Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.
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Methodenartikel
Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zebrafischembryonen (Danio rerio) haben sich als leistungsfähiges Modell für die Untersuchung einer Vielzahl von Entwicklungs- und Krankheitsprozessen erwiesen. Die äußere Entwicklung und die optische Transparenz machen diese Embryonen besonders zugänglich für die Mikroskopie, und es stehen zahlreiche transgene Linien zur Verfügung, die bestimmte Zelltypen mit fluoreszierenden Proteinen markieren, was den Zebrafischembryo zu einem idealen System macht, um die Interaktion von vaskulären, hämatopoetischen und anderen Zelltypen während der Verletzung und Reparatur in vivo sichtbar zu machen. Die Vorwärts- und Rückwärtsgenetik beim Zebrafisch ist gut entwickelt, und pharmakologische Manipulation ist möglich. Wir beschreiben ein mechanisches Gefäßverletzungsmodell unter Verwendung von Mikromanipulationstechniken, das mehrere dieser Merkmale ausnutzt, um Reaktionen auf Gefäßverletzungen, einschließlich Blutstillung und Blutgefäßreparatur, zu untersuchen. Mit einer Kombination aus Video- und Zeitraffermikroskopie zeigen wir, dass diese Methode der Gefäßverletzung zu messbaren und reproduzierbaren Reaktionen während der Blutstillung und Wundheilung führt. Diese Methode bietet ein System, um Gefäßverletzungen und -reparaturen im Detail in einem ganzen Tiermodell zu untersuchen.
Einleitung
Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um eine Vielzahl von Themen in der Gefäßbiologie zu studieren, einschließlich der Gefäßentwicklung, der Angiogenese und der hämatopoetischen Entwicklung und Pathologie1-3. Die Embryonen entwickeln 1 Tag nach der Befruchtung (dpf) einen funktionsfähigen Kreislauf sowie Leukozyten und andere Bestandteile des angeborenen Immunsystems (dpf) 1,4,5. Die Konservierung der Entzündungs- und Leukozytenreaktion auf Verletzungen hat den Zebrafischembryo zu einem informativen Modell für so unterschiedliche Entzündungsprozesse wie tuberkulöse Infektionen, Enterokolitis und Geweberegeneration gemacht6-9. Zebrafischembryonen wurden verwendet, um verletzungsbedingte Entzündungen zu untersuchen, insbesondere im Zusammenhang mit epithelialen Wunden und der neutrophilen Reaktion10,11. Eine Schädigung des Embryos führt zu einer hochkonservierten zellulären Reaktion der Zellen an der Verletzungsstelle und der angeborenen Immunzellen, die rekrutiert werden, um auf die Verletzung zu reagieren und deren Auflösung zu regulieren11,12. Andere Verletzungsmodelle haben fokussierte Laserpulse verwendet, um die Schädigung räumlich auf bestimmte Zelltypen wie Neuronen, Muskelzellen und Kardiomyozyten zu lokalisieren13-15.
Zebrafischembryonen wurden als Modell verwendet, um Blutstillung und Thrombose unter Bedingungen pharmakologischer und genetischer Manipulation zu untersuchen, wobei sowohl mechanische als auch laserinduzierte Thrombusbildung verwendet wurden16-19. Komponenten der Gerinnungskaskade scheinen gut konserviert zu sein, und Transgene haben detaillierte Studien der Thrombozyten- und Fibringlagerung an der Gerinnungsstelle ermöglicht17,20,21. Das in dieser Arbeit vorgestellte Verfahren ergänzt diese Methoden, indem es ein System zur Untersuchung mechanischer Gefäßverletzungen bereitstellt, die zu einem Gefäßbruch, zur Thrombusbildung und -auflösung sowie zur Gefäßreparatur führen.
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Protokoll
HINWEIS: Verfahren mit Zebrafisch wurden von UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Herstellung der Werkzeuge
- Legen Minutien Stift in ein Stifthalter und klemmen Sie den Stift.
- Mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig biegen Sie die Spitze des Stiftes, um einen leichten Haken erstellen.
- Für Bearbeitung und Stabilisierung des Embryos während Verletzungen, biegen Sie das Ende einer 28 Gauge ½ Zoll-Nadel auf einer Insulinspritze mit Spitzzange montiert.
2. Herstellung von Zebrafischembryonen für Verletzungen
- Richten Sie Zebrafisch Brutpaare und sammeln Eier im Eier Wasser (60ug / ml Aquarium Salze), wie zuvor 22 gezeigt.
- Fügen 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem Ei Wasser, wenn die Embryonen etwa 8 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu Melanisierung verhindern.
- Dechorionate 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen vor dem Experiment mit feiner Spitze Pinzette.
Hinweis: Die Embryonen können jederzeit verletzt, nachdem Kreislauf beginnt werden. Die hier präsentierten Daten sind für 2 dpf Embryonen, aber die Technik ist erfolgreich in Embryonen bis 5 dpf aufgebracht. - Anesthetize die Embryonen mit 0,02% gepuffert 3-Aminobenzoesäure (Tricaine) ca. 10 min vor Manipulationen.
3. Mechanische Vessel Verletzung von Embryonen
- Übertragen narkotisierten Embryonen auf eine Depression gleiten auf einem Seziertisch Stereomikroskop mit einer Transferpipette.
- Mit dem kurzen flachen Seite der Spritzennadel, um den Embryo mit der dominanten Hand zu manipulieren, positionieren Sie den Embryo auf die Seite mit der Bauchseite abgewandten Nadel.
- Positionieren Sie die Minutien Stift mit der Spitze zeigte direkt auf der Bauchseite des Fisches hinter dem urogenitalen Öffnung. Positionieren Sie den Pin Minutien in einem leichten Winkel, so dass die gebogene Spitze ist in der Lage, durch die Periderm direkt in die Schwanzvene (Abbildung 1 / Strong>).
- Mit der Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren, durchbohren die Schwanzvene mit der Minutien Stift durch Antippen des Embryos in den Stift, um etwas haken Sie den Stift in die Vene.
- Mit der Spritzennadel, ziehen Sie den Embryo von der Minutien Stift einen kleinen Riss im Behälter zu schaffen.
ANMERKUNG: Eine erfolgreiche Verletzung führt zur sofortigen Blutungen aus der Vene führen.
4. Analyse der Blutstillung
- Wählen Sie nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen für dieses Verfahren.
- Bereiten Sie den Timer, sobald die Minutien Stift aus dem Behälter gezogen beginnen.
- Den Timer zu starten, sobald der Blutverlust aus der Wunde sichtbar gemacht werden. Wenn Blutverlust aus der Wunde nicht mehr, stoppen Sie die Zeit und notieren Gesamtzeit als Blutungszeit. Wenn die Koagulation inhibiert wird, nimmt die Zeit auf, um, wenn es nicht mehr sichtbar zirkulierenden Blutzellen.
5. Analyse der Wundheilung
- Über post-Verletzungen Tiere auf dem Glasboden Bildgebung Gerichte für die Mikroskopie.
- Entfernen Sie die Mehrheit der Eier Wasser.
- Decken Sie die Embryonen in 0,3 bis 1,2% niedrig schmelzender Agarose in Ei Wasser gelöst, um zwischen 42 und 45 ° C erwärmt und mit 0,02% Tricaine ergänzt.
- Position Embryonen auf ihren Seiten mit einer Pinzette.
- Nachdem die Agarose kühlt, füllen Sie die Schale mit 0,02% Tricaine in Ei Wasser.
- Erwerben Sie Bilder mit Hellfeld, Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
- Entfernen Embryo aus der Agarose mit einer Pinzette und Transfer zurück zum Ei Wasser.
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Ergebnisse
Mechanische Gefäßverletzung wurde am 2. dpf Embryonen (- C 2A) durchgeführt. Schädigung führt zu einer schnellen und zuverlässigen Koagulation Reaktion wie durch die Zeit zur Beendigung der Blutung (2D) gemessen. Um zu bestimmen, ob oder ob nicht Unterschiede in der Gerinnungsreaktion gemessen werden konnte, das Antikoagulans Hirudin wurde den Embryonen durch Injektion in die Kanal Cuviers unmittelbar vor der Verletzung (5-10 nl von 1 Einheit pro ul Hirudin gelöst in Wasser) verabreicht...
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Diskussion
Zebrafische wurden erfolgreich als ein Modell für die verschiedenen Arten von Wunden einschließlich Laserbeschädigung 13-15, Laser-induzierte Thrombose 16 und epithelialen Verwundung 10 verwendet. Wir berichten über ein Verfahren zur mechanischen Verwundung, die einfach auszuführen ist und erzeugt einen kontrollierten Verletzungen in einem in vivo-Modell, das sehr gut für Echtzeit-Mikroskopie ist. Schädigung führt zu einem schnellen und messbaren hämostatische Antwort u...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Stephen Wilson und Dr. Lisa Wilsbacher für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise von NIH HL054737 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Spitzendurchmesser 0,0125 mm, Stabdurchmesser 0,1 mm |
| Stifthalter | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Pinzette | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Niedrigschmelzende Agarose | Lonza | 50081 | Vorgeheizt auf 42 & ordm; C |
| N-Phenylthioharnstoff (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-Aminobenzoesäure (Tricain) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glasboden-Bildgebungsschüsseln | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Präpariermikroskop | Olympus | SZH10 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium Salze | Instant Ocean | ||
| Insulin Spritze mit 28,5 G Nadel | Becton Dickinson |
Referenzen
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