewünscht eine begrenzte Anzahl von Subpopulation Marker für weitere precise Abschätzung der Zellverteilung in dem Homogenat vor der umfassenden Analyse oder Experimente. Alle Analysen mittels Durchflusszytometrie integrieren CD45 Kennzeichnung für die Normalisierung der Subpopulationen.
  6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die Zellen aus dem Tumor, NANT oder normales Gewebe sind nun bereit für die weitere Reinigung oder Analyse. Diese zusätzlichen Schritte sind am besten, wenn am selben Tag wie die Chirurgie durchgeführt.
    HINWEIS: Für Durchflusszytometrieanalyse aber nicht zell Sortieren der Rest Erythrozyten sollten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml von roten Blutzellen Lysepuffer zu dem Zellpellet sofort Vortexen für 1 sec und Inkubieren von mindestens 10 min bei Raum lysierenden Temperatur (lichtgeschützt) vor der Analyse.

3. Klärung der Gewebeüberstand

  1. Zentrifugieren 1,5-ml-Röhrchen mit Gewebe SN bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
  2. Entfernen Sie vorsichtig ter Überstand ohne sie zu berühren oder das Pellet aufzurühren. Transfer in ein sauberes Röhrchen (oder Röhren) in Abhängigkeit von der Anzahl und Volumen der Aliquote gewünscht.
  3. Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für eine spätere Verwendung.

4. Patient Blut

  1. Sammeln einer Blutprobe von jedem Patienten als Kontrolle durch Venenpunktion in heparinisierte Röhrchen am Tag vor der Operation. Zentrifugieren des Bluts bei 400 · g für 10 min bei 20 ºC mit der Bremse aus, um das Plasma und Buffy-Coat erhalten.
  2. Entfernen Sie das Plasma und klären sie durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 20 ºC. Aliquot und speichern Plasma bei -80 ° C für zukünftige Verwendung. Verdünnen Sie die Buffy-Coat in Medium
  3. Trenne die mononukleäre Zellen unter Verwendung von Standard-Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugation vor der unmittelbaren Analyse Subpopulation Isolierung, DNA / RNA / Protein-Extraktion oder Kryokonservierung.

5. Durchflusszytometrie

  1. Etikett Zellen nach der Herstellungr Angaben bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Lyse der roten Blutzellen in Zellsuspensionen aus Gewebefragmenten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml der Zell-Lyse-Puffer zu dem Zellpellet.
  2. Vortex sofort für 1 Sekunde und Inkubation von mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Führen Sie die markierten Zellen in einem Durchflusszytometer für die Datenerfassung ohne Waschen.

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Ergebnisse

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Enzymatische Verdauung von Gewebefragmenten entweder im Handel erhältlich Gewebedissoziation Lösungen oder verschiedene Labor Mischungen Kollagenase, DNase und / oder Hyaluronidase-Inhibitoren sind, schneiden eine Vielzahl von Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen. Unsere Studien, zunächst auf CD4 + T-Zellen infiltrieren Brusttumoren fokussiert wurden schnell mit einem großen technischen Problem wegen Spaltung Oberfläche CD4-Rezeptoren unter Verwendung von Standardprotokollen enzymatische Verdauung 4-...

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Diskussion

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Diese Studie beschreibt ein optimiertes Verfahren für die schnelle Herstellung von normalen und malignen Brust Gewebehomogenaten ohne enzymatische Verdauung für nachfolgende Zellsortierung, Extraktion, Kryokonservierung und / oder phänotypische Analyse von CD45 + Subpopulationen. Das Ziel dieser experimentellen Ansatz ist es, Bilder der TIL, die ihre in vivo Zustand genau wieder und vergleichen sie mit normalen Geweben mit minimaler Manipulation der Gewebe frisch aus dem OP-Saal zu produzieren. Bis h...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt fromthe belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS Arbeit Télévie, Plan Krebs Belgien, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson und Fonds Barsy.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GentleMacs DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine ist etwas gleichwertig
Zentrifuge 5810 REppendorfoder andere Standard Tischzentrifuge
Zentrifuge Zentrifuge 5417 REppendorfoder andere Standard Mikrozentrifuge
Esco Klasse II A2 BiosicherheitswerkbankESCO Globaloder andere Standard BSL2 Haube
Inverses MikroskopNikon eclipse TS100oder ein anderes Mikroskop, das für ein Hämazytometer
kompatibel ist; rker KammerMarienfield 640210oder anderes Standard-Hämazytometer
Navios DurchflusszytometerBeckman Coulteroder anderes Durchflusszytometer (8-10 Farben empfohlen)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine verwendet Filcon
ZellkulturschaleSarstedt72,710oder andere nicht-pyrogene Kunststoffartikel
Einweg-SkalpellSwann-Morton0510oder steriles Einweg-Skalpell
BD Cell Strainer 40 & micro; mBecton Dickinson734-0002oder andere nichtpyrogene Kunststoffe
BD Falcon Tube 50 mlBecton Dickinson352070oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
BD Falcon Tube 15 mlBecton Dickinson352097oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
BD FACS Tube 5 mlBecton Dickinson352008oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren
Sterile Pasteur Pipette 5 mlVWR612-1685oder andere pyrogene Kunststoffe
Mikrofuge Röhrchen 1,5 mlEppendorf7805-00oder andere nicht-pyrogene Kunststoffe
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qserumfreies Medium empfohlen
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLonzaBE17-516FStandard physiologisches PBS
TrypanblauVWR17942Eoder ein anderer lebenswichtiger Fleck
VersaLyseBeckman CoulterA09777für Durchflusszytometrie-Experimente
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780eBioscience65-0865-14für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD3 FITCBD Biosciences345763für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD4 PEBD Biosciences345769für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD8 ECDBeckman Coulter737659für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774für Durchflusszytometrie-Experimente
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643für Durchflusszytometrie-Experimente
Anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906für Durchflusszytometrie-Experimente

Referenzen

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Schlagwörter

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

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