Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Wir beschreiben die detaillierten Schritte eines chemischen Hochdurchsatz-Assays im Fadenwurm Caenorhabditis elegans, der zur Beurteilung der Keimbahntoxizität verwendet wird. In diesem Assay wird die Störung der Keimbahnfunktion nach chemischer Exposition mit einem fluoreszierenden Reporter überwacht, der spezifisch für aneuploide Embryonen ist.

Zusammenfassung

Die Ermittlung der Reproduktionstoxizität von den Tausenden von in der Umwelt vorhandenen Chemikalien ist eines der verlockenden Herausforderungen im Bereich Umwelt und Gesundheit. Dies ist zum Teil auf den Mangel an Modellsystemen, die (1) exakt zu rekapitulieren können Tasten Funktionen der reproduktiven Prozesse und (2), tun dies in einem mittel- bis Hochdurchsatz-Mode, ohne die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Wirbeltieren.

Wir beschreiben hier einen Test in dem Fadenwurm C. elegans, die die schnelle Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe können durch die Überwachung der Induktion von aneuploid Embryonen. Durch die Verwendung eines GFP-Reporter Linie ist, werden Fehler in der Chromosomensegregation von Keimbahnunterbrechung resultierende leicht visualisiert und durch automatisierte Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. So ist die Durchmusterung einer bestimmten Satz von Verbindungen für ihre Toxizität in einer 96- bis 384-Well-Plattenformat in wenigen Tagen durchgeführt werden. Sekundäranalyse der positiven hseine durchgeführt, um festzustellen, ob die Chromosomenanomalien von meiotischen Störung oder aus frühen embryonalen Chromosomensegregation Fehler entstanden ist. Insgesamt dieser Test einen schnellen First-Pass-Strategie für die schnelle Beurteilung der Keimbahn Dysfunktion folgenden chemischen Exposition.

Einleitung

Es gibt rund 87.000 Chemikalien für den Handel in den Vereinigten Staaten registriert, aber nur eine kleine Anzahl von ihnen haben zu möglichen Gesundheitsschäden ¹ getestet. Von denen, die getestet wurden, wurde nur ein Teil für die reproduktive Gesundheitseffekte teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der Bestimmung der Veränderung der ersten fortpflanzungs Ereignisse bei Säugern, insbesondere bei weiblichen Keimzellentwicklung und -differenzierung bewertet. Tatsächlich sind die ersten Reife Veranstaltungen finden während der frühen Stadien der Embryonalentwicklung bei weiblichen Säugetieren und sind deshalb schwer zugänglich und sammeln in den Zahlen für Screening-Zwecken.

Die Keimbahn bietet das entscheidende Bindeglied zwischen den Generationen, und ihre jeweilige Funktion ist abhängig von der genauen Ausführung der komplizierten Programm der Zell- und Chromosomenteilung bezeichnet Meiose. Dysregulation des Reifeprozess kann zu einer verringerten Fruchtbarkeit und die Produktion zur Folge habenGameten und Embryonen mit einer abnormalen Anzahl von Chromosomen, eine Bedingung genannt Aneuploidie. Chromosomensegregation Fehler in der Meiose sind von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Chromosomenanomalien sind häufig, mit einer Frequenz von 1 150 Lebendgeburten, Trisomie 21, 18 und 13 sowie die X- und Y-Chromosomen-Fehler als die am weitesten verbreiteten Arten ^2,3. Außerdem angeborene Fehlbildungen, auch die der chromosomalen Ursprungs, sind die Hauptursache für Kindstod in der US ⁴ Die Idee, dass Umwelteinflüsse können Chromosomensegregation und das Verhalten beeinflussen, ist nicht neu ^5, ist aber noch weitgehend unverstanden. Es ist daher wichtig zu untersuchen, welche der in unsere Umgebung eingeführt Chemikalien mit menschlichen Fruchtbarkeit, Frühentwicklung und die allgemeine reproduktive Gesundheit zu stören sind.

Angesichts dieser Einschränkungen der Säugetier-Modelle haben wir ein Hochdurchsatz-Screening-Test entwickelt, um die Reproduktionstoxizität im Fadenwurm testen C. elegans. Wir haben mehrere wichtige Merkmale dieses üblicherweise verwendeten genetischen Modellsystem angeboten mobilisiert wie ihre geringe Grße, geringen Kosten, kurze Reproduktionszyklus, hohen Anteil an Keimzellen und leichte Handhabbarkeit ^6. Würmer können in 96-Well-Platten oder in großen Mengen Flüssigkulturen gezüchtet werden und wegen ihrer Transparenz kann direkt auf Platten zur Detektion von fluoreszierenden Reportern abgebildet werden. Das im Folgenden beschriebene Test nutzt diese Eigenschaften und nutzt eine Wurm-Stamm, dem fluoreszierenden Reporter Pxol-1 :: GFP zu Keimbahnunterbrechung und Induktion von embryonalen Aneuploidie zu erkennen.

Die Verwendung dieser Reporterstamm ist auf der in der Regel seltenen Auftretens von Männchen in einer hauptsächlich Zwitterwurmpopulation beruht. Diese Männchen (<0,2%) natürlicherweise von Fehler in der Trennung von dem X-Chromosom ^7. Da Keimbahnunterbrechung führt häufig zu Fehlern bei Trennung von Autosomenund heterochromosomes korreliert er sowohl mit einer erhöhten Inzidenz von männlichen Phänotyp (X missegregation) sowie embryonale Letalität (Autosom missegregation). Um die Induktion von Männern leicht erkennen, unter Umgehung der Frage der embryonalen Letalität, ist männlich spezifischen Promotor (xol-1) verwendet werden, um die Expression von GFP in frühen Embryonen noch innerhalb des Wurms Gebärmutter enthaltenen fahren. Als solches wird das Auftreten von GFP-exprimierenden Embryonen als Proxy für das Vorhandensein von aneuploiden Embryonen verwendet. Dieses Verfahren wurde zuvor verwendet worden, um Gene in die Keimbahn Wartung und Meiose ^8,9 gebracht identifizieren. Um chemisches Screening angepasst wird dieser Stamm in einem Medium mit hohem Durchsatz Bildschirm beschäftigt. Wichtig ist, dass die Belastung getreu berichtet die aneugenicity von Chemikalien und ist daher für Säugetier reproduktiven Endpunkte ^10. Der hier beschriebene Assay ist besonders nützlich, um Toxikologen in der pharmazeutischen und chemischen Industrie Einstellungen suchen seinum zeitnah die Toxizität von Chemikalien zu reproduktiven Endpunkte. Darüber hinaus dieser Test vollständig ausgerichtet mit den staatlichen Prioritäten in der Toxizität im ^21. Jahrhundert ¹¹ Bericht hervorgehoben.

Protokoll

1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Fütterung Bakterien (E. coli-Stamm OP50).

1. Isolieren einer Einzelkolonie von E. coli-Stamm OP50 aus einem LB-Medium (LB) Agarplatten beimpfen und aseptisch in 300 ml autoklaviertes LB-Medium.
2. Ermöglichen die inokulierte Kultur über Nacht in einem Schüttler bei 200 rpm und 37 ° C zu wachsen, bis eine Sättigung erreicht wird.
3. Übertragen Sie das OP50 in 6 sterile, vorgewogen 50 ml konische Röhrchen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation für 5 min bei 6000 rpm (5000 × g).
4. Überstand verwerfen und waschen Sie die Bakterien, die mit 50 ml steriler M9. Zweimal wiederholen.
5. Nach dem zweiten Waschen das verbleibende M9, sicherzustellen, dass kein M9 im Rohr belassen.
6. Bestimmen das Gewicht des Pellets durch Wiegen der Röhrchen mit dem Bakterienpellet und Subtrahieren des Gewichts der 50 ml konischen Röhrchen.
7. Das Pellet in M9 in einer Konzentration von 100 mg / ml.
8. Lagern Sie die OP50 Lösung bei 4 ° C, bis es für die Schnecke Kultur verwendet wird.

2. Herstellung der Nematode Wachstumsmedium (NGM) Petri Platten

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Herstellung von NGM Petrischalen, die die Platten in dem die C sind elegans-Würmer werden routinemßig im Labor gehalten.

1. Autoklavieren die NGM-Agar-Medium.
2. Mit einer sterilen Verfahren, verzichten 17 ml NGM-Agar-Lösung in 6 cm Petrischalen mit einer Schlauchpumpe.
   ANMERKUNG: Eine konstante Menge Agar in den Platten reduziert die Notwendigkeit der Neuausrichtung des Mikroskops beim Wechsel von einer Platte zur anderen.
3. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für 2-3 Tage vor dem Einsatz, damit der Agar fest werden und lassen Sie das überschüssige Feuchtigkeit verdunstet ist.
4. Seed die NGM-Platten mit einer sterilen Technik. 1-2 Tropfen OP50 Flüssigkultur und verbreiten mit einem Glasstab. Achten Sie darauf, nichtum die Bakterien Rasen zu den Kanten der Platten verteilt den ganzen Weg.
5. Lassen Sie das OP50 Wiese für 1-2 Tage bei Raumtemperatur, bevor Sie die Platten Würmer wachsen wachsen.

3. Herstellung einer Synchronwurmpopulation

HINWEIS: Der Lebenszyklus von C. elegans ist von der embryonalen Phase, vier Larvenstadien (L1-L4) und im Erwachsenenalter bestehen. Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung einer altersSynchron Bevölkerung von Würmern. Alle Materialien kommen in nach der Bleichbehandlung Kontakt mit C.elegans müssen steril sein.

1. Tag 1 - Herstellung von Gravid Worm Bevölkerung
   1. Verwenden NGM-Platten, in denen der Großteil der Wurmpopulation aus verhungert L1-Larven.
   2. Sammeln Sie die L1-Larven mit einer sterilisierten Wurm holen und sie auf frische 6 cm NGM-Platten ausgesät mit OP50. Inkubieren für etwa 65 h bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Würmer graviden Erwachsenen. Bis Zurvermeiden Plattenbelegung und damit die Würmer ohne abbauende Bakterien wachsen, nicht mehr als ein oder zwei Gruppen von L1-Larven auf jede frische NGM Platte übertragen.
2. Tag 4 - Einrichtung einer Synchronized L1 Larven Bevölkerung
   1. Sammeln Sie die trächtige Würmer aus den NGM-Platten durch Waschen mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube.
   2. Lassen graviden Würmer sedimentieren am Boden der 15 ml konischen Röhrchen für etwa 5-10 min. Entfernen Sie den Überstand ohne den Wurm Pellet zu stören.
   3. Übertragen Sie die Wurmpellet zu 2-4 Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml Bleichmittel / NaOH-Lösung. Inkubieren für 2-3 min bei RT. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Stereomikroskop zur Bestätigung alle Würmer tot sind. Bleichen Sie nicht länger als 5 Minuten, da die Embryonen sterben.
   4. Sammle die Würmer durch Zentrifugation für 1 min bei 3000 Upm (900 × g). Entfernen Sie den Überstand und 1 ml sterile M9Neutralisierung der Reaktion.
   5. Zweimal waschen die Würmer durch Zentrifugation für 1 min bei 3000 Upm (900 × g).
   6. Entfernen Sie den Überstand und fügen M9 auf bis zu 100 bis 200 ul.
   7. Mit einer Glaspasteurpipette einen Tropfen des Wurms / M9 mischen, um NGM-Platten für mindestens 24 Stunden bei 20 ° C klar und inkubieren sie, damit die Embryonen zu schlüpfen.
      HINWEIS: Ohne Nahrung Wachstum der Larven werden auf der L1 Stadium angehalten werden.
3. Tag 5 - Einrichtung einer Synchronized L4-Larven Bevölkerung
   1. Sammeln Sie die L1-Larven von den klaren NGM-Platten durch Waschen der Platten mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube.
   2. Lassen Sie den toten adulten Würmern Sediment am Boden der 15 ml konischen Röhrchen ca. 5 min.
   3. Sammeln des Überstandes, wobei die L1-Würmer sind, in ein neues konisches 15 ml-Röhrchen und fällt die Würmer durch Zentrifugation für 2 min bei 2600 rpm (1000 × g).
   4. Entfernen Sie den Überstand leaving etwa 500 ul.
   5. Man bestimmt die Konzentration von Würmern in M9-Lösung, indem die Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Stereomikroskop. Zählen Sie mindestens 5 Tropfen.
   6. Stellen Sie die Konzentration der Würmer auf 20-25 Würmer / ul und 50 ul der Wurm / M9-Mix auf NGM-Platten mit OP50 ausgesät.
   7. Inkubationszeit von 65 Stunden bei 15 ° C (für die Inkubation durch das Wochenende), damit der L1 synchronisiert Bevölkerung zu wachsen bis zum L4-Stadium zu erreichen.

4. Die Exposition von Worms nach Chemikalien in 96-Well-Platten

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung von Pxol1 :: gfp Transkriptionsreporter enthält C. elegans-Stamm, für die Induktion von Aneuploidie screenen.

1. Sammeln Sie die L4-Larven von den klaren NGM-Platten durch Waschen der Platten mit 1-2 ml M9 und sie auf einem konischen 15 ml-Tube.
2. Lassen Sie den L4 Würmer Sediment am Boden des15 ml konischen Röhrchen für etwa 5-10 min. Entfernen Sie den Überstand ohne den Wurm Pellet zu stören.
3. Hinzufügen 3-5 ml M9 und Bestimmung der Konzentration von Würmern in M9-Lösung, indem die Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Stereomikroskop. Zählen mindestens 5 Tropfen für jede Probe.
4. Resuspendieren der Würmer bei einer Konzentration von 1,000 Würmern / ml in M9.
5. Verdünnen Sie die OP50 Bakterien aus Abschnitt 1 10-fach mit M9. Achten Sie darauf, die resuspendierten Bakterien Raumtemperatur erreichen, weil niedrigere Temperatur wirkt Wurm Entwicklung.
6. Mit einer Mehrkanal-Pipette, erste fügen 100 ul des Wurms / M9-Mix (aus Schritt 4.4) und fügen Sie dann 400 ul der verdünnten OP50 Bakterien (aus Schritt 4,5) in jede Vertiefung einer 2 ml tiefen Rund Platte mit 96 Vertiefungen. Am Ende wird jeder Vertiefung haben 100 Würmer in 500 & mgr; l.
7. In 0,5 ul von entweder die Prüfsubstanz oder dem entsprechenden Steuer auf die gewünschten Brunnen, um eine vorgeschlagene endgültige Konzentr erreichenation von 100 uM, einer Konzentration üblicherweise in chemischen Bildschirme in C verwendet elegans ^12. Expose Ethanol oder DMSO Lösungsmittelkontrollen in einer Endkonzentration von 0,1%.
   HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Nocodazol (100 uM) als Positivkontrolle.
8. Verschließen Sie die Platte mit Klebefolie. Achten Sie darauf, die Platte gut verschließen, um eine Kreuzkontamination zwischen den Kavitäten vermeiden.
9. Wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie.
10. Übertragen der Platte an einem Schüttler (170-180 rpm) der geeigneten Temperatur für die geeignete Zeitdauer (24 oder 65 h). Die Temperatur des Raums beeinflusst das Wachstum der Würmer; Aufrechterhaltung der Temperatur von etwa 20 ° C.

5. Bildaufnahme von Gravid Worms in einer 384-well Platten

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung eines hohen Gehalts Mikroskop zur Abbildung des belichteten Pxol1 :: gfp Würmer, um die Expression von GFP in den Embryonen im Uterus von erwachsenen Hermaphroditen visualisieren. Fürjeder 384-Well-Platte zu sehen sein, verwenden Würmer aus 4 x 96-Well-Platten.

1. Nach Exposition gegenüber Chemikalien in den Shaker, lassen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen Rest für 10-15 Minuten, damit sich die erwachsenen Würmer an die Unterseite der Platte zu sedimentieren.
2. Mit einer Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie 350 ul der M9, sehr vorsichtig, nicht die Würmer in der Unterseite der Platte stören.
3. Mit 1 ml M9 und wiederholen Sie Schritt 5.1 Waschen Sie die Würmer.
4. Mit einer Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie 1 ml des M9, dass Vey achten, dass die Würmer in der Unterseite der Platte stören.
5. Mit einer Mehrkanal-Pipette resuspendieren die Würmer in der verbleibenden M9 und sammeln Sie 100 ul der Schnecke / M9-Mix aus den 96-Well-Platten und laden Sie es in die Vertiefungen einer schwarzen Wänden / klarer Boden 384-Well-Platte. Wiederholen des Prozesses mit Schnecken von 4 x 96-Well-Platten, bis alle Vertiefungen der Platte mit 384 Vertiefungen geladen wurden.
   HINWEIS: Es ist wichtig für alle Brunnen, um das gleiche Volumen, um das zu erhöhenEffizienz und die Geschwindigkeit des Autofokus während der Bildaufnahme-Prozess. Jedes der gut sollte zwischen 80 bis 100 Würmer enthalten.
6. 1 ul Levamisol (100 & mgr; M) zu jeder Vertiefung und lassen die Würmer inkubieren etwa 30 min.
   HINWEIS: Levamisol fungiert als Acetylcholin-Rezeptor-Agonisten und immobilisiert die Würmer.
7. Übertragen Sie die Platte auf eine Weitfeldmikroskop hohen Gehalt in der Lage, automatisierte Bildverarbeitung.
8. Für die Bildaufnahme verwenden einen hohen Gehalt Bildaufnahme und Analyse-Software nach den Richtlinien des Herstellers. Wählen Sie das 4X Ziel, 1 Bild pro Vertiefung zu erwerben.
9. Vor dem Start der Bildaufnahme, passen Sie die GFP Bildparameter bis 45 msec von Belichtung und Bildauflösung auf 2160 x 2160.
10. Sammeln der Daten, wenn die Anzahl der GFP-positiven Würmer in dem Bohrloch, dividiert durch die Gesamtzahl der Würmer, wobei die letztgenannte Maßnahme relativ konsistent zwischen den Wells.

Ergebnisse

Belichtung des Pxol-1 :: GFP-Reporter-Stamm gegenüber chemischen Mitteln wie Mikrotubuli Gift Nocodazol (Figur 1) führt zur Induktion eines hohen Anteils an GFP-exprimierenden Embryonen in den Uterus ausgesetzt erwachsenen Hermaphroditen Vergleich zu DMSO Kontrolle. Die GFP-positiven Embryos sind deutlich heller als die anderen Embryonen als auch die im Darm der Tiere beobachtet Autofluoreszenz beobachtet schwache Hintergrund-Fluoreszenz. Würmer ausgesetzt werden direkt auf 384-Well-Platten abg...

Diskussion

Die hier beschriebene Methode ist die erste groß angelegte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe. Es erfordert die Verwendung eines GFP transgenen Pxol-1 :: GFP, die Belastung, die getreulich berichtet die Induktion von Aneuploidie in frühen Embryonen, die als Proxy für die Keimbahnstörungen verwendet wird. Das Verfahren beinhaltet die sorgfältige Synchronisation eines C. elegans Wurm Bevölkerung und Belichtung Würmer Chemikalien in 96-Well-Format, gefolgt von Abbildung der GFP positive...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
60 mm belüftete, scharfe Kante Petrischalen	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-Well mit rundem Boden 2 ml Polypropylen Deep Well-Platte	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopepton	Apex	20-261
Bacto-Trypton	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleichmittel	Clorox
Calciumchlorid (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterin	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 Well-Platten	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisolhydrochlorid	Fluka	31742
Wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Bildaufnahme & Analysesoftware	Molekulare Bauelemente
Monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon-Filme für biologische Kulturen	VWR	60941-086
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomikroskop	Nikon	SMZ 745	Dieses Mikroskop hat eine Gesamtvergrößerung von 3,35X bis 300X. Jedes Mikroskop mit ähnlichen Eigenschaften funktioniert.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP Reporterstamm	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Hefeextrakt	Becton Dickinson	212750