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Methodenartikel

Ein

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DOI:

10.3791/52436

⸱

8. Januar 2015

 ,  , 
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

Zusammenfassung

Das Studium der Hormonwirkung in der menschlichen Brust durch Mangel an geeigneten Modellsystemen behindert. Bei der In-vitro-Kultur, Grund Brustepithelzellen neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression zu verlieren. Weit verbreitete Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs-Zelllinien sind von begrenzter Relevanz für die in vivo-Situation. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren. Frische menschlichem Brustgewebe Proben aus chirurgischen Ablagematerial wie Reduktion mammoplasties oder mammectomies mechanisch und enzymatisch verdaut, um Gewebefragmente, die Kanäle und Läppchen und mehrere Stroma-Zelltypen zu erhalten. Diese Gewebemikrostrukturen in Basismedium ohne Wachstumsfaktoren gehalten bewahren ihre interzellulären Kontakte, die Gewebearchitektur und bleiben Hormon für einige Tage reagiert. Sie sind ohne weiteres für RNA- und Proteinextraktion, histologische Analyse bearbeitet oder in Gefriermedium gespeichert. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische Zellpopulationen anzureichern. Dieses Protokoll bietet eine einfache, Standardansatz für die translationale Studien mit sehr komplexen, vielfältigen menschlichen Proben.

Einleitung

Informationen über die Mutations Landschaft in Brustkrebs ist in hohem Tempo zu. Weniger Aufmerksamkeit wurde auf systemische Faktoren, die die Entstehung von Brustkrebs beeinflussen bezahlt worden. Die Exposition gegenüber Fortpflanzungshormone hat einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf 1-3. Dennoch sind die Mechanismen, durch die Fortpflanzungshormone treffen auf die menschliche Brust kaum verstanden. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mausmodellen hat ergeben, dass sie Zell intrinsische und parakrine Signal durch mehrere Effektoren 4 einzubeziehen.

Die begrenzte Wissen über die Hormonwirkung in der menschlichen Brust ist vor allem auf das Fehlen angemessener Modelle. Die meisten arbeiten auf die Mechanismen der Östrogenrezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) Signalisierung Hormonrezeptor-positiven Brustkrebszelllinien, wie zum Beispiel MCF-7 und T47D geführt. Diese wurden aus Pleuraergüsse von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die alrea hatte abgeleitetdy erhielt mehrere Behandlungen 5. Die biologische Relevanz der Ergebnisse in einer solchen einfachen in vitro-Modellen der menschlichen Brust ist fragwürdig und Zielgene in diesen in vitro-Modellen identifiziert sind unterscheiden sich von Zielgenen, die in Tiermodellen 6 identifiziert. Beim primären menschlichen Brust Epithelzellen in vitro kultiviert werden sie neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression und damit Hormonantwort 7,8 verlieren. Dieses Problem kann durch anspruchsvolle 3D-Ansätze mit Matrigel circumventd werden. Auf diese Weise, C. Clarke und Mitarbeitern gelang Festlegung Brustepithelzellen die Hormon-Rezeptor-Expression erhalten und zeigte eine proliferative Reaktion auf Progesteron Stimulation 9. Noch zwei in vivo Progesteronrezeptorzielgene wichtig, Wnt-4 und RANKL, wurden nicht von Progesteron Stimulation in diesem System 9 induziert. Dieser Ansatz wurde kürzlich weiter mit in vitro genommen Hormonvorbehandlung und RANKL Induktion 10 erreicht. Ein Vorbehalt bleibt, dass Matrigel hat Aktivitäten, die chargenabhängig sind, ist teuer und erfordert eine Versuchsanordnung, die geeignet sind für kleine Zahlen nur Zelle ist.

Basierend auf der Erkenntnis, dass in vivo ER und PR-Signalisierung werden weitgehend durch parakrine Interaktion 11 vermittelten wir argumentiert, daß die intrazellulären Wechselwirkungen beibehalten werden müssen. Ein weiterer wichtiger Faktor, der als Gewebe verloren werden, um einzelne Zellen zur in vitro Kultur dissoziiert sind die Wechselwirkungen der Epithelzellen mit der extrazellulären Matrix; doch diese sind entscheidend für die epitheliale Differenzierung und ihre Störung ist in der Tumorgenese 12 wichtig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, um Brustgewebe Mikrostrukturen aus frischen chirurgischen Ablagematerial 13 zu isolieren. Das Brustdrüsengewebe, bestehend aus einem zweischichtigen Epithel mit inneren und äußeren Lumen myoepithelial Zellen wird von Fettgewebe präpariert und in mechanische und enzymatische Dissoziation unterworfen. Nach dem Waschen und Zentrifugation werden Fragmente der Milchgänge erhalten, die auf enger Interaktion mit vielen Stromazellen behalten. Diese Gewebemikrostrukturen bleiben Hormon reagieren. Das Modell wurde in klinischen Proben 13 validiert. Als solches kann das vorliegende Verfahren dazu beitragen, die Hormonwirkung in der Brust in einem biologisch und klinisch relevanten Kontext zu untersuchen.

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Protokoll

Allgemeine Überlegungen: Der Zeit voraus, bis eine Ethik-Protokoll eingestellt, bereiten Fragebögen für Patienten, und sehen auf die Ausbildung der Klinikpersonal. Bevor Sie Material aus Brustverkleinerung Chirurgie, beschaffen Genehmigungen und sorgen Zustimmung des Patienten. Gewebe können infektiös sein und muss entsprechend behandelt werden. Schweizerisches Institut für experimentelle Krebsforschung - Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der ISREC zugelassen.

1. Die Gewebewiederherstellung, Herstellung und Bio-Banking

Um eine optimale Probenqualität für bio-Banking zu gewährleisten, sind eine Reihe von Schritten, die im Krankenhaus vor dem Labor transportiert geführt.

Im Krankenhaus:

  1. Erhalten menschlichen Brustgewebe unter sterilen Bedingungen aus Brustverkleinerung Chirurgie und Blutproben, falls erforderlich. Tissue muss von Pathologen, probieren wird, um die Anwesenheit von malignen Läsionen auszuschließen untersucht werden.
  2. Setzen Sie den Brust tAusgabe unter der Haube auf einem sterilen Bord und bereiten Schere, chirurgische Skalpell und Pinzette, die bereits mit Dampf sterilisiert werden. Stellen tiefen Schnitt an verschiedenen Standorten des Brustgewebe mit einem Skalpell zu öffnen. In menschlichem Brustgewebe Ihre weißen Litzen aus Leitungen und Läppchen, die in gelben Fettgewebe eingebettet sind.
    ANMERKUNG: Das Verhältnis der weißen parenchymalen zum gelben Fettgewebe unterscheidet bei Frauen; Regel jüngere Frauen haben mehr Epithelgewebe.
  3. Wählen Stücke aus weißem Material und halten Sie sie mit einer Pinzette, dann trennen Sie diese vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Schere. Vermeiden Sie, die Blutgefäße.
  4. Rinse Gewebestücke in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, um Blut zu entfernen. Übertragen des Gewebes zu 250 ml Kunststoffflaschen mit F12-Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium F12) ohne Phenolrot mit 2% Penicillin / Streptomycin (einschließlich 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 g / ml Streptomycin) und 1% eintibiotic / Amphotericin B (einschließlich 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 & mgr; g / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B). Speicher Gewebe in dem Medium für den Transport zum Labor.
  5. Bereiten Stücke 3-5 mm Durchmesser für RNA- und Protein-Extraktion und Flash frieren sie in Kryoröhrchen mit kaltem (Trockeneis) Isopentan. Übertragen Sie sie auf Trockeneis-Box für den Transport zum Labor.
  6. Setzen Stücke 3-5 mm in die Form und decken Sie es mit einer Schicht von optimalen Schnitttemperatur (OAT) und dann die Form auf dem flachen Boden der Box mit kaltem Isopentan gefüllt. Nach vollständigem Einfrieren übertragen Sie die Form auf die Trockeneis-Box.
  7. Fix 5 Stück 3 - 5 mm Durchmesser in Paraformaldehyd (PFA) 4% und noch 5 Stück in Formaldehyd (FA) 4% in PBS bei RT histologische Analyse später. Zwei verschiedene Fixiermittel werden empfohlen, da einige Antikörper besser mit dem einen oder anderen der beiden.

Im Labor:

  1. Tuncument alle Informationen über die Brustverkleinerung, werden Operationsdatum und ob die Proben aus linken und rechten Brust abgeleitet.
  2. Legen Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C und übertragen Sie die fixierten Gewebe in der Histologie Kassetten nach 2 h der Fixierung. Dann setzen sie entweder in PBS oder 70% Ethanol, zum O / N Lagerung bei 4 ° C. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung.

2. Die Gewebeaufschluss und Hormonstimulation

  1. Übertragen Sie die Flaschen mit den Gewebeproben auf eine Sterilbank in einer P2 Zellkulturraum. Zeigen Gewebestücke auf sterilen Schneidebrett (29 x 19 cm). Halten Sie das Material mit einer Pinzette und kratzen die restlichen Fett und Behälter weg von der Drüsenkörper (weißer Teil) mit Skalpell. Legen Sie das weiße Material in PBS in einer 10 cm Kulturschale.
  2. Nach dem Entfernen des Fettmaterials aus allen Stücken und Entsorgen sie nach der Sicherheitsregels des Labors, legen Sie die weißen Teile mit den epithelialen Geweben zurück auf dem Schneidebrett. Mit entgegen Skalpelle schneiden das Gewebe und hacken sie in Stücke von bis zu 2 mm Durchmesser.
  3. Legen Sie die gehackte Material in Röhren von ausreichender Größe: bis zu 1, 2.5 und 10 ml in einen 5, 15 oder 50-ml-Röhrchen auf. Regel ergibt sich eine 5-ml-Tube Erträge genug Material für Paraffineinbettung und Hormonstimulationen, und ein 15-ml-Tube Erträge genug Material für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Größere Rohre zum Einfrieren Aliquote verwendet.
  4. Bereiten Verdauung Master-Mix, bestehend aus Medium (DMEM / F12 ohne Phenolrot) mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B und Kollagenase A (Clostridiopeptidase A aus Clostridium histolyticum). Dosis Kollagenase nach Aufschlusszeiten.
    1. 12, 24 und 36 h Inkubation verwenden Endkonzentration von Kollagenase von 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml und 0,5 mg / ml. Fügen Verdauung Mastermix bis zu 4 mal derVolumen des aufgeschlossenen Material eine ausreichende Bewegung und Belüftung zu gewährleisten.
      HINWEIS: In Abhängigkeit von der Versuchsanordnung und der Dauer der Hormonstimulation, fügen Hormone entweder während oder nach der enzymatischen Aufschlußschritt und Mikro Erholung.
  5. Hinzufügen Hormon (e) bei gewünschten Konzentration Proben und das Fahrzeug zu der Kontroll testen. Für die Stimulation mit 17-β-Östradiol und Promegeston (R5020) verwenden eine Endkonzentration von 20 nM.
    HINWEIS: R5020 ist ein synthetisches Progesteron-Rezeptor-Agonist, der stabiler ist als natürliches Progesteron im Medium ist.
    1. Die Röhrchen auf dem Rollenmischer innerhalb einem Brutschrank bei 37 ° C und 40 rpm O / N. Vor dem Einsetzen der Proben auf dem Mischer resuspendieren sie sehr gut, um zu gewährleisten, dass alle wesentlichen verteilt entlang der Zentrifugenröhrchen.
  6. Wie die Verdauung dauert mindestens 12 Stunden (O / N), für die Hormonstimulation Zeiten von weniger als 12 Stunden, fügen Sie die Hormone nach der Wiederherstellung der Mikrostrukturen (deunter Schritt 3 tailed). Fügen Sie die Hormone, wie Sie die Mikrostrukturen zu resuspendieren und legen Sie die Suspension auf ultra-niedrige Befestigungsplatten. Gewebemikrostrukturen auf ultra-niedrige Befestigungsplatten für bis zu 7 Tage in Wachstumsfaktor-freiem Medium zu bewahren etwa 70% Lebensfähigkeit gehalten werden.
  7. Für RNA- und Protein-Analyse, sammeln Gewebemikrostrukturen durch Zentrifugation bei 400 xg für 5 min und Flash-Freeze in Zentrifugenröhrchen.

3. Wiederherstellung von Gewebe-Mikrostrukturen

  1. Zentrifugieren (n) bei 400 xg für 5 min. Absaugen Fett von der Spitze des Zentrifugenröhrchens und den Überstand des verbleibenden wäßrigen Flüssigkeitsüberstand, die in Fibroblasten angereichert ist, um ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 1250 × g für 5 min.
    HINWEIS: Da die Brustgewebe Mikrostrukturen sind sehr klebrig, für alle folgenden Schritte das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre. Pipettieren wird wegen der Gefahr, die Materialien empfohlen.
  2. Resuspendieren des Pellets in Mikrostrukturen und in Fibroblasten von wäßrigen Flüssigkeitsüberstand in PBS, 2% fötales Kälberserum (FCS) angereichert ist, abgeleitet. Beide Schläuche Anschließend drehen sich mit 1250 xg für 5 min und dann verwerfen Sie die Überstände.
  3. Resuspendieren der Pellets in 3-5 ml Erythrozytenblut Lysepuffer und sie auf Rohre reinigen. Inkubieren für 5 min bei RT.
  4. Hinzufügen 2x Volumen PBS, 2% FCS und zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Waschen der Pellets mit PBS, 2% FCS und Zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

4. Proben für die Durchflusszytometrie

  1. Fügen Sie 1-2 ml Trypsin 0,25% zu dem Pellet und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren sehr schonend für 2 min mit einem 1000 ul Pipetman, um Zellen zu trennen.
  2. Hemmt Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 9 ml PBS, 2% FCS. Zentrifuge bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 10 ml PBS, 2% FCS.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 40 um Zellsieb auf T platziertop einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf einzelne Zellen herzustellen. Wenn ein paar Mikroliter der Zellsuspension bleiben auf der Oberseite des Filters, damit sie durch den Filter durch Absaugen sie von der anderen Seite des Sieb mit einer Pipette und fügen Sie sie zu den gefilterten Mikrostrukturen.
  4. Separate Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen von Mikrostrukturen mit einem Cocktail von Anti-CD45, anti-FAP und Anti-CD31-Antikörper und dann sortieren sie mit FACS, basierend auf pan-epithelialen Marker EpCAM und CD10 auf luminalen und basalen Zellen bzw. trennen 10 .

5. Die Proben für die Histologie

  1. Nach dem Waschen der mechanisch und enzymatisch abgebaute Material, wie oben beschrieben, zu fixieren Pellets von 1,5 ml Ausgangsmaterial in 1 ml 4% PFA in PBS bei RT für 30 min.
  2. Zentrifuge bei 1.250 xg für 5 Minuten und wäscht mit 1-2 ml PBS zweimal.
  3. Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min. Während dieser Zeit vorzubereiten 1% Mehrzweck-Agarose in Tris-Acetat-EDTA (TAE-Puffer) und erhitzt die Lösung in der Mikrowelle, bis die Lösung zum Sieden kommt.
    1. Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und die Flasche vorsichtig schwenken, um die Lösung zu mischen und resuspendieren alle verbleibenden Agarosepartikel. Kühle Agaroselösung bis 50 ° C und gießen 1 ml in einem Paraffinbasisform Größe 31 × 23 × 13,5 mm.
  4. Überstand verwerfen und legen Sie die Pellets auf der verfestigten Schicht (1 - 3 mm) aus Agarose mit einem Spatel mit einem flachen Ende. Decken Sie sie alle mit einer zusätzlichen Schicht aus Agarose (40 ° C).
  5. Nachdem die Agarose erstarrt, in der Regel innerhalb von 5 Minuten, legen Sie die Agarose-Blöcke in die Histologie Kassetten für Paraffineinbettung. Zusammen mit der Agarose-Proben stellen einen weißen Büro Papier in der Kassette mit allen Informationen über die Brustverkleinerung Zahl, Versuchsbedingungen, und das Datum in kleiner Schrift mit Bleistift geschrieben; dies schriftlich wider alle weiteren Behandlungsschritte.
  6. Setzen Sie die Kassetten inPBS O / N, oder in 70% Ethanol für die Lagerung über das Wochenende bei 4 ° C. Wir haben keinen Unterschied zwischen den beiden Speicherlösungen bemerkt. Dann Transfer Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung.

6. Gefriermikrostrukturen (Future Kultivierung)

  1. Resuspendieren Gewebemikrostrukturen in Einfriermedium bestehend aus FCS mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und gefrier 1 ml Aliquots in Kryoröhrchen. Die Anzahl der erhaltenen Kryoröhrchen hängt von der Menge von Brustverkleinerung erhalten Vormaterial.
  2. Einfrieren der Kryoröhrchen enthaltenden Gewebemikrostrukturen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank mit dem folgenden Programm: 5 min Verweilen bei 4 ° C, Absenken der Temperatur auf -7 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, die Verringerung der Temperatur auf -12 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, 10 min Behausung, Absenken der Temperatur auf -40 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, Abnahme der Temperatur auf -80 ° C mitGeschwindigkeit von 6 ° C / min. Dann übertragen Sie die Kryoröhrchen bis -80 ° C Tiefkühltruhe.
  3. Am nächsten Tag, übertragen die Kryoröhrchen von -80 ° C bis Flüssigstickstofftank für lange Lagerung.

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Ergebnisse

Um die Rolle von Östrogen und Progesteron zu studieren und ihre molekularen Funktionen in der menschlichen Brust, besser zu verstehen, erfassen wir frischen menschlichen Brustgewebeproben von Patienten, die eine Reduzierung mammoplasties (Abbildung 1) nach Erlangung ihrer Einwilligung nach Aufklärung. Wir erhalten auch medizinische und Fortpflanzungsgeschichte der Patienten sowie eine Blutprobe an Serumprogesteronspiegel zum Zeitpunkt der Operation zu bestimmen. Gewebe aus frischen Reduzierung mammoplas...

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Diskussion

Das beschriebene ex vivo Kultur vorsieht Brustgewebe Mikro enthaltende intakte Kanäle und Läppchen, zusammen mit anderen Zelltypen, die normalerweise im menschlichen weiblichen Brust gefunden. Bei der Verarbeitung des menschlichen Brustgewebe gewöhnlich durch Reduktion mammoplasties erhalten, Entfernung von Fettgewebe, mechanische und enzymatische Verdauung des Stromamatrix und Lyse roter Blutkörperchen reichert Milchkanal Fragmente und Klemmen duktalen lobulären Einheiten. Gentle enzymatische Verdauung an der ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken M. Fiche von Universitätsspital Lausanne für die Bereitstellung der mammoplasty Foto, M. Wirth und A. Ayyanan der Schweizerischen Institut für Experimentelle Krebsforschung, National Center of Competence in Research Molekulare Onkologie, School of Life Sciences, Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne für die technische Unterstützung und R. Clarke der Universität Manchester für Kritik. Die Forschung, die diese Ergebnisse Unterstützung SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, und die Initiative Innovative Arzneimittel gemeinsames Unternehmen gemäß Finanzhilfevereinbarung erhalten hat, nicht. 115.188, Ressourcen, von denen der Finanzbeitrag aus dem Siebten Rahmenprogramm der EU (FP7 / 2007-2013) und European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Unternehmen in Sachleistungen bestehen. Die Web-Adresse der Initiative Innovative Arzneimittel ist http://www.imi.europa.eu/ .

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mikroliter-ZentrifugeHeraeus Biofuge Fresco75005521
Zentrifuge 5810REppendorf5810 000.327
KryoboxNalgene   5100-0001
Gefrierschrank mit kontrollierter Rate EF600 GrantAsymptote EF600
CO2 InkubatorHera Cell Heraeus51022391
Rollenmischer SRT9DSturtSRT9D
Histologie-KassettenMedizintechnik81-0021-00
Cell StrainerFalcon352340
Strile Chirurgische Klinge AesculapBB536 
SkalpellAesculapBB084R
PinzetteAesculapBD047R
SchereAesculapBC374R
Paraffin-BasisformSAKURA4166
Optimale Schnitttemperatur (OCT) KryomatrixThermowissenschaftliche6769006
Penicillin/Streptomycin Life Technologies15070-063
Antibiotikum/AntimykotikaLife Technologies15240-062
DMEM F/12Life Technologies11039-021Vorwärmen (37 &Grad; C)
KollagenaseRoche11 088 793 001Vorwärmer (37 ° C)
Fötales RinderserumLife Technologies10270Kann durch fötales Kälberserum
Cell Blood Lysis Bufferersetzt werden SigmaR7757
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD2650
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
AgaroseInvitrogen16500-500
FormaldehydSigmaF1635
ParaformaldehydRoth335
IsopentanSigmaM32631
EthanolMerck1009831000
Kryofläschchen (5,0 ml)VWR, International479-0820
Kulturschale mit ultraniedrigem AufsatzCorning, NY 148313471

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 2/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

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Menschliches BrustgewebeGewebemikrostrukturenenzymatischer Verdaufluoreszenzaktivierte ZellsortierungHormonansprechbarkeitstromale vaskuläre FraktionDurchflusszytometrieRNA-Extraktionhistologische Analyse
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