Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Zusammenfassung

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Die Degeneration von mesencephalen dopaminergen (mesDA) Neuronen ist das pathologische Kennzeichen der Parkinson-Krankheit. Die Erforschung der biologischen Prozesse, die an den physiologischen Funktionen und der Vulnerabilität und dem Tod dieser Neuronen beteiligt sind, ist unerlässlich, um die zugrunde liegenden Ursachen zu verstehen und die Heilung dieser häufigen neurodegenerativen Erkrankung zu entschlüsseln. Primärkulturen von mesDA-Neuronen stellen ein Werkzeug zur Untersuchung der molekularen, biochemischen und elektrophysiologischen Eigenschaften dar, um die Entwicklung, das langfristige Überleben und die Degeneration dieser Neuronen im Krankheitsverlauf zu verstehen. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung, Kultivierung und Erhaltung von dopaminergen Neuronen des Mittelhirns aus E12.5-Mausembryonen (oder E14.5-Rattenembryonen) vor. Optimierte Zellkulturbedingungen in diesem Protokoll führen zum Vorhandensein von axonalen und dendritischen Projektionen, synaptischen Verbindungen und anderen neuronalen morphologischen Eigenschaften, die die Kulturen für die Untersuchung der physiologischen, zellbiologischen und molekularen Eigenschaften dieser neuronalen Population geeignet machen.

Einleitung

Verlust von dopaminergen Neuronen aus der Substantia nigra pars compacta führt zu den Kardinal motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD), die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die zugrunde liegende Ursache für den Niedergang des Mittelhirn neuronalen Population ist nicht bekannt. Um die biochemischen Wege für die Entwicklung und Modulation neurophysiologischen Eigenschaften und das Überleben von Neuronen mesDA mehrere Zellkultur- und Tiermodellsystemen verantwortlich verwendet wurden studieren. Immortalisierte Zelllinien, einschließlich der Ratte dopaminergen Zelllinie 1RB ₃ AN ₂₇ (N27), der menschlichen dopaminergen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y, der Maus dopaminergen Hybridzellinie MN9D und Menschen mesencephalen LUHMES Zellen für biochemische und begrenzte mechanistische Studien ¹ verwendet wurde ^-5. Für die Untersuchung des spezifischen Verlust mesDA Neuronen mehrere Neurobasis und genetische Modelle wurden entwickelt ^6-8. Primäre ventralen Mittelhirn KulturenStellen ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen und synaptischen Eigenschaften der dopaminergen Neuronen und die Wege in der Pathogenese dieser häufige Erkrankung beteiligt.

Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll für die Isolierung von Mittelhirn dopaminergen Neuronen, die Änderungen zu höheren Überlebensfähigkeit und erhöhte Ausbeute an Deckgläsern pro Embryo enthält. Die Nutzung vorzeitige E12.5 Maushirn (E14.5 in rat) erhöht die Überlebensfähigkeit. In diesem Alter Neuronen nicht Axone entwickelt noch, die Zellen intakt beim Präparieren verlässt und den Stress dadurch deutlich erhöht Überlebensfähigkeit minimiert. Darüber hinaus sorgfältige Präparation der ventralen Mittelhirn, wie in Abschnitt 2 dieses Protokoll beschrieben, weiter verbessert Überlebensfähigkeit. Um die Anzahl der Deckgläser pro Embryo zu erhöhen, wird eine alternative Beschichtungsverfahren in Abschnitt 4 dieses Protokolls vorgestellt. Dies führt zu einer Ausbeute von bis zu 10 Deck pro Embryo im Vergleich zu 4 Deckgläser unterStandard Plattierungsbedingungen wodurch die Menge der Tiere pro Versuch.

Neuronen in Kultur zeigen Auswuchs von Axonen und Dendriten bilden synaptische Verbindungen und zeigen das Vorhandensein von neuronalen und synaptischen Marker machen diese Kulturen für Live Cell Imaging, immunzytochemischen und elektrophysiologische Untersuchungen geeignet. Weiterhin ist die Verwendung von neuronalen Kulturen erleichtert und pharmakologische Manipulation. Auswuchs von Neuriten von Tag 2 in vitro ermöglicht die Entwicklungsstudien. Ferner ermöglicht die langfristige Überlebensrate von Kulturen (bis zu sechs Wochen) für ein Studium des langsame, progressive Degeneration dieser Neuronen geeignet.

Protokoll

HINWEIS: Die Tiere wurden durch die Imperial Colleges und Tierschutz beibehalten und in Übereinstimmung behandelt mit den institutionellen Richtlinien und alle Tier Verfahren genehmigt und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und das Innenministerium und der Harvard University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit Bundes- und Landesvorschriften.

1. Reagenzien und Geräte-Setup

1. Thaw, aliquoten und speichern 1 mg / ml Laminin-Lösung bei -80 ° C. Löse 2 ul in 1 ml DMEM / F12, was in einer Beschichtungskonzentration von 1-2 & mgr; g / cm ^2.
   HINWEIS: Thaw Laminin langsam auf Eis und lösen sich in kaltem DMEM / F12 und unmittelbar darauf an den Platten / Deck hinzuzufügen.
2. Verdünnen Sie 75 ml 0,01% Poly-L-Ornithin in 425 ml PBS und bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Haltbarkeit der Arbeitslösung bis zu einem Monat.
3. Lösen Sie 25% (w / v) BSA in PBS, pH 7,4, und bei 4 ° C für bis zu eine year.
4. Bereiten Sie 50% FBS (in HBSS) Deaktivierung Medien.
5. Bereiten Komplettmedium durch Zugabe von 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1x N2 Ergänzung, 5% (Vol / Vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucose (w / v), 0,25% BSA (w / v), um DMEM / F12 und bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Haltbarkeitsdauer beträgt bis zu 10 Tage.
6. Ort Deck in kochendem 70% (vol / vol) Ethanol für mindestens 30 min, um jegliche Spuren von Fett und Autoklaven entfernen.
7. Ort Deck in Platten mit 24 Vertiefungen und fügen 500 ul Poly-L-Ornithin-Lösung in jede Kammer. Inkubieren Sie 1 Stunde unter der Gewebekultur Haube bei RT und dann waschen 3 Mal mit 500 ul Wasser. Gib 500 ul Laminin-Lösung zu jeder Platte und Inkubation O / N in der befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 37 ºC.
   HINWEIS: Wenn keine Waschschritte nach Laminin Behandlung notwendig, Waschen der Poly-L-Ornithin weniger als dreimal führt zum Tod der Zellen nach 24 h Kultivierung.
8. Polieren Sie die Spitzen der Glaspipetten über Erdgas oder Taschenlampe flahm.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt wird der Durchmesser der Spitze sollte etwa die Hälfte seiner normalen Größe sein.
9. Schneiden Sie die Kappen von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit einem autoklavierten Scheren und Autoklaven.

2. Präparation der embryonalen ventralen Mittelhirn

1. Narkotisieren timed-schwangeren (E12.5) Dämme durch CO ₂ Inhalation und durch Genickbruch einschläfern.
2. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und eine Bauchschnitt, bis die Gebärmutter Säcke alle ausgesetzt sind. Mit einer Pinzette schneiden die vaginale Befestigung und entfernen Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem HBSS, in einer 100 mm Petrischale.
3. Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase zu entfernen, mit einer Pinzette (Abbildung 1C). Platz Embryonen in frischem eiskaltem HBSS.
   HINWEIS: Das Rechteck in Figur 1D zeigt die Stelle von embryonalen ventralen Mittelhirn.
4. Legen Sie die Embryonen unter Dissektionsmikroskop (10-fache Vergrößerung) und sezieren die MittelhirnBogen, indem das Gehirn an der Landenge und Mittelhirn-Zwischenhirn Randbereich, mit dem bioscissor und Pinzette (1E, siehe 1A für Linien der Einschnitt Abbildung).
5. Nach dem Herausnehmen der gesamten Mittelhirn, einen Schnitt in der mediodorsal Mittelhirn (1F).
6. Hirnhaut entfernen, mit zwei Zangen (Abbildung 1H).
   HINWEIS: entscheidender Schritt: Dieser Schritt ist wichtig für eine optimale Ausbeute und neuronale Überleben. Da die Kulturbedingungen optimal für Gehirnzellen sind, die meisten der Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu sterben nach der Plattierung und die apoptotische Signal dieses Gewebe kann die Integrität der Kulturen schädigen.
7. Glätten Sie das Mittelhirn Gewebe auf der Petrischale, die Schmetterlingsform beobachten und schneiden etwa die Hälfte eines jeden Flügels, mit einem sterilisierten Rasierklinge (Abbildung 1 H, I).
   HINWEIS: Figur 1J zeigt die isolierte ventralen Mittelhirn.
8. Übertragen Sie dieStück ventralen Mittelhirn in eiskaltes HBSS in einem 15 ml konischen Rohr und fahren Sie mit dem nächsten Embryo.
   Hinweis: Die Schritte 2,1-2,8 sollte nicht mehr als 1 Stunde. Halten Sie die Embryonen außerhalb dieses Zeitrahmens auf Eis sinkt die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich.

3. Die Dissoziation von ventralen Mittelhirn-Zellen

1. Übertragen Sie die Stücke von ventralen Mittelhirn unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die HBSS und 1 ml vorgewärmten (37 ° C) 0,05% Trypsin-EDTA in das konische Röhrchen (Menge reicht für bis zu 12 Stück der ventralen Mittelhirn). Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C für 5-10 min.
2. Entfernen Trypsin-EDTA unter der Haube und 1 ml Deaktivierung Medium (das Serum wird Trypsin deaktivieren) auf das Gewebe.
3. Entfernen Sie die Deaktivierung Medium und waschen Sie das Gewebe in 1 ml vollständigem Medium zweimal.
   HINWEIS: Vermeiden Entfernen aller das Medium von der Röhre und Pipettieren der Gewebe, Verwerfen der dissoziierten Zellen zu verhindern.
4. In 1 ml Vollmedium und tritUrat das Gewebe mit einer feuerpolierten Glaspipette. Bildung von Blasen zu vermeiden, und weiterhin Verreiben bis einzelne Zellsuspension erreicht wird.
   Hinweis: geht normalerweise 8-10 durch den verengten Spitze für vollständige Dissoziation erforderlich.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Medium.
6. Re-suspendieren des Pellets in 1 ml Komplettmedium durch langsames Auf- und Abpipettieren mit bis zu viermal.

4. Überzug ventralen Mittelhirn-Zellen

1. Nimm 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul Trypan-Blau-Lösung und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann auf dieser Stufe auch überprüft werden.
2. Zeigen sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen Caps in 100 mm Petrischalen und übertragen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Deckgläser, mit einer Pinzette, einer nach dem anderen auf der Oberseite der Caps.
   HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser und vermeiden Trocknen des Laminin, da dies dazu führen uneven Kulturen und Abnahme der Überlebensfähigkeit der Zellen.
3. Die Lautstärke auf 1.500 Zellen pro 1 & mgr; l durch Zugabe von komplettem Medium und Zugabe von 100 & mgr; l (insgesamt 150.000 Zellen) der Zellsuspension auf jedes Deckglas (das Volumen ist optimal, um die Oberfläche des Deckglases ohne Verschütten zu bedecken). Schließen die Petrischalen und inkubieren für 1 h in einem befeuchteten Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).
   HINWEIS: kritischer Schritt: Dieser Schritt ist für die Verbesserung der Befestigung und die Lebensfähigkeit der Zellen und zur Erhöhung der Anzahl der Deckplättchen pro Embryo erforderlich. Alternativ können die Zellen direkt in die Vertiefungen (mit Deckgläschen), aber die Anzahl von Zellen sollten bis 350.000 pro Well (statt 150.000) erhöht werden übertragen. In anderen Worten, mit dieser Methode können 8-10 Deck erworben werden, während die Direktübertragung ergibt etwa 3-4 Deck weil der Zellen, die an den Platten anzubringen (neben oder unterhalb der Deck). Die durchschnittliche viability der Kulturen, unter Verwendung dieses Verfahrens betrug etwa 90%.

5. Kultur Wachstum und Wartung

1. Nach 1 Stunde Inkubation sorgfältig übertragen Sie die Deckgläser mit dem Medium in 24-Well-Platten, enthaltend 400 & mgr; l vorgewärmten (37 ° C) vollständigem Medium (Gesamtvolumen: 500 ul). Die Zellen O / N bei 37 ° C.
2. Innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation die Wells vorsichtig fügen 500 ul Vollmedium in jede Vertiefung.
   Hinweis: die ersten paar Stunden ist die kritischste Phase für das Überleben von dopaminergen Neuronen und die Anzahl der überlebenden Zellen nicht signifikant über diesen Punkt hinaus zu ändern.
3. Sie zusätzliche Medien hinzufügen, nicht zu den Kulturen in den ersten zwei Wochen, bis das Medium wird gelb. Wenn Kultivierung für mehr als zwei Wochen oder mittlere Farbumschlag nach gelb, Austausch Hälfte der Medien (500 ul) mit frischem Komplettvorgewärmten Medien (in der Regel alle zwei Wochen).
   HINWEIS: Die dopaminerge Neuronen innerhalb derKulturen würden für mehr als 6 Wochen unter diesen Bedingungen zu überleben.

Ergebnisse

Immunhistochemie gegen Tyrosinhydroxylase (Th) zeigt, dass zwischen 0,5-1% der Zellen in Kultur sind dopaminergen. Neuronale Projektionen erscheinen innerhalb von 2 Stunden nach dem Ausstreichen von dem ersten Tag, Axonen und Dendriten unterscheidbar sind (Abbildung 2), unter Verwendung von Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Microtubule-Associated Protein 2 (Map2) Antikörper (Abbildung 3). Die Neuronen überleben länger als sechs Wochen zeigen umfangreiche Auswuchs. Das Neuron-Glia-Verhältnis ...

Diskussion

Dopaminerge Neuronen im Mittelhirn sind die Hauptquelle von Dopamin im ZNS. Sie werden in drei Gruppen unterteilt, Substantia nigra pars compacta (SNpc), ventralen Tegmentum (VTA) und retrorubral Feld (RRF) ^{10, 11.} Die Neuronen im VTA SNpc und führen zu großen dopaminergen Bahnen, mesocorticalen, mesolimbischen und nigrostriatalen, in Funktionen beteiligt wie die Kontrolle der Emotionen, Motivation und Verhalten des Motors. Untergang der Neuronen in SNpc und funktionellen Störung des nigrostriatalen Systems i...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's modifizierte Eagle Medium Nährstoffmischung F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), flüssiges	Invitrogen	24020-117
Fetales Rinderserum, hitzeinaktiviert (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), flüssiges	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glukose Lösung (45 % (wt/vol) in Wasser	Sigma	G8769
Rinderserumalbumin BSA	Sigma	A9430
Laminin aus Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkom-Basalmembran	Sigma	L2020
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0,05 % (wt/vol)	Invitrogen	25300
Rinderserum Albumin (BSA) Zellkultur getestet	Sigma	A9418
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosin-Hydroxylase (Th)-Antikörper	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-Ornithin, 0,01%ige Lösung	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2A und -2B) Antikörper	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 Antikörper	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG    Antikörper	Molekulare Sonden	A-21206
Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG    Antikörper	Molekulare Sonden	A-21207
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Schaf IgG    Antikörper	Molekulare Sonden	A-11015
Alexa Fluor 594 Esel Anti-Schaf IgG    Antikörper	Molekulare Sonden	A-11016
Alexa Fluor 594 Esel Anti-Maus IgG    Antikörper	Molekulare Sonden	A-21203
Trypanblau-Lösung (0,4 % (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereomikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverses Phasenkontrastmikroskop	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Pinzette	Fine Scientific Tools	May-45
Deckglaszange – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Zwei Dumont #45 Pinzetten – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Klingenhalter/Brecher Flacher Griff - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Schere - Gerade 11,5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Faseroptische Halogenbeleuchtung	Nikon	MKII
Einweg-Pasteur-Pipetten aus Borosilikatglas	Fisherbrand	13-678-20C
Hämozytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0,2 &Mikro; m sterile Filtereinheiten	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petrischalen	BD Biosciences	351005
Runde Deckglas #1 Dicke Deutsches Glas 12 mm	Bellco Glas	1943-10012