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Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

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DOI:

10.3791/52469

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2. Februar 2015

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1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Zusammenfassung

Das Fortschreiten des Krebses (Initiierung, Wachstum, Invasion und Metastasierung) erfolgt durch Wechselwirkungen zwischen bösartigen Zellen und den umgebenden Tumorstromazellen. Die Mikroumgebung des Tumors besteht aus einer Vielzahl von Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten, Immunzellen, vaskulären Endothelzellen, Perizyten und aus dem Knochenmark stammenden Zellen, die in die extrazelluläre Matrix (EZM) eingebettet sind. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) spielen durch die Sekretion löslicher Faktoren, die Angiogenese und den EZM-Umbau eine protumorigene Rolle. Die experimentellen Modelle für das Überleben, die Proliferation, die Migration und die Invasion von Krebszellen stützten sich hauptsächlich auf zweidimensionale monozelluläre und Monolayer-Gewebekulturen oder Boyden-Kammer-Assays. Diese Experimente spiegeln jedoch nicht genau die physiologischen oder pathologischen Zustände in einem erkrankten Organ wider. Um ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Tumorstroma oder Tumormatrix zu erlangen, bieten multizelluläre und dreidimensionale Kulturen leistungsfähigere Werkzeuge für die Untersuchung der interzellulären Kommunikation und der EZM-abhängigen Modulation des Verhaltens von Krebszellen. Als Plattform für diese Art von Studie stellen wir ein experimentelles Modell vor, in dem Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert werden, die in Primärkulturen von CAFs eingebettet sind.

Einleitung

Krebsgewebe kann als eine Art Organ wahrgenommen werden, das sich durch enge Wechselwirkungen zwischen dem Krebs und der stromalen Mikroumgebung des Tumors entwickelt, die aus krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs), Immunzellen, Tumorgefäßen und der extrazellulären Matrix (EZM) besteht. CAFs sind die Hauptquelle für lösliche Faktoren (Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine), die mitogene, pro-migratorische und pro-invasive Wirkungen auf Krebszellen ausüben. Sie stimulieren auch die Bildung von Tumorgefäßen und rekrutieren Vorläuferzellen, wie z. B. Knochenmark-abgeleitete Zellen (BMDC). Aktivierte CAFs sind an der Produktion und dem Umbau der EZM beteiligt und fördern dadurch das Wachstum und die Ausbreitung von Krebszellen1. CAFs bieten auch eine Nische, die die Besiedlung und Metastasierung von Tumorzellen erleichtert und in der Lage ist, Stammzellphänotypen auf benachbarte Krebszellen zu übertragen. Pathologische Beobachtungen deuten darauf hin, dass Stromareaktionen oder fibrotische Veränderungen im Krebsgewebe auf eine schlechte Prognose hindeuten. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass stromale Merkmale des Tumors, wie z. B. die Gensignatur, die Prognose des Patienten vorhersagen können. Darüber hinaus können CAF-abgeleitete Faktoren die Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapie modulieren, was die Rolle von CAFs bei der Bestimmung der Arzneimittelempfindlichkeit und -resistenz unterstreicht2.

Da CAFs eine facettenreiche Rolle bei der Förderung der Tumorprogression durch Signalwege spielen, die Interaktionen zwischen CAFs und verschiedenen Zelltypen innerhalb der Tumormikroumgebung vermitteln, haben sie als neuartige Ziele für Krebstherapien zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Die Heterogenität der Zellpopulationen innerhalb der Krebsmikroumgebung stellt ein Hindernis für das Targeting von CAFs dar. Es wurden mehrere Marker für CAFs vorgeschlagen, wie z. B. α-glattes Muskelaktin (α-SMA), das Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP) und das Fibroblasten-spezifische Proten-1 (FSP-1: auch S100A4 genannt); Diese molekularen Marker sind jedoch nicht spezifisch für die Unterscheidung von CAFs von anderen Zellen, die in nicht-krebsartigen Geweben vorkommen3. Daher sind weitere Studien erforderlich, um mehr über die spezifischen Eigenschaften von CAFs zu erfahren. Zu diesem Zweck ist es aufschlussreich, primär kultivierte CAFs im Vergleich zu patientenangepassten normalen Fibroblasten zu charakterisieren.

Kürzlich wurden Analysen von Patienten-CAFs bei mehreren Krebsarten berichtet, die einzigartige Genexpressionsmuster und Zellverhaltensweisen im Vergleich zu Fibroblasten aus nicht-krebsartigen Geweben aufzeigen. Unter Verwendung von isolierten CAFs aus humanem Lungenkrebsgewebe haben wir eine dreidimensionale Co-Kulturmethode entwickelt, die es uns ermöglicht, die Eigenschaften von Lungen-CAFs zu bewerten. In diesem Modell untersuchten wir die Auswirkungen der CAFs auf die Invasion von Lungenkrebszellen, die Proliferation und die Kontraktion von Kollagengelen, wodurch die tumorfördernde Rolle von Lungen-CAFs experimentell rekapituliertwurde 4.

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Protokoll

HINWEIS: Diese Studie wurde von den zuständigen Ethikkommissionen genehmigt.

1. Primär Kultur der menschliche Lungen-Fibroblasten

  1. Sammlung von Lungengewebe:
    1. Erhalten menschlichen Lungengewebeproben aus dem Operationsraum unmittelbar. Sammeln Sie ca. 1 cm 3 Blocks von krebsartigen und nicht krebsartigen Lungengewebe, die nicht krebsartigen Probe so weit weg von den Tumor wie möglich gesammelt.
    2. Aussetzung der Proben in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 ug / ml Amphotericin B (serumfreies Medium) ergänzt. Pflegen Sie die suspendierten Proben in sterilen 50-ml-Röhrchen und übertragen an das Labor.
      HINWEIS: Die Fibroblasten sind hoch Migration und Proliferation im Vergleich zu anderen Zelltypen, wie Epithelzellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Der Auswuchs Verfahren nutzt diese Features von Fibroblasten und outgroFlügelzellen aus Gewebeschnitten sind reichlich in Fibroblasten. Nach mehreren Zellpassagen anderen Zelltypen nicht zu überleben und vermehren sich in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), wodurch gereinigte Fibroblasten-Zellkulturen. Die Zellen könnten 3-7 Passagen folgenden Primärkultur verwendet werden.
  2. Explantatkultur und Anlage für Zell Auswuchs:
    1. Führen Primärkultur von Fibroblasten mit einem zuvor berichtet Protokoll mit Modifikationen 5.
    2. Im Labor, legen Sie die Gewebeprobe auf einer 10 cm Gewebekulturschale ohne Kulturmedium und in kleine Stücke geschnitten ~ 2-3 mm Größe mit einer sterilen Pinzette und Skalpell. Dabei verhindern, dass die trockenen Abschnitt, da sonst die Wirksamkeit der Zellauswuchs beeinträchtigt wird.
  3. Trennung der epithelialen Zellschicht und Bindegewebe:
    1. Tränken der geschnittenen Gewebeabschnitte in Kulturmedium, das 2000 PU / ml Dispase I und die Kultur für 16 Stunden bei 4 ° C.
    2. Übertragen Sie die Gewebeschnitte in eine Schale, und trennen Sie die Epithelzellschicht vom benachbarten Bindegewebe. Verarbeiten Sie die Abschnitte in einer Sterilbank, um eine Kontamination von Mikroorganismen zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn der Primärkultur von Epithelzellen ist erforderlich, führen Sie Schritt 1.3. Wenn nur Fibroblasten isoliert werden sollen, lassen Sie Schritt 1.3, da die nachfolgenden Explantatkultur und Zellpassagen ungünstig für Epithelzellen, die gereinigte Fibroblasten-Populationen zu erhalten sind.
  4. Befestigung von Gewebeschnitten:
    1. Hackfleisch das Gewebe in 1 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Wenn die Stücke nicht klein genug sind, leicht löst sie aus der Schale, und die Zellen werden nicht auf der Geschirroberfläche hinauswachsen.
    2. Legen Sie kleine Lungengewebe Abschnitte voneinander auf einen leeren Bereich jedes Stück Umgebung aufrecht zu erhalten. Make Kratzer auf der Oberfläche der Gewebekulturschale mit einem Skalpell, um die Befestigung von Gewebeschnitten zu erleichtern.
      HINWEIS: Scratchingscheint auch Zellauswuchs erleichtern, wodurch Spuren entlang dem Zellen migrieren können.
      1. Alternativ stellen Hackfleisch Gewebestücke einzeln in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, und sie mit einem Deckglas. Befestigen Sie das Deckglas auf die Oberfläche der Platte mit Silikonfett.
      2. Zeigen Silikonfett an zwei Punkten 1,5 cm Abstand in jedem Well mit einem sterilen Stift. Coverage der Gewebestücke erhöht die Wirksamkeit der Zell Auswuchs und Zellvermehrung nach mehreren Durchgängen.
  5. Nachfolgende Explantatkultur:
    1. Kulturmedium hinzufügen, vorsichtig in die Schale, bevor die Gewebeschnitte austrocknen, so effizient Zellauswuchs wird zum größten Teil verloren, wenn die Proben trocknen. Stellen Sie das Medium strömen nicht zu schnell, wie die Gewebeschnitte würde abnehmen.
    2. Kulturzellen in DMEM mit 10% FBS. Verwenden Sie ausreichend Medium nur das Gewebe zu bedecken, aber nicht zu viel, dass es ermöglicht, schwebend, als zusätzliche Auftriebs fördert Loslösung von derGericht.
  6. Zellpassage:
    1. Gehen Sie mit dem Kulturmedium mit Sorgfalt zu allen Zeiten als wiederholte Bewegungen der Kulturschale kann zur Ablösung der Gewebeschnitte führen.
    2. Legen Sie die Kulturschalen in einem Brutschrank bei 37 ° C für 5-7 Tage. Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag, und übernehmen die Kulturschalen minimal während des Mediums ändert. Fibroblasten entwachsen von der Kante der Gewebeschnitte in den nächsten Wochen.
      HINWEIS: Nach ~ 2-3 Wochen entwachsen Fibroblasten fast bis Konfluenz in Abhängigkeit von der Höhe der Oberfläche.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und 1 ml Trypsin ich auf den Teller.
    4. Nach Trypsinierung lösen sich die Zellen unter Verwendung von 9 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Sammeln Zellen in dem Medium in einer 10-ml-Röhrchen suspendiert, zusammen mit den Gewebeschnitten. Nach der Zentrifugation, um Zellpellets zu bilden, Resuspendieren der resultierenden Pellets in dem neuen Medium.
    5. Seed die Zellen und Gewebeschnitte auf eine neue cultur Schüssel, an welchem ​​Punkt das Gewebe nicht an den Teller zu befestigen, während die Zellen anhaften und wachsen. Am folgenden Tag, nehmen Sie die schwimmenden Gewebestücke durch Aspiration, und ändern Sie das Medium. Angehängte Fibroblasten breiten sich mit nachfolgenden Kulturen.

2. Dreidimensionale Co-Kultur der menschliche Lungen-Fibroblasten und Krebszellen

  1. Herstellung von Zellen und Reagenzien:
    1. Etwa verwenden 2 × 10 5 Epithelzellen und 2,5 x 10 5 Fibroblasten pro Vertiefung. Bereiten Kollagen Typ IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), Rekonstitutionspuffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO 3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM mit 10% FBS für Fibroblastenkultur ergänzt, und ein 3D-Co-Kulturmedium (eine 1: 1-Mischung von Fibroblastenkulturmedium und das Kulturmedium für die Krebszellen).
    2. Kultur A549 Lungenadenokarzinomzellen, die Fibroblasten und die A549 3D Kokultur in DMEM, ergänzt mit 10% FBS.
  2. Kollagen-Gel formationen:
    1. Fibroblasten auf 10 cm Schüssel mit 1x PBS kultiviert waschen und mit 1 ml Trypsin ich auf den Teller. Nach Trypsinisierung für ~ 5 min bei 37 ° C lösen sich die Zellen unter Verwendung von 9 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt. Sammeln Zellen in dem Medium in einer 10-ml-Röhrchen suspendiert und zentrifugieren bei 200-300 xg Zellpellets zu bilden.
    2. Resuspendieren der resultierenden Pellets in 100% FBS bei einer Dichte von 5 × 10 5 / ml.
    3. Bereiten Sie die Kollagen-Gel auf Eis. Kühlung der Reagenzien, Pipetten und Röhren in einem Kühlschrank vor dem folgenden Verfahren. Auch auf Eis erstarrt die Mischung zu einem gewissen Grad, und das Gesamtvolumen weniger als die Summe aller Bestandteile ist.
    4. In jede Vertiefung, bereiten Sie die Kollagen-Gel durch Mischen von 0,5 ml Fibroblastensuspension (2,5 x 10 5 Zellen) in FBS, 2,3 ml Typ IA Kollagen, 670 ul 5x DMEM, und 330 & mgr; Rekonstitutionspuffer. Lassen Sie die Gele leicht bei Raumtemperatur eingestellt.
      1. Kräftig pipettieren, um eine homogene mi gewährleistenBefestigung. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren.
    5. Hinzufügen der Mischung (3 ml) zu jedem Well einer 6-Well-Platte und zu ermöglichen, in den Inkubator bei 37 ° C für 30-60 min gelatinieren ohne Störung.
  3. Krebszellkultur auf das Kollagengel:
    1. Führen dreidimensionalen Co-Kultur mit einem zuvor berichtet Protokoll mit Modifikationen 6.
    2. Resuspendieren Krebszellen in der 3D-Co-Kulturmedium (oder in DMEM mit 10% FBS bei der A549-Zellen) in einer Dichte von 1 x 10 5 / ml.
    3. Pour 2 ml des resuspendierten Zelllösung (2 x 10 5 Zellen) auf die Oberfläche eines jeden Gels. Ändern der Zellzahl der Krebszellen oder Fibroblasten in Kokultur je nach Versuchsbedingungen.
  4. Gelkontraktion:
    1. Gele über Nacht bei 37 ° C, so dass die Krebszellen zu dem Kollagengel haften. Trennen Sie jedes Gel, und erzeugen einen "schwebenden Kultur" in jede Vertiefung of 6-Well-Platte.
      HINWEIS: Durch die Verwendung eines schwimmenden Kultur, sind verschiedene Änderungen in Gelgröße durch mechanische Spannung und Kollagenabbau, die von zellulären Wechselwirkungen zwischen co-kultivierten Krebszellen und Fibroblasten vermittelt werden induziert.
    2. Verwenden eine abgewinkelte 21 G Nadel oder Spachtel, jedes Gel, das aus dem Rand des Bohrlochs abzutrennen. Alle 2-3 Tage, aktualisieren Sie die Vertiefungen mit 2 ml 3D-Co-Kulturmedium. Messen der Größe jedes Gel täglich für 5 Tage.
  5. Analyse Kollagengelen:
    1. Messung der Kollagengehalt von jeweils unter Verwendung von Kollagen-Quantifizierungsverfahren, wie dem Sircol Assay. Führen Transkriptom-Analyse oder quantitativer RT-PCR nach dem Sammeln von RNA aus den Gelen 5.

3. Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, Kultur und Invasion Assay

  1. Nach Kultivieren der Kollagengele bei 37 ° C für 5 Tage, setzen die kontrahierten Gele Luft, indem sie auf ein Sieb (70 & mgr; m Porengrße) in neue 6-Well-Platten. Stellen Sie das Netz aus kommerziell erhältlichen Zellsiebe für die Durchflusszytometrie verwendet.
  2. Vorsichtig füllen jede Vertiefung mit 11 ml 3D Co-Kulturmedium.
  3. Positionieren Sie die Gele auf das Netz mit einem sterilen Löffel, und entfernen Sie alle verbleibenden Medium aus den Gelen. Unter dieser Bedingung, tauchen Gele in dem Medium während setzen die obere Oberfläche des Gels in die Luft. Definieren Sie diesen Kulturbedingungen wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.
    HINWEIS: Nach 5-7 Tagen der Beibehaltung des Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche bei 37 ° C im Brutschrank migrieren invasive Krebszellen in das Gel. Je nach Zelltyp und als Ergebnis zellulärer Wechselwirkungen sind variable Grad der Zell morphologische Veränderung in den Krebszellen durch die Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle Kultur induziert.
  4. Für die histologische Beurteilung, beheben Sie das Gel in Formalin-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur und in Paraffin eingebettet werden. Fleck Vertikalschnitte (4 & mgr; m) mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Führen immunhistochemische Analyse on die Abschnitte 4.

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Ergebnisse

Diese Co-Kulturverfahren, imitiert der Tumor-Mikroumgebung ist ein nützliches Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen den Krebszellen und Fibroblasten in Kollagengele eingebettet untersuchen. Kollagengel Kontraktion, Invasion von Krebszellen und morphologische Veränderungen: In der früheren Studie wurden drei Parameter in diesem experimentellen Modell bewertet. Krebszellproliferation wurde ebenfalls mit Ki67 Immunfärbung 4 geschätzt. Lungengewebeproben wurden von krebsartigen und nicht-krebsartigen Abschni...

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Diskussion

CAF bilden eine wichtige Komponente der ECM Krebszellen umgibt, und nicht nur ein Gerüst für den Tumor, sondern auch aktiv in Tumorentwicklung 7 beteiligen. Immer mehr deutet entwirrt die Auswirkungen der CAF oder die entsprechenden Moleküle auf der eventuelle Prognose, Hervorhebung der kritischen Rolle der CAF-vermittelte Tumorprogression 8.

In der vorangegangenen Studie beschäftigten wir Auswuchs Methode zur Lungen CAF 4 zu isolieren. In diesem Experiment i...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 und 25460137).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Kollagen Typ IANitta Gelatine Inc.CELL-1A
RekonstitutionspufferNitta gelatine Inc.
DeckglasNUNC174934
SilikonfettDow Corning TorayHochvakuumfett
Dispase IWAKO386-02271
6-Well-PlatteBD Falcon353046
Cell Sieb (70 μ m)BD Falke352350

Referenzen

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Kollagengelkulturkrebsassoziierte FibroblastenTumormikroumgebungLungenadenokarzinomzellenLuft Fl ssigkeits Grenzfl cheZellinvasionsassayextrazellul re Matrixhistologische Analyse

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