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Methodenartikel

Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten

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DOI:

10.3791/52442

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27. Mai 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Indoxylglykoside sind etablierte und weit verbreitete Werkzeuge für das Enzymscreening und die Überwachung der Enzymaktivität. Insbesondere für glukoseartige Strukturen erwiesen sich frühere Synthesen als schwierig und ergiebig. Unser neuartiger Ansatz verwendet Indoxylsäureester als wertvolle Zwischenprodukte, um eine beträchtliche Anzahl von Indoxylglykosiden in guten Ausbeuten zu erhalten.

Zusammenfassung

Indoxyl Glykoside erwies sich als wertvolle und vielseitige Werkzeuge zur Überwachung Glycosidase Aktivitäten. Indoxyle durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt und werden schnell oxidiert, beispielsweise durch Luftsauerstoff, um Farbstoffe Indigo. Diese Reaktion ermöglicht eine schnelle und einfache Screening in vivo ohne Isolierung oder Reinigung von Enzymen sowie Schnelltests auf Agarplatten oder in Lösung (zB blau-weiß Screening, Mikrovertiefungen) und ist in der Biochemie verwendet, Histochemie, Bakteriologie und molekularen Biologie. Leider ist die Herstellung solcher Substrate als schwierig erwiesen, aufgrund verschiedener Nebenreaktionen und die geringe Reaktivität des Indoxyl Hydroxylfunktion. Speziell für Glukose artigen Strukturen geringe Ausbeuten beobachtet. Unser neuartiger Ansatz beschäftigt indoxylic Ester als Schlüssel-Zwischenprodukte. Indoxylic Estern mit unterschiedlichen Substitutionsmuster wurden auf skalierbare Wege vorbereitet. Phasentransfer Glycosylierungen mit den Akzeptoren und peracetyliertenGlycosylhalogeniden kann unter herkömmlichen Bedingungen in hohen Ausbeuten durchgeführt werden. Esterspaltung und nachfolgende milde Silber vermittelt Glykosylierung ergibt die peracetylierten indoxyl Glycoside in hohen Ausbeuten. Schließlich Entschützung nach Zemplén geführt.

Einleitung

Über lange Zeit war die Herstellung von Indigo ein wirtschaftlich sehr wichtiger Prozess. Bevor großtechnische chemische Synthesen kostengünstigen Zugang zu Indigo ermöglichten, wurden die Vorläuferstoffe bereits vor christlicher Zeitrechnung aus natürlichen Quellen gewonnen. Der Anbau indigoproduzierender Pflanzen (natürliches Indigo) in Europa wurde im 17th Jahrhundert unrentabel, da der Gehalt an Indigovorläufern in der indischen Indigopflanze (0,2–0,8 %) etwa 30-mal höher ist. Gegen Ende des 19. Jahrhunderts verdrängte die chemische Synthese von Indigo den herkömmlichen Anbau1,2.

Natürlicherweise in Pflanzen vorkommende Indigovorstufen umfassen Indican (1), Insatan A (2) und Isatan B (3) (Abbildung 1). Alle bestehen aus einem mit einer glycosylierten Restgruppe verbundenen Indoxyl-Motiv. Der Abbau der glycosidischen Bindung, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, führt zur Freisetzung von Indoxyl (4). Indoxyl selbst ist nahezu farblos, kann aber rasch zu einem Indigofarbstoff (5) oxidiert werden. Diese empfindliche Reaktion wurde in der Biochemie, Histochemie, Bakteriologie und Molekularbiologie zur Überwachung enzymatischer Aktivitäten angepasst. Eine Aktivitätsprüfung in vivo, ohne Isolierung oder Reinigung der Enzyme, sowie schnelle Tests auf Agarplatten oder in Lösung (z. B. Blau-Weiß-Screening, Mikrogefäße) sind möglich. Abhängig von der mit der Indoxyl-Einheit verknüpften Restgruppe (z. B. Ester, Glycoside, Sulfate) wurden geeignete Substrate für verschiedene Enzymklassen (z. B. Esterasen, Glycosidasen, Sulfatasen) entwickelt3. Im Folgenden steht die Bildung und Anwendung von Indoxylglycosiden im Mittelpunkt.

Diagramm des Indican-Hydrolyseprozesses mit Darstellung von Indolderivaten und der Bildung von Indigofarbstoff.
Abbildung 1: Natürliche Indigovorstufen und Bildung des Indigofarbstoffs durch Hydrolyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Das Substitutionsmuster des Indoxylrests bestimmt die Farbe und die physikalischen Eigenschaften des resultierenden Indigofarbstoffs. Die gebräuchlichsten Substitutionsmuster sind 5-Bromo-4-chloro (abgekürzt mit X; grünlich-blau), 5-Bromo (blau) und 5-Bromo-6-chloro (magenta), da diese die kleinsten Farbstoffpartikel bilden, keine Granula ausbilden und die geringste Diffusion von den Hydrolysestellen aufweisen. Letztere Eigenschaft ist besonders wichtig für in vivo-Experimente3.

Der erste Bericht über ein indigogenes Verfahren zur Nachweisung der Esteraseaktivität wurde 1951 von Barrnett und Seligman veröffentlicht, die Indoxylacetat und Indoxylbutyrat verwendeten4. Etwa ein Jahrzehnt später wurde das indigene Prinzip für die Lokalisierung von Säuger-Glucosidasen angepasst5. Bis heute wurden mehrere Indoxylglycoside entwickelt, obwohl sich ihre Synthese als schwierig erwiesen hat. Die meisten Synthesen basieren auf der Verwendung eines N-acetylierten Indoxyls als Akzeptor und des jeweiligen glycosylierten Halid-Donors6–14. Die Glycosylierung wird in Aceton mit Natriumhydroxid durchgeführt. Unter diesen Bedingungen treten zahlreiche Nebenreaktionen auf, die die Ausbeute erheblich verringern. Insbesondere für Glucose-ähnliche Strukturen wurden sehr niedrige Glycosylierungsausbeuten berichtet (z. B. 15 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid6 und 26 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobiosid14 in einem jüngeren Beispiel). Durch einen neuartigen Ansatz unter Verwendung von Indoxylsäureestern wurden eine beträchtliche Anzahl an Indoxylglycosiden in guten Ausbeuten hergestellt (z. B. (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid mit 57 % Ausbeute).

Das folgende Protokoll beschreibt die einfache Synthese des Allylesters der Indoxylsäure (5-Brom-4-chlor) und darauf basierend die Synthese eines Indoxylglycosids (X-Gal). Ein einfaches Modellexperiment zeigt die Enzymaktivität von β-Galactosidase unter Verwendung von X-Gal.

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Protokoll

Allgemeine Bemerkungen:

Alle Reaktionen wurden mit einem Abzug und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Alle Reagenzien und Lösungsmittel (p.a.; Wassergehalt für trockene Lösungsmittel: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) wurden von gewerblichen Quellen bezogen und wie erhalten verwendet. Die TLC wurde an Merck Kieselgel 60 F254 Platten durchgeführt. Die Verbindungen wurden durch UV-Strahlung und/oder durch Behandlung mit EtOH/H2SO4 (9:1) und anschließender Erhitzung nachgewiesen. Die Säulenchromatographie wurde mit Merck/Fluka Kieselgel 60 (230-400 mesh) durchgeführt. Die Filtration erfolgte mit Büchner-Trichter und Aspiratorpumpe. Die Entfernung der Lösungsmittel erfolgte mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (40 °C, ~200 U/min). Die Produkte wurden im Hochvakuum getrocknet (Drehschieberpumpe). Reaktionen, die trockene Lösungsmittel erforderten, wurden unter Argonatmosphäre durchgeführt.

Im Folgenden wird die Synthese von X-Gal (16) unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12) beschrieben. Für weitere Verbindungen mit unterschiedlichen Substitutionsmustern sowie Methylester, die gemäß dieser Synthesesequenz hergestellt wurden, siehe Ref.17-19.

1. Akzeptor: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester18 (12)

  1. N-Acetylierung: Synthese von N-(4-Brom-3-chlor-2-methylphenyl)-acetamid (6)
    1. 10,0 g (45,7 mmol) 4-Brom-3-chlor-2-methylanilin werden in 30 ml Dichlormethan gelöst.
      Vorsicht! Dichlormethan ist schädlich und kühlt die Lösung in einem Eisbad ab.
    2. 6,50 ml (68,7 mmol) Essigsäureanhydrid tropfenweise zugeben und die Mischung auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Mischung kann 8 Stunden oder über Nacht gerührt werden. Vorsicht! Essigsäureanhydrid ist ätzend und brennbar.
    3. Entfernen Sie das Lösungsmittel und rekristallisieren Sie aus 9:1 Ethylacetat/Methanol (Ausbeute: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), farbloser Feststoff).
      Vorsicht! Ethylacetat ist reizend und brennbar. Vorsicht! Methanol ist giftig und brennbar.
  2. Oxidation: Synthese von N-Acetyl-5-brom-6-chloranthranilsäure (7)
    1. Reflux ein Gemisch aus 2,30 g (8,76 mmol) aus 6 (Erzeugnis aus Schritt 1.1) und 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4•7H2O in 40 ml Wasser in einem 3-Hals-Rundkolben mit Kühler und Tropftrichter.
    2. 50 ml gesättigteKMnO 4-Lösung in Wasser über einen Zeitraum von 3 Stunden tropfenweise zum Reaktionsgemisch geben. Anschließend weitere 2 Std. unter Rückfluss, ca. 135 °C Ölbad erhitzen. Vorsicht! Kaliumpermanganat ist schädlich und oxidierend.
    3. Auf Raumtemperatur abkühlen und das Pyrolusit (MnO2), das bei der Reaktion entsteht, filtrieren.
      Vorsicht! Pyrolusit ist schädlich.
    4. Salzsäure (37%) bis zum pH-Wert 1 zum Filtrat geben, dann das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), farbloser Feststoff).
      Vorsicht! Salzsäure ist ätzend.
  3. Deacetylierung: Synthese von 5-Brom-6-chloranthranilsäure (8)
    1. 3,90 g (13,3 mmol) von 7 (Erzeugnis aus Schritt 1.2) in 70 ml 1 N wässriger Natronlauge auflösen und 5 Std. bei ca. 100 ΰC (Ölbad) erhitzen< /> Vorsicht! Natriumhydroxid ist korrosiv.
    2. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und Salzsäure (37%) bis pH 1 zugeben, dann das Produkt mit einem Büchner-Trichter filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), farbloser Feststoff).
  4. Anhydridbildung: Synthese von 5-Brom-6-chlorisatosäureanhydrid (9)
    1. 8,17 g (32,6 mmol) von 8 (Erzeugnis aus Schritt 1.3) werden in 33 ml trockenem Acetonitril suspendiert.
      Vorsicht! Acetonitril ist schädlich und brennbar.
    2. Bei Raumtemperatur umrühren und 5,3 ml und eine Lösung von 3,22 g (10,8 mmol) Triphosgen in 18,5 ml trockenes Dichlormethan tropfenweise gleichzeitig über einen Zeitraum von 30 min hinzufügen. Anschließend 3 Std. bei 50 °C (Ölbad) erhitzen. Vorsicht! Pyridin ist gesundheitsschädlich und brennbar.
      Vorsicht! Triphosgen ist giftig und kann Phosgen freisetzen.
    3. Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser und filtrieren Sie Ihr Produkt. Mit einer kleinen Menge kaltem Dichlormethan waschen.
    4. Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), farbloser Feststoff).
  5. N-Alkylierung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-[(methoxycarbonyl)allyl]-isatosäureanhydrid (10)
    1. 25 g (90 mmol) von 9 (Erzeugnis aus Schritt 1.4) werden in 250 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit einem Eisbad abgekühlt
      Vorsicht! Dimethylformamid ist schädlich und brennbar
    2. Portionsweise 1,15 Äquivalente Natriumhydrid (60 % Paraffin) zugeben.
      Vorsicht! Natriumhydrid ist ätzend und brennbar; Starke Reaktion mit Wasser/Eis.
    3. Nach 30 min Rühren bei 0 °C auf Raumtemperatur erwärmen lassen und 1,2 Äquivalente Allylbromoacetat tropfenweise zugeben.
    4. Nach 5-stündigem Rühren löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 500 ml destilliertem Wasser ab und filtrieren Sie Ihr Produkt.
    5. Waschen Sie das Produkt mit Wasser (3 Mal, 100 ml) und trocknen Sie es im Vakuum (Ausbeute: 93 % (31,5 g, 84,1 mmol), farbloser Feststoff).
  6. Anhydrid-Öffnung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-(methoxycarbonylallyl)-anthranilsäure-Allylester (11)
    1. 10 g (27 mmol) von 10 (Erzeugnis aus Schritt 1.5) werden in 100 ml Allylalkohol gelöst.
      Vorsicht! Allylalkohol ist schädlich und gefährlich für die Umwelt.
    2. Fügen Sie portionsweise 350 mg (8,70 mmol) Natriumhydrid (60% Paraffin) hinzu.
    3. Entfernen Sie nach 6,5 Stunden oder über Nacht das Lösungsmittel.
    4. Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Säule 30 x 6 cm; 240 g Kieselsäure), Petrolether/Ethylacetat 2:1; RF = 0,66), (Ausbeute: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), gelbes Öl).
      Vorsicht! Petrolether ist brennbar, reizend und gefährlich für die Umwelt.
  7. Dieckmann-Kondensation: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12)
    1. 3,0 g (7,7 mmol) von 11 (Erzeugnis aus Schritt 1.6) und 1,75 g (15,6 mmol) Kalium-tert-butoxid in 100 ml Trockendiethylether mischen
      Vorsicht! Kalium-tert-butoxid ist korrosiv und brennbar.
      Vorsicht! Diethylether ist gesundheitsschädlich und hochentzündlich.
    2. Die Mischung unter Rückfluss (Kühler) 2 Std. bei 40-45 °C erhitzen.
    3. Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und fügen Sie verdünnte Salzsäure (100 ml, 1 M) hinzu.
      Vorsicht! Nicht vollständig trocknen, es kann zu Zersetzungen kommen.
    4. Das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), farblos bis leicht grün fest).

2. Indoxyl-Glykosid: Synthese von X-Gal17

  1. Phasentransfer-Glykosylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indox-3-ylsäure-allylester) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (14)
    1. 400 mg (1,21 mmol) der Indoxylsäure Allylester 12 (Erzeugnis aus Schritt 1.7), 410 mg (1,21 mmol) Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und 500 mg (1,21 mmol) des Spenders 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-ᴅ-galactopyranosylbromid (α-Acetobromogalactose) in 10 ml Dichlormethan mischen. Vorsicht! Tetrabutylammoniumhydrogensulfat ist schädlich.
    2. 10 ml einer wässrigen Lösung von Kaliumcarbonat (1 M) zugeben.
      Vorsicht! Kaliumcarbonat ist ätzend.
    3. Bei Raumtemperatur bis zum vollständigen Verzehr des Spenders (TLC: Petrolether/Ethylacetat) rühren.
    4. Die organische Phase (Scheidetrichter) abtrennen, über Na2SO4 trocknen und das Lösungsmittel entfernen.
    5. Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Erdölether/Ethylacetat 1:1; RF = 0,33). (Ausbeute: 86% (690 mg, 1,04 mmol), farbloser Feststoff).
  2. Esterspaltung und Decarboxylierung: Synthese von (N-Acetyl-5-brom-4-chlorindol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (15)
    1. 600 mg (0,908 mmol) von 14 (Erzeugnis aus Schritt 2.1) werden in 15 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst.
      Vorsicht! Tetrahydrofuran ist gesundheitsschädlich und brennbar.
    2. 800 μl Morpholin und 105 mg (9,09 μmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren.
      Achtung! Morpholin ist brennbar und ätzend.
    3. Entfernen Sie das Lösungsmittel.
    4. 400 mg (2,40 mmol) Silberacetat, 800 mg (5,79 mmol) Kaliumcarbonat und 10 ml Essigsäureanhydrid zugeben.
      Vorsicht! Silberacetat ist reizend und gefährlich für die Umwelt.
    5. Bei 90-100 °C 20 min erhitzen.
    6. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur mit Dichlormethan verdünnen.
    7. Waschen Sie die Mischung zweimal mit Wasser und einmal mit einer verdünnten NaHCO3-Lösung (10%).
      Vorsicht! Natriumbicarbonat ist ätzend.
    8. Die organische Phase über Na2SO4 (Filter) trocknen und das Lösungsmittel entfernen.
    9. Das Rohprodukt einer Säulenchromatographie (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (Ausbeute: 88% (495 mg, 8,00 mmol), farbloser Feststoff).
  3. Zemplén-Deacetylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranosid (16)
    1. 396 mg (0,436 mmol) 15 (Erzeugnis aus Schritt 2.2) werden in 10 ml Methanol gelöst.
    2. Eine katalytische Menge Natriummethanolat zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren.
      Vorsicht! Natriummethanolat ist brennbar und korrosiv.
    3. Neutralisieren Sie mit Amberlite IR-120 H+ (Filter) und Konzentrat.
      Vorsicht! Amberlite IR-120 H+ ist reizend.
    4. Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 87% (170 mg, 0,416 mmol), farbloser Feststoff).

3. Veranschaulichung des Modellexperiments: Aktivitätsnachweis von β-Galactosidase mit X-Gal

  1. Bereiten Sie eine 0,5 mM Lösung von X-Gal in 500 μl Puffer (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM NaCl, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure; oder einen anderen geeigneten Puffer für Ihr Enzym) in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor (X-Gal kann in einigen μl Dimethylsulfoxid gelöst werden).
  2. 1 μl β,1-3-Galactosidase (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml) oder eine andere geeignete β-Galactosidase) zugeben und bei 37 °C schütteln (600 rps).
  3. Verfolgen Sie die Reaktion. Der indigoartige Farbstoff bildet sich nach kurzer Zeit.

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Ergebnisse

Die ersten Synthesen von Indican und 5-Brom-indican wurden bereits 1927 und 1929 von Robertson veröffentlicht15,16. Durch die Verwendung von Methylester des Indoxylsäuremethylesters als Akzeptor wurde die reaktive 2-Position blockiert, wodurch Nebenreaktionen teilweise unterbunden wurden. Die Glykosylierung in Aceton/Natriumhydroxid, gefolgt von der Entschützung und Decarboxylierung (160 °C, Essigsäureanhydrid, 1 Stunde) sowie abschließend der Deacetylierung, führte zur Gewinnung von Indican und 5-Brom-indican...

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Diskussion

Aufgrund schlechter Ausbeuten und Limitierungen, insbesondere für glukoseartige Strukturen und komplexere Saccharide, wurde ein neuartiger synthetischer Ansatz für Indoxylglykoside entwickelt. Indoxylsäureester erwiesen sich als wertvolle wichtige Zwischenprodukte und wurden auf einem modularen, skalierbaren Weg gewonnen. Alle Schritte sind ergiebig und durch billige Ausgangsmaterialien und einfache Aufarbeitung sind Multi-Gramm-Synthesen möglich. Der Vorteil des Allylester-Ansatzes ist die Blockierung der reaktiven 2-Po...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Unterstützung dieser Arbeit durch Glycom A/S, Kopenhagen, Dänemark, wird dankbar gedankt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureanhydridGrü ssing10298Ätzendes, entzündliches
AcetonitrilSigma-Aldrich608-001-00-3Gesundheitsschädlicher, entzündbarer
AllylalkoholAldrich453021Gesundheitsschädlich, umweltschädlich
Amberlite IR-120 H+Fluka06428Reizend
BromolessigsäureMerck802260Ätzend, giftig, gefährlich für die Umwelt
4-Brom-3-chlor-2-methylanilinABCRAB 171687Reizstoff
DichlormethanACROS326850010Schädlicher
DiethyletherGrü ssing10274gesundheitsschädliches, hochentzündliches
DimethylformamidACROS348430010gesundheitsschädliches, entzündliches
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich41648
EthylacetatSigma-Aldrich607-022-00-5Reizend, entzündbar
EthylendiamintetraessigsäureAppliChemA1103.0500Reizend
β 1,3-Galactosidase, rekombinant, E. coliCalbiochem345795
SalzsäureVWR20252.290Korrosives
MagnesiumsulfathydratMerck105885
MethanolACROS326950010Giftiges, entzündliches
MorpholinJanssen Chimica15.868.57Ätzend, entzündlich
ErdöletherAzelis111053Entzündlich, reizend, gefährlich für die Umwelt
KaliumcarbonatGrü ssing12005Ätzendes
KaliumpermanganatGrü ssing12056gesundheitsschädliches, oxidierendes
Kalium-tert-butoxidMerck804918ätzendes, entzündliches
PyridinSigma-Aldrich613-002-00-7gesundheitsschädliches, entzündliches
SilberacetatFluka85140Reizend, umweltschädlich
NatriumbicarbonatGrü ssing12144Korrosives
NatriumhydridMerck814552Ätzendes, entzündliches
NatriumhydroxidRiedel-de Hä enS181200Ätzendes
NatriummethanolatMerck806538Ätzendes, entzündliches
NatriumsulfatGrü ssing12175
TetrabutylammoniumhydrogensulfatLancaster5438gesundheitsschädliches
TetrahydrofuranSigma-Aldrich87371gesundheitsschädliches, entzündliches
Tetrakis (Triphenylphosphin)palladium(0)Sigma-Aldrich216666
TriphosgenFluka15217Giftiges
Tris (Hydroxymethyl)aminomethan HydrochloridSigmaT-3253Reizend

Referenzen

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  19. Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).

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