Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Zusammenfassung

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Zusammenfassung

Die Netzhaut ist das Tor zu den visuellen Systems. Zur visuellen Signalverarbeitung Mechanismen zu verstehen, untersuchen wir retinale neuronalen Netzwerkfunktionen. Retinalen Neuronen in dem Netzwerk umfassen eine Reihe von Subtypen. Mehr als 10 Subtypen der bipolaren Zellen, Ganglienzellen und Amakrinzellen wurden durch morphologische Studien identifiziert. Mehrere Subtypen von retinalen Neuronen sind gedacht, um unterschiedliche Merkmale der visuellen Signalisierung, wie Bewegung und Farbe zu codieren, und bilden mehrere Nervenbahnen. Jedoch sind die funktionalen Rollen von jedem Neuron in der visuellen Signalverarbeitung nicht vollständig verstanden. Die Patch-Clamp-Methode ist hilfreich, diese grundlegende Frage zu beantworten. Hier ist ein Protokoll, um Licht-evozierte synaptische Antworten in Maus retinalen Neuronen mit Patch-Clamp-Aufnahmen im dunkeladaptierten Bedingungen aufnehmen wird. Die Maus Augen sind dunkeladaptierten O / N, und Netzhautschnittpräparate werden in einem dunklen Raum mit Infrarotbeleuchtung und Zuschauer seziert. Infrarotlicht nichtAktivieren Maus Photorezeptoren und damit bewahrt ihr Licht Reaktionsfähigkeit. Patch-Clamp verwendet, um Licht hervorgerufenen Reaktionen in retinalen Neuronen aufzuzeichnen. Ein Fluoreszenzfarbstoff während Aufnahmen auf neuronale morphologischen Subtypen charakterisieren injiziert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die physiologischen Funktionen von jedem Neuron in der Maus-Retina zu bestimmen.

Einleitung

Die Netzhaut ist einer der einzigartigen Teile des Nervensystems. Als zugänglicher Teil des Gehirns ist seine synaptische Architektur gut charakterisiert. Darüber hinaus können die Funktionen dieses neuronalen Netzwerks mit einem physiologischen Reiz untersucht werden: Licht. Wenn das Netzhautgewebe in einem dunklen Raum mit geeigneten Verfahren isoliert wird, reagieren Neuronen im Gewebe auf Licht. Dieses Präparat wurde verwendet, um die visuelle Signalverarbeitung zu untersuchen und verschiedene synaptische Mechanismen und Funktionen neuronaler Netzwerke sowie Krankheitsmechanismen aufzuklären.

Lichtreaktionen in retinalen Neuronen werden seit Jahrzehnten aufgezeichnet. Frühe Studien verwendeten scharfe Elektroden, um intrazelluläre Aufzeichnungen von Mudppy-Netzhautneuronen zu machen¹. In den 1980er Jahren wurde die Patch-Clamp-Technik erfunden² und wurde bald zu einer beliebten Methode unter Sehforschern^3,4. Einzelzellaufnahmen von niederen Wirbeltieren, einschließlich Mudpupppy- und Fisch-Netzhautneuronen, waren beliebte Methoden, die zur Aufklärung der Mechanismen der visuellen Signalverarbeitung beitrugen^5,6.

Nachdem genetische Mutationstechniken entwickelt wurden, wurde die Netzhaut der Maus ein beliebteres Modell für Sehforscher^7-9. Die Netzhaut von Säugetieren ist attraktiver als die von niederen Wirbeltieren, weil sie evolutionär näher an der menschlichen Netzhaut liegt und die Möglichkeit besteht, Krankheitsmodelle zu verwenden. Netzhautzellen von Mäusen sind jedoch klein und zerbrechlich¹⁰, und die Herstellung von Netzhautpräparationen und die Durchführung von Patch-Clamp-Aufzeichnungen in einem dunklen Raum ist eine Herausforderung. Mit der Verbesserung der Technologie stehen verschiedene Ansätze zur Untersuchung visueller Signalmechanismen zur Verfügung, wie z. B. bildgebende Untersuchungen¹¹ und das Elektroretinogramm (ERG)¹². Nichtsdestotrotz ist die Einzelzellaufzeichnung mit der Patch-Clamp-Methode nach wie vor wichtig, da sie im Vergleich zu anderen Methoden zeitlich und räumlich sehr sensitiv ist. Aus diesem Grund haben wir kontinuierlich Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchgeführt und unsere Methoden zur Untersuchung der visuellen Signalverarbeitung in Maus-Netzhautschnittpräparationen^{verbessert 13-15}.

In diesem Video-Tutorial werden die Protokolle mit wichtigen Tipps vorgestellt. Gute Aufnahmen können nur mit einer guten Vorbereitung gemacht werden. Das Üben des Sezierens von Tieren und der Bau eines robusten Patch-Clamp-Rigs ermöglichen es den meisten Forschern, erfolgreiche Aufnahmen zu erzielen.

Protokoll

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Wayne State University zugelassen.

1. Vorbereitung der Versuchslösung

1. Vorbereiten des Präparationslösung 1 Tag bis 1 Woche vor dem eigentlichen Experiment. Verwenden Sie ein HEPES-Pufferlösung für die Netzhaut Dissektion wegen seiner starken Pufferfähigkeit bei niedrigen Temperaturen ^16. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl _2, 1,0 MgCl _2, 10 HEPES, 28 Glucose. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Die Lösung wird in einem Kühlschrank bis zu 1 Woche.
2. Aufzeichnungslösung ist Ames 'Medium, das eine künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) für die Netzhautpräparate ¹⁷ ausgelegt ist. Mit dem Tag des Experiments abzuwiegen Ames-Pulver (4,4 g für 500 ml Lösung) in einem Rohr. Auch abwiegen NaHCO ₃ (0,95 g für 500 ml Lösung) und mit der A mischenmes "Pulver.
3. Bereiten Sie die intrazellulären Pipette Lösung für Patch Clamp Messungen von der Tag des Experiments. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 111 K-Gluconat, 1,0 CaCl _2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 _MgCl2, 5 ATP-Mg und 1,0 GTP-Na. PH-Wert auf 7,2 mit KOH. Filtern der Pipettenlösung mit einem herkömmlichen Spritzenfilter. Stellen Sie ~ 500 ul Aliquots und speichern sie in einem Gefrierschrank oder eine Tiefkühltruhe.

2. Vorbereitung für den Tag der Experiment

1. In der Nacht vor dem Experiment, legen Sie eine Maus in einen Käfig (C57BL / 6J oder ähnlichen Hintergrund, 4 - 8 Wochen alt, männlich) in einem dunklen Raum für O / N Dunkeladaptation.
2. Vorbereitung für die Präparation:
   1. Füllen Sie sezieren Lösung (100 - 200 ml) in einem Becherglas, legen Sie es auf Eis und Blase mit Sauerstoff für mindestens 10 min.
   2. Starten Sie die Sauerstoffversorgung des dunklen Kasten Netzhautvorbereitung Lagerung.
   3. Bereiten Kunststoffdeckgläser mit Fett Schienen für WiederDarm-Schnittpräparate und legen Sie jeden von ihnen in einem 35-mm-Kunststoffschale.
   4. Setzen Sie eine neue Rasierklinge zu einem Chopper (Gewebeschneidemaschine).
   5. Schneiden Sie einen Filtermembran in zwei Hälften. Dies ist für die Netzhaut-Schneiden.
   6. Richten Sie die Sezieren Werkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Binokular. Der Arbeitsbereich ist auch so gestaltet sein, dass jedes Werkzeug kann im Dunkeln leicht zugegriffen werden.
3. Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufnahmen:
   1. Löse Ames Pulver und NaHCO ₃ in destilliertem Wasser (Ames 4,4 g und 0,95 g NaHCO _3/500 ml ddH ₂ O). Blasen AMES 'Medium mit gemischten Sauerstoff (95% O ₂ und 5% CO ₂₎ für mindestens 30 min unter Erwärmen auf einem Aufzeichnungstemperaturniveau (~ 35 ° C). Den pH-Wert auf 7,4 mit NaHCO _3, während immer noch sprudelt.
   2. Tauen Sie den internen Pipettenlösung während der Präparation. Nachdem es aufgetaut ist, fügen 0,01% Sulforhodamin B für die intrazelluläre Färbung.

3. Netzhaut Dissection

1. In einem dunklen Raum, einschläfern der Maus unter Verwendung von Kohlendioxid und bilaterale Pneumothorax. Nach 2 - 3 min mit dem Kohlendioxid, wird die Maus das Bewusstsein verlieren.
2. Wenn die Maus reagiert nicht mehr auf einem Schwanz kneifen, schnell die Augen enukleiert und legen Sie sie in einem kalten Sektions Lösung in einer Kunststoffschale. Führen Sie die bilateralen Pneumothorax zum Tode des Tieres sicherzustellen. Schnell speichern das Auge in die Schüssel in der Dunkelheit ein. Verwenden Sie eine Infrarot-Viewer, um das Verfahren in der Dunkelheit zu führen.
   HINWEIS: Alternativ Isofluran, Enthauptung oder Genickbruch für Euthanasie verwendet werden. Die Methode der Euthanasie sollte die Leitlinien des National Institute of Health (NIH) und / oder der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss folgen.
3. In einem dunklen Raum, stellen Sie den Binokular und Infrarotbeleuchtung. Unter dem Mikroskop über ein Auge aus seiner Schale in eine 10 cm Plastikschale wit dem Sezieren Lösung gekühlt. Kontinuierlich Blase Sauerstoff durch das Rohr auf dem Boden des Kunststoffschale gegeben. Die Durchflussvolumen, damit es nicht zu gering, aber sicherzustellen, dass sie nicht hoch genug ist, um die Dissektion zu stören.
4. Hornhaut und Linse entfernen:
   1. Einen Einschnitt auf der Oberseite der Hornhaut mit einem mikrochirurgischen Messer. Halten des Sehnervs am anderen Ende des Augapfels verhindert das Auge bewegt. Erweitern Sie den Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Schneiden Sie die Hornhaut mit einigen Lederhaut um ihn herum.
   2. Schnappen Sie sich die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie das Objektiv langsam aus. Wenn der Glaskörper zu klebrig ist, um die Linse zu entfernen, schneiden Sie den Glaskörper mit einer Schere.
   3. Sobald die Augenmuschel gemacht wird, sanft gießen Sie kaltes, sauerstoff Sezieren Lösung in die Augenmuschel mit einem kleinen Transferpipette.
      HINWEIS: Der Augapfel schnell entleert, nachdem ein Einschnitt in der Hornhaut vorgenommen. Es ist wichtig, die Form des Auges, wie Verformen des Auges während dieser Pro aufrechtzuerhaltenverfahren wird die Netzhaut beschädigen und zu einer Netzhautablösung.
5. Die Ermittlung der dorsalen und ventralen Seiten der Netzhaut:
   HINWEIS: Aufgrund der ungleichen Verteilung der grünen und der ultravioletten (UV) Kegel ^18, Identifizierung einer bestimmten Netzhautbereich ist wichtig für die Lichtreaktion Aufnahmen.
   1. Identifizieren Sie die Linie, die über die Netzhaut-Augenmuschel vorbei an der Papille. Diese Linie verläuft meist auf der Bauchseite des Sehnerven; die Seite inklusive der Sehnerv ist die Rückenseite, während der andere ventral ^19. Sehen Sie dieses Wahrzeichen deutlich unter Infrarot Zuschauer.
   2. Je nach dem Zweck des Versuchs, einen Schnitt an der unnötige Neben. Dies kann hilfreich nach Trennen der Netzhaut von der Augenmuschel ist.
6. Glaskörperentfernung:
   1. Optional inkubieren Sie die Augenmuschel mit Hyaluronidase (0,5 mg / ml) für 15 min.
   2. Entfernen Sie den Glaskörper mit extra feinen Pinzette. Der Glaskörper ist in erster Linieauf dem Boden und der Außenkante der Okularmuschel angebracht. Entfernen Sie sie ohne sie zu berühren oder stoßen die Netzhaut. Da die Glaskörper kann fest an der Augenmuschel befestigt werden, entfernen Sie vorsichtig, um eine Netzhautablösung von der Augenmuschel zu vermeiden. Weiter zu ziehen, bis keine Spannung erreicht ist.
      Anmerkung: Dieser Schritt ist besonders wichtig für Sezieren der Mausretina; es ist jedoch kein Problem für den Netzhäuten von anderen Spezies, wie Ratten und Salamander.
7. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Besorgen Sie sich die Lederhaut und sanft ziehen Sie die Netzhaut unter Verwendung der Rückseite der Zange.
   HINWEIS: Whole-Mount-Netzhaut-Präparate können aus der isolierten Netzhaut durchgeführt werden. Stellen Sie drei vor vier Schnitte an den Kanten und glätten die Netzhaut, oder schneiden Sie die Netzhaut in mehrere Stücke.
8. Schneiden Sie die Netzhaut und entsorgen Sie die unnötige Hälfte der Netzhaut (Schritt 3.5). Im gleichen Kunststoffschale, schneiden Sie die restlichen Netzhaut in zwei Stücke. Für jedes Stück der Netzhaut, schneiden Sie die Ränder um ein zu machenNetzhaut-Platte, und schneiden Sie die Falzkanten.
9. Übertragen einer Netzhaut-Platte auf eine Glasplatte mit einem großen Transferpipette (~ 2 ml). Saugen Sie die überschüssige Lösung mit einer kleinen Pipette, mit einem Stück Filterpapier, um die Platte zu glätten, und dann schnell legen Sie ein Stück der Filtermembran auf der Oberseite des Gewebes.
   1. Mit einem kleinen Transfer Pipette einen Tropfen Sezieren Lösung auf der Filtermembran. Warten Sie ca. 15 Sekunden, bis die Lösung erstreckt sich über der Membran. Während dieser Zeit wird das Netzhautgewebe, um die Filtermembran haften.
   2. Pour mehr kalte Sezieren Lösung unter und um den Filter. Das Retinagewebes mit der Filtermembran wird schwimmen. Besorgen Sie sich die Filtermembran mit einer Pinzette und legen Sie sie in der Schneidkammer. Gießen Sie sezieren Lösung über das Gewebe, und speichern Sie die Zubereitung in der Dunkelheit ein.
      HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren ist von entscheidender Bedeutung. Es ist wichtig, diese Schritte schnell durchzuführen, um sicherzustellen, daß die Netzhautgewebe klebt an den Filter memBrane und trocknet nicht aus.
10. Mit einem Chopper, schneiden Sie das Netzhautgewebe in Scheiben schneiden. Rund 200 um Dicke machbar für Patch-Clamp-Studien.
11. Legen Sie eine Kunststoff-Deckglas mit Fett Schienen im Schneideraum. Übertragen einer Netzhaut-Scheibe auf der Oberseite der Fett Schienen auf einer Kunststoffdeckglas. Drehen Sie die Scheibe um 90 °, so dass der Querschnitt zu sehen ist. Drücken Sie die Filtermembran nach unten auf das Deckglas, dann decken Sie die Seiten des Filterpapier mit Fett.
    1. Nachdem die Scheibe auf einer Kunststoffdeck immobilisiert, schnappen Sie das Deckglas und überträgt es auf einer 35 mm Kunststoffschale. Gießen Sie kaltes Sezieren Lösung auf die Netzhaut-Vorbereitung und tauchen die Vorbereitung. Bewahren Sie die Schale in den dunklen Kasten, der kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert werden soll.
       ANMERKUNG: Das gesamte Verfahren muss sorgfältig durchgeführt, so dass die Filtermembran nicht deformiert werden. Andernfalls wird der retinaler Scheibe leicht trennt von der Filtermembran.

4. Patch-Clamp-Aufnahmen von Netzhaut Scheibe Vorbereitung

1. Aufnahme der Zubereitung:
   1. Prime die Perfusionsschläuche mit Ames 'Medium. Lassen Sie alle Blasen passieren beim Füllen der Schläuche.
   2. Stellen Sie Patch-Clamp-Aufzeichnung Pipetten mit einem Abzieher. Um eine Pipette mit der Pipettenlösung, Sprung in die Rückseite einer Pipette 1 min zu füllen, bis die Pipettenspitze aufgefüllt. Als nächstes füllen ~ 1/3 der Pipette mit einer Mikropipette Füllstoff. Bewahren Sie die Pipette in einem feuchten Pipettenfeld.
   3. Schalten Sie die Geräte für Patch-Clamp-Aufnahmen; einschließlich des Computers, Verstärker, CCD-Kamera und Mikroskop.
2. Schalten Sie die Raumbeleuchtung. Setzen Sie ein Netzhaut-Schnittpräparat auf den Mikroskoptisch Kammer mit einem Infrarot-Betrachter. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen kontinuierliche Perfusion. Stellen Sie die Perfusion Temperatur bei 33 bis 37 ° C.
3. Sehen Sie sich die Scheibenoberfläche mit der CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf die Zielposition, wo das Ziel cell Arten befinden. Wählen Sie eine gesund aussehende Zelle für Patch-Clamp-Aufzeichnung (dh es sollte glatt aussehende Oberfläche und eine gute Zellform haben).
4. Legen Sie eine Aufnahme Pipette in einer Pipettenhalter. Voraus die Pipette auf die Schnittpräparat. Wenn es in der Nähe der Schnittpräparat (~ 2 mm oben) finden die Spitze der Pipette mit dem Mikroskop. Sobald der Pipettenspitze ist unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle.
5. Stellen Sie den Verstärker. Stellen Sie die Pipette bei 0 mV / pA 0 (Nullstellung) und starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls von ca. 5 mV bei ~ 10 Hz. Prüfen Sie die Pipette Widerstand; idealen Widerstand zwischen 5 und 10 M für die meisten Netzhautneuronen.
6. Starten Ausblasen von der Spitze. Verwenden Sie ein Mundstück, oder verwenden Sie eine Spritze, um Überdruck anzuwenden, wenn die Pipette taucht in der Badlösung. Kontinuierlich Ausblasen der internen Lösung, bis die Spitze ist auf der Oberfläche der Zielzelle.
   1. Wenn der Überdruck macht einen kleinen Grübchen auf the Zelloberfläche, voranzutreiben die Spitze leicht und Stop Ausblasen. Prüfen Sie die Pipette Widerstand, der zu erhöhen sollte. Wenn es ständig zu, lassen Sie es und Überwachung der Resistenz bis> 1 G (Giga) erreicht. Wenn der Widerstand nicht spontan zu erhöhen, leicht negativen Druck ausüben, bis es eine undurchlässige.
7. Nach dem Gigaseal erreicht ist, ändern Sie die Haltepotential auf -70 mV. Dann intermittierenden negativen Druck, um die Membran im Inneren der Pipettenspitze Bruch anzuwenden. Wenn der Gesamtzellkonfiguration hergestellt ist, kann die Pipettenwiderstand zwischen 500 MOhm und 1 GOhm, und der kapazitive Strom zu sehen sein. Manchmal spontane postsynaptischen Ströme beobachtet werden kann.
8. Notieren Sie sich die IV-Beziehung von -80 bis +40 mV. Verschiedene Typen von spannungsabhängigen Kanäle aktiviert je nach Zelltyp.
9. Nehmen Licht-evozierte synaptische Ströme oder Spannungen.

Ergebnisse

Eine repräsentative Schnittpräparat ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Schnittpräparat in einer geraden Position, welche Photorezeptoren Ganglionzellen in einer flachen Oberfläche, und keine Ablösung vom Filterpapier. Wenn eine Scheibe geneigt ist, ist nur ein Teil der Vorbereitung im Fokus, was es schwierig macht, eine geeignete Zelle für Patch-Clamp identifizieren. Für Aufnahmen ist es wichtig, eine gute Soma, die in der Regel hat eine glänzende Oberfläche, eine gleichmäßige runde Form, und keine sic...

Diskussion

Gute Aufnahmen können nur mit einer guten Netzhautvorbereitung und gut durchdachten Patch-Clamp-Setups gemacht werden. Obwohl alle oben beschriebenen Schritte wichtig sind, werden in der Diskussion einige kritische Schritte sowohl für die Sektion als auch für die Aufzeichnung hervorgehoben.

Für die Dissektion sind zwei Dinge besonders wichtig: Kühlung und Sauerstoffversorgung. Nach der Enukleation des Auges wird der vordere Teil des Auges in einer Präparierkammer mit sauerstoffblasenartiger, ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mäuse (28-60 Tage alt, männlich)	Jackson Labor	C57BL/6J Stamm
Ames' mittleres Pulver	Sigma	A1420	ausgezeichnet
Stereomikroskop	Nikon	SMZ745	ausgezeichnet
Präparierwerkzeug: Pinzette	Dumont	#4, #5, #55	ausgezeichnet
Präparierwerkzeug: Schere	Roboz	RS-5605	ausgezeichnet
Präparierwerkzeug: Chirurgiemesser	Surgistar	7514	ausgezeichnet
Rasierklinge (für Zerkleinerer)	EMS	71970	ausgezeichneter
Häcksler	handgefertigter
Infrarotbetrachter	Nachteule Optik	NOBG1	Es zeigt helle Ansicht. Das Fokussieren kleiner Objekte ist ein Problem.
Abzieher	Sutter	P-1000	ausgezeichnet; stellt Pipetten in gleichbleibender Größe her.
Dark Box	Pelican	Dark Box	ausgezeichnet
Patch Clamp System	Scientifica	Slice Scope 2000	Ausgezeichnetes Setup. Die meisten Schlüsselkomponenten sind in einem Paket enthalten. Mikromanipulatoren eignen sich hervorragend.
Verstärker	Molecular Devices	multiclamp 700B	Hervorragende und einfache Steuerung.
Erwerb der Software	Molecular Devices	pClamp Software	Hervorragende und einfache Steuerung.
Lichtquelle (LED)	Coole LED	pE-2 4-Kanal-System	Ausgezeichnete
CCD-Kamera	Q-Imaging	Retiga 2000	Ausgezeichneter
Faradayscher Käfig	handgefertigt