Verwendung eines Hochdurchsatz- In-vitro- Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Summary

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Abstract

Es gibt nur wenige Hochdurch in vitro-Systeme, die die Entwicklung von Multi-Spezies in Biofilmen zahlreiche Arten üblicherweise in in vivo oral Biofilmen detektiert enthalten erleichtern. Darüber hinaus ist ein System, das natürliche humane Speichel verwendet als Nährstoffquelle, statt künstlicher Medien, um die Expression von zellulären und Biofilm-spezifische Eigenschaften, die in vivo nachahmen Gemeinschaften unterstützt besonders wünschenswert. Wir beschreiben ein Verfahren für die Entwicklung von Mehrarten oralen Biofilmen, die vergleichbar sind, mit Bezug auf die Artenzusammensetzung, um Zahnbelag supragingivalen, unter ähnlichen Bedingungen wie die menschliche Mundhöhle. Genauer gesagt, wird diese Methoden Artikel beschreiben, wie ein im Handel erhältlicher Mikrofluidsystem kann angepasst werden, um die Entwicklung von Multi-Spezies orale Biofilme abgeleitet erleichtern und innerhalb gepoolt Speichel gezüchtet. Darüber hinaus kann eine Beschreibung, wie das System in Verbindung mit einem confoca verwendet werdenl Laserabtastmikroskop zur 3-D Biofilm Rekonstruktionen für architektonische und Lebensfähigkeit Analysen erzeugen vorgestellt. Angesichts des breiten Vielfalt von Mikroorganismen, die in Biofilmen in der mikrofluidischen Systems (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella und Porphyromonas) wachsen, wird ein Protokoll auch beschreiben, wie Sie die Biofilm-Zellen für die weitere Subkultur oder DNA-Extraktion und Analyse Ernte vorgelegt werden. Die Grenzen sowohl der Mikrofluidik Biofilm System und die aktuellen State-of-the-art Datenanalysen angesprochen. Letztlich ist es vorstellbar, dass dieser Artikel eine Basistechnik, die die Untersuchung der oralen Biofilmen verbessern und helfen bei der Entwicklung von weiteren Technologien, die mit dem Mikrofluid-Plattform integriert werden können, bereitzustellen.

Introduction

Biofilme sind architektonisch komplexe Gemeinschaften von Bakterien, die auf Oberflächen ¹ zusammengefasst sind. Diese Gemeinschaften enthalten typischerweise zahlreiche Arten, die miteinander innerhalb des Biofilms ² interagieren. Oral Biofilme, die optisch auffälliger als Zahnbelag, sind ein ständiges Problem bei Menschen und ihre unkontrollierte Entwicklung führt zur Erzeugung von taxonomisch diverse Mehrartengemeinschaften ^3. Die Komponente Bakterien dieser verschiedenen Gemeinden können bis zu 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika als ihre freischwebenden (Plankton) Gegen ^4-6 sein. Die Nichtbeachtung dieser mün....

Protocol

Die hier beschriebene Speichelentnahme Protokoll wurde von der University of Michigan Institutional Review Board für Menschenversuch überprüft.
HINWEIS: Im Hinblick auf die institutionelle Bewertungen für menschliche Subjekt der Arbeit dieser Art sollten nach vorheriger Vereinbarung und Berechtigungen von der Gasthochschule sammelte werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der Institution, IRB oder Ethik Genehmigung Möglicherweise müssen gesucht und genehmigt werden, bevor Speichelentnahme aus Freiwilligen fortfahren. Als Hilfe für die Antragstellung, kann eine nützliche NIH-Algorithmus / Grafik hier:

Results

3D-Rendering von Biofilmen

Repräsentative Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein nützliches Werkzeug in Imaris Software ist die Möglichkeit, jede Scheibe des gesammelten Biofilm Stapel zu untersuchen und zu kombinieren, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erstellen. Zusätzlich können künstliche Abschattungseffekte hinzugefügt werden visuell zur Interpretation dreidimensionalen Strukturen. Die erbrachten Biofilmen kann in jede Richtung mit unterschied.......

Discussion

Diese Methodenpapier hebt die grundlegenden Schritte zur Einrichtung erforderlich und führen Sie ein Mikrofluidsystem in einer Weise, die für die Entwicklung von oralen Multi-Spezies-Biofilme aus gepoolten menschlichen Speichel abgeleitet und in filtersterilisiert 25% gepoolten menschlichen Speichel wachsen lassen. Ansätze, um den Biofilm zu charakterisieren sind, gegeben, aber es sollte daran erinnert werden, dass diese beschriebenen Ansätze modifizierbar sind und zusätzliche Technologien, wie beispielsweise Flecken od.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon 50 ml konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15 ml konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (weiße Kristalle oder Pulver/Elektrophorese), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval Ultrazentrifuge (SS-34 kompatibel)	Thermoscientific	Einheitsabhängig
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Typ 1 Deionisiertes Wasser in Reagenzqualität	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Schnellstromfiltereinheiten und Flaschenaufsatzfilter, PES-Membran, steril.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux Mikrofluidik-System	Fluxion	Bioflux 200 System
Bioflux 24-Kanal-Platte	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
DEAD Färbung (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Lecia	SPE oder gleichwertiges System
Epifluoreszenzmikroskop	Mehrere Auswahlmöglichkeiten	Mehrfachauswahl
Pyrosequenziereinrichtungen	Mehrfachauswahl	Mehrfachauswahl
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultratiefkühlschrank -80  ° C	Mehrfachauswahl	Mehrfachauswahl
Tipps (20, 200 und 1.000  μ l)	Mehrfachauswahl	Mehrfachauswahl
Einkanal-Pipettierer mit variablem Volumen (20, 200, 1.000 μ l)	Mehrfachauswahl	Mehrfachauswahl<
Bioflux dedizierte Software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)