Wir beschreiben die detaillierten Schritte eines chemischen Hochdurchsatz-Assays im Fadenwurm Caenorhabditis elegans, der zur Beurteilung der Keimbahntoxizität verwendet wird. In diesem Assay wird die Störung der Keimbahnfunktion nach chemischer Exposition mit einem fluoreszierenden Reporter überwacht, der spezifisch für aneuploide Embryonen ist.
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Methodenartikel
Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Ermittlung der Reproduktionstoxizität von den Tausenden von in der Umwelt vorhandenen Chemikalien ist eines der verlockenden Herausforderungen im Bereich Umwelt und Gesundheit. Dies ist zum Teil auf den Mangel an Modellsystemen, die (1) exakt zu rekapitulieren können Tasten Funktionen der reproduktiven Prozesse und (2), tun dies in einem mittel- bis Hochdurchsatz-Mode, ohne die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Wirbeltieren.
Wir beschreiben hier einen Test in dem Fadenwurm C. elegans, die die schnelle Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe können durch die Überwachung der Induktion von aneuploid Embryonen. Durch die Verwendung eines GFP-Reporter Linie ist, werden Fehler in der Chromosomensegregation von Keimbahnunterbrechung resultierende leicht visualisiert und durch automatisierte Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. So ist die Durchmusterung einer bestimmten Satz von Verbindungen für ihre Toxizität in einer 96- bis 384-Well-Plattenformat in wenigen Tagen durchgeführt werden. Sekundäranalyse der positiven hseine durchgeführt, um festzustellen, ob die Chromosomenanomalien von meiotischen Störung oder aus frühen embryonalen Chromosomensegregation Fehler entstanden ist. Insgesamt dieser Test einen schnellen First-Pass-Strategie für die schnelle Beurteilung der Keimbahn Dysfunktion folgenden chemischen Exposition.
Einleitung
Es gibt rund 87.000 Chemikalien für den Handel in den Vereinigten Staaten registriert, aber nur eine kleine Anzahl von ihnen haben zu möglichen Gesundheitsschäden 1 getestet. Von denen, die getestet wurden, wurde nur ein Teil für die reproduktive Gesundheitseffekte teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der Bestimmung der Veränderung der ersten fortpflanzungs Ereignisse bei Säugern, insbesondere bei weiblichen Keimzellentwicklung und -differenzierung bewertet. Tatsächlich sind die ersten Reife Veranstaltungen finden während der frühen Stadien der Embryonalentwicklung bei weiblichen Säugetieren und sind deshalb schwer zugänglich und sammeln in den Zahlen ....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Fütterung Bakterien (E. coli-Stamm OP50).
- Isolieren einer Einzelkolonie von E. coli-Stamm OP50 aus einem LB-Medium (LB) Agarplatten beimpfen und aseptisch in 300 ml autoklaviertes LB-Medium.
- Ermöglichen die inokulierte Kultur über Nacht in einem Schüttler bei 200 rpm und 37 ° C zu wachsen, bis eine Sättigung erreicht wird.
- Übertragen Sie das OP50 in 6 sterile, vorgewogen 50 ml konische Röhrchen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation für 5 min bei 6000 rpm (5000 × g).
- Überstand verw....
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Ergebnisse
Belichtung des Pxol-1 :: GFP-Reporter-Stamm gegenüber chemischen Mitteln wie Mikrotubuli Gift Nocodazol (Figur 1) führt zur Induktion eines hohen Anteils an GFP-exprimierenden Embryonen in den Uterus ausgesetzt erwachsenen Hermaphroditen Vergleich zu DMSO Kontrolle. Die GFP-positiven Embryos sind deutlich heller als die anderen Embryonen als auch die im Darm der Tiere beobachtet Autofluoreszenz beobachtet schwache Hintergrund-Fluoreszenz. Würmer ausgesetzt werden direkt auf 384-Well-Platten abg.......
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode ist die erste groß angelegte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe. Es erfordert die Verwendung eines GFP transgenen Pxol-1 :: GFP, die Belastung, die getreulich berichtet die Induktion von Aneuploidie in frühen Embryonen, die als Proxy für die Keimbahnstörungen verwendet wird. Das Verfahren beinhaltet die sorgfältige Synchronisation eines C. elegans Wurm Bevölkerung und Belichtung Würmer Chemikalien in 96-Well-Format, gefolgt von Abbildung der GFP positive.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken den folgenden Finanzierungsquellen: NIH ES020353 und dem Colgate-Palmolive Alternative Research Grant Award, die diese Arbeit möglich gemacht haben.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 60 mm belüftete, scharfe Kante Petrischalen | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-Well mit rundem Boden 2 ml Polypropylen Deep Well-Platte | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopepton | Apex | 20-261 | |
| Bacto-Trypton | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleichmittel | Clorox | ||
| Calciumchlorid (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterin | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 Well-Platten | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisolhydrochlorid | Fluka | 31742 | |
| Wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Bildaufnahme & Analysesoftware | Molekulare Bauelemente | ||
| Monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon-Filme für biologische Kulturen | VWR | 60941-086 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ 745 | Dieses Mikroskop hat eine Gesamtvergrößerung von 3,35X bis 300X. Jedes Mikroskop mit ähnlichen Eigenschaften funktioniert. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP Reporterstamm | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Hefeextrakt | Becton Dickinson | 212750 |
Referenzen
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
