Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Echtzeit-Multiphotonen-Bildgebung bietet eine großartige Möglichkeit, den Zelltransport und Zell-zu-Zell-Interaktionen in ihrer physiologischen 3-dimensionalen Umgebung zu untersuchen. Die biologische Aktivität von Immunzellen hängt hauptsächlich von ihrer Motilitätsfähigkeit ab. Blutmonozyten haben eine kurze Halbwertszeit im Blutkreislauf; Sie stammen aus dem Knochenmark und werden konstitutiv aus diesem freigesetzt. Im entzündlichen Zustand wird dieser Prozess verstärkt, was zu einer Blutmonozytose und einer anschließenden Infiltration des peripheren Entzündungsgewebes führt. Die Identifizierung der biomechanischen Ereignisse, die den Monozytentransport vom Knochenmark zum Gefäßnetz steuern, ist ein wichtiger Schritt, um die physiopathologische Relevanz der Monozyten zu verstehen. Wir führten eine in vivo Zeitraffer-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie des Schädelknochenmarks der Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) Maus durch. Die MacBlue-Maus exprimiert das fluoreszierende Reporter-verstärkte cyan-fluoreszierende Protein (ECFP) unter der Kontrolle eines myeloischen spezifischen Promotors 1 in Kombination mit der Markierung des vaskulären Netzwerks. Wir beschreiben, wie dieser Ansatz die Verfolgung einzelner medullärer Monozyten in Echtzeit ermöglicht, um das Migrationsverhalten innerhalb des Knochenmarkparenchyms und des Gefäßsystems sowie die Zell-zu-Zell-Interaktionen weiter zu quantifizieren. Dieser Ansatz bietet neue Einblicke in die Biologie der Monozyten-Untergruppen des Knochenmarks und ermöglicht es, weiter zu untersuchen, wie diese Zellen unter bestimmten pathologischen Zuständen beeinflusst werden können.
Einleitung
Das Knochenmark spielt eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese und stellt das Hauptreservoir an Monozyten dar, die konstitutiv zwischen dem Blut und dem medullären Parenchym rezirkulieren, den Pool zirkulierender Monozyten mit einer kurzen Lebensdauer erneuern 2,3 und an der Rekonstitution der Steady-State-Gewebe-Makrophagen und dendritischen Zellen teilnehmen 4. Während einer Entzündung oder nach einer vorübergehenden Aplasie werden Monozyten aktiv entweder aus dem Knochenmark oder der Milz mobilisiert 5, 6, 7 und besiedeln entzündete Organe. Mehrere Chemolockstoffachsen waren am Prozess der Mobilisierung myeloischer Zellen....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Experiment Protokolle wurden von der Französisch Tierversuche und Ethik-Kommission genehmigt und vom "Service Protection et Santé Animales, Environnement" mit der Nummer A-75-2065 validiert. Probengrößen werden so gewählt, um die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten und nach dem 3R tierischen Ethik Regulierung.
1. Herstellung der Mäuse
- Anästhesie
- Für kurze Zeit der Bildgebung (weniger als 1 Stunde), betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul einer Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
- Alternativ kann für längere Zeitabbil....
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Ergebnisse
Mäuseschädelstruktur bietet eine gute Gelegenheit, die Knochenmark Physiologie von Intravital Imaging studieren. Der Knochen dünn um den vorderen Scheitelbereich, ist es möglich, Zugang zur Mark Nischen ohne Abrieb des Knochens zu erhalten. 1 stellt eine breite 2D Bereich des Schädels eines MacBlue transgenen Maus. Die Knochenmatrix wird hauptsächlich aus Kollagen I leicht durch SHG 19 feststellbar. Injektion von Rhodamin-Dextran färbt die Gefäßnetz des Knochenmarks und ermöglicht die Identif.......
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Diskussion
Die kritischen Punkte der in vivo Bildgebung Methodik, um die Stabilität der Ausrichtung, um die Dauer der Bildgebung zu maximieren und das Risiko einer bakteriellen Kontamination und Entzündungen, die die Dynamik der entzündlichen Zellen auswirken können, zu minimieren gewährleisten. Imaging Schädelknochenmark folgt diese Ziele auf die Operation durchgeführt, um Zugang zu dem Knochenmark zu erhalten, ist minimal. Die Verwendung von sterilem Material und Antiseptika ist wichtig, um das Risiko von Infekti.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich Anne Daron und Pierre Louis Loyher für redaktionelle Unterstützung danken, die Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskop und das Tier Facility "NAC" und Camille Baudesson für Mäuse züchten Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr 304.810 - RAIDs und Nr 241.440-EndoStem von Inserm, der Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", von la" Ligue contre le cancer ", von" Association pour la Recherche sur le Cancer "und von" Agence Nationale de la R....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, Anästhetikum | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, Anästhetikum | |
| Isofluran | Baxter | 2,5%, Anästhetikum | |
| O2/NO2 | 70/30 Gemisch, Anästhetikum | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Gefäßfärbung | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson-Klon | 1A8, Neutrophilenfärbung | |
| Stereotaktischer Halter | Hausgemachte | Chirurgie | |
| Ethanol 70% | Chirurgie | ||
| Sterile Scheren- und Zangenchirurgie | |||
| Gummiring | 18 mm Durchmesser, Chirurgie | ||
| Glubran 2 | Queryo Medizin | Chirurgischer Kleber, Fixierung von Gummiringen | |
| Kleine Nadeln | Terumo | Chirurgie | |
| Zeiss LSM 710 NLO Multiphotonenmikroskop | Carl Zeiss | Mikroskop | |
| Ti: Saphirkristall-Laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec Pulse von NIR-Licht | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquisition Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane-Analysesoftware | , automatisches 3D-Tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher-Chirurgie | ||
| Thermostatkammer | Carl Zeiss | Intravital-Bildgebung |
Referenzen
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.
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Nachdrucke und Genehmigungen
