Methodenartikel

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

DOI:

10.3791/52451

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19. April 2015

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1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Um die Permeabilität der Blut-Netzhaut-Schranke und die innere Grenzmembranintegrität in Tiermodellen für Netzhauterkrankungen zu untersuchen, haben wir mehrere Adeno-assoziierte Virus (AAV) Varianten als Werkzeuge zur Markierung von retinalen Neuronen und Gliazellen verwendet. Die virusvermittelte Reportergenexpression wird dann als Indikator für die Permeabilität der Netzhautbarriere verwendet.

Zusammenfassung

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Müller-Zellen sind die Haupt gliale Zellen der Retina. Ende ihrer Füße bilden die Grenzen der Netzhaut auf der äußeren und inneren Begrenzungsmembranen (ILM) und in Verbindung mit Astrozyten Perizyten und Endothelzellen sie die Blut-Retina-Schranke (BRB) herzustellen. BRB begrenzt Materialtransport zwischen dem Blutstrom und der Netzhaut, während das ILM wirkt als Basalmembran histologisch die Grenze zwischen der Netzhaut und des Glas Hohlraum definiert. Beschriftung Müller-Zellen ist besonders relevant für den physikalischen Zustand der Netzhautbarrieren zu studieren, da diese Zellen sind ein integraler Bestandteil des BRB und ILM. Sowohl BRB und ILM werden häufig in Netzhauterkrankungen verändert und sind für die Krankheitssymptome verantwortlich.

Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren, um die Integrität des BRB studieren, wie die Evans Blau-Assay oder Angiographie. Allerdings sind diese Verfahren nicht auf das Ausmaß der BRB Lässigkeit t informiereno größere Moleküle, im Nanometerbereich. Außerdem liefern sie keine Informationen über den Zustand anderer retinaler Barrieren wie die ILM. Um BRB Permeabilität neben retinalen ILM zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basiertes Verfahren, das Informationen über Permeabilität BRB zu größeren Molekülen während sie den Zustand der ILM und extrazellulären Matrixproteinen in Krankheitszuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. AAV5 hat einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren, aber es kann, wenn es in den Glaskörper verabreicht wird, wenn das ILM intakt ist (dh, in Wildtyp-Retina) nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 hat eine starke Tropismus hin Gliazellen und selektive Markierung Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. ShH10 bietet effizientere Genübertragung in Netzhaut, wo ILM gefährdet ist. Diese viralen Tools gepaart mit Immunhistochemie und Blut-DNA-Analyse Aufschluss auf den Zustand der Netzhautbarrieren in Krankheit.

Einleitung

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Müller-Zellen sind die Haupt glial Komponente der Netzhaut. Morphologisch pannen sie die Netzhaut und ihre radial Endfüßen, in Kontakt mit dem Glaskörper vor der ILM und geheime Komponenten des letzteren. Die ILM ist eine Basalmembran von etwa zehn unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen (Laminin, Agrin, Perlecan, Nidogen, Kollagen und mehrere Heparinsulfatproteoglykanen) zusammen. Während der Entwicklung ist die Präsenz für die Netzhaut Histogenese, Navigations optischer Axone, und das Überleben von Ganglienzellen 1-3 unverzichtbar. Allerdings ist ILM unwesentlich bei erwachsenen Netzhaut und kann chirurgisch in bestimmten Krankheitsbildern entf....

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Protokoll

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Alle Tiere in dieser Studie verwendet wurden entsprechend der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research betreut und behandelt.

1. Herstellung der rekombinanten AAV (rAAV) durch transiente Transfektion von HEK-293-Zellen 17,18

HINWEIS: Siehe McClure C, JoVE (2011) 19.

  1. Reinigung einer großen Plasmidpräparation (mindestens 1 mg / ml) der AAV-Vektor-Plasmide. Verwenden Sie 3-Plasmiden. Die AAV-Helferplasmid trägt, die Replikation und Capsidgene ohne AAV invertierte terminale Wiederholungen ITRs, die Transgen-Expressionskassette trägt die AAV ITR be....

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Ergebnisse

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Wir erwarten mehr retinalen Transduktion Müller Gliazellen mit ShH10 wenn das Tiermodell zeigt Störungen in der Struktur des ILM (2A - B). Zum Beispiel haben wir in Abwesenheit von DP71 gezeigt, ShH10 Targets spezifisch aber effizienter Müller Gliazellen durch intravitreale Injektion, was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der ILM in diesem Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 16 (2C - F).

AAV5 kann auch als Ind.......

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Diskussion

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Die BRB regelt den Austausch von Molekülen zwischen Blut und Netzhaut. Dessen Abbau ist mit verschiedenen Krankheiten, wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) zugeordnet ist. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in einer Dystrophin-Knock-out-Maus, die durchlässig BRB zeigt, wird die Netzhaut zügiger der Genübertragung von Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) vermittelt. Trotz BRB Lässigkeit AAV-Partikel injiziert intraokular mit dem Augenraum in diesem Modell beschränkt bleiben. Unsere .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken der Bildgebungsplattform des Institut de la Vision. Wir danken der French Muscular Dystrophy Association (AFM) für ein PhD-Stipendium für O.V. und Allergan INC. Diese Arbeit, die im Rahmen des LABEX LIFESENSES [Referenz ANR-10-LABX-65] durchgeführt wurde, wurde von französischen Staatsfonds unterstützt, die von der ANR verwaltet werden. Wir danken Peggy Barbe und Mélissa Desrosiers für die technische Unterstützung bei den AAV-Vorbereitungen. Wir danken Stéphane Fouquet für die hervorragende technische Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie und seinen fachkundigen Input bei der Interpretation der Ergebnisse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL6J MäusestammJANVIER LABSMäuse
Ketamin 500Virbac FrankreichAnästhetikum
Xylazin Rompun 2%Bayer HealthcareAnästhetikum
Neosynephrin 5% FaureEurophtaDilatant
Mydriaticum 0,5%TheaDilatant
SterdexNovartisentzündungshemmendes
Kryomatrix-EinbettungsharzThermo Scientific6769006
Superfrost Plus AdhäsionsfolienThermo Scientific10143352Objektträger
Anti-LamininSigmaL9393Antikörper
Anti-Rhodopsin-Klon 4D2MilliporeMABN15Antikörper
Anti-Glutamin-Synthetase-Klon GS-6MilliporeMAB302Antikörper
Anti-Glial Fibrillary Sauric ProteinDako334Antikörper
PNA LectinInvitrogenL32459Sonde
Alexa Fluor konjugierte SekundärantikörperInvitrogenAntikörper
Fluorsave ReagenzCalbiochem345789Eindeckmedium
QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
GoTaq DNA-PolymerasePromegaM3001
Evans Blue FarbstoffSigmaE2129Farbstoff
5 & Mikro; m FilterMillipore
NatriumcitratSigmaS1804
ZitronensäureSigmaC1909-2,5KG
Formamid spektrophotometrischSigma295876-2L
FluoresceinSigmaF2456Farbstoff
Micron IIIPhoenix Research LabsDas Mikroskopiesystem basiert auf einer 3-CCD-Farbkamera, einem Framegrabber und handelsüblicher Software und ermöglicht es Forschern, die Netzhaut von Mäusen abzubilden.
InsulinspritzenTerumoSS30M3109
Spritze 10 & Mikro; l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Nadel RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Intravitreale Injektion
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3Vielseitiger Injektor verwendet Mikrospritzen zur Abgabe von Pikolitervolumina
UltraMicroPump (UMP3) (eins) mit SYS-Micro4 ControllerUMP3-1Digitaler Controller
Binokularlupe SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0,66 x 5 x LEDs mit Stativ Epi und Dia / Netzhautdissektion
Federschere gerade - 8,5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Netzhautdissektion
gebogene Vanna-Schere15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96-Well Thermal CyclerLife Technologien4375786Thermocycler
UltraschallreinigerLaborbedarfG1125P1T
Nanosep 30k Omega RöhrenVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
SpektrofluorometerTECANunendlich M1000

Referenzen

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  1. Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
  2. Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E.

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Schlagwörter

Blut Retina Schrankeinnere GrenzmembranM ller ZellenAAV5ShH10intravitreale InjektionKonfokalmikroskopieImmunhistochemie

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