Method Article

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

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Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.

Abstract

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Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Vorgestellt werden verschiedene Techniken für die Verarbeitung von EVs und zwei Protokolle zur Analyse von EVs entweder Einzelerkennung oder einen Wulst-basierten Ansatz. Die hier beschriebenen mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten unterstützen Methoden ansteigendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in einer rationalen fashion das Detektieren von Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Wulst basierten Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.

Introduction

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Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode....

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Protocol

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HINWEIS: Die folgenden Protokolle wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle menschlichen Subjekt Proben wurden unter einem Institutional Review Board (IRB) -zugelassene Protokoll und mit Einwilligung der Versuchspersonen getestet.

1. Methode A: Individuelle Erkennungsmethode

1.1) Die Verarbeitung von Blut-Probe / Isolation von Elektrofahrzeugen

  1. Blutentnahme vom Spender / Patienten in zwei 10 ml Glasröhrchen mit 1,5 ml ACD-A-Lösung oder einem anderen geeigneten Antikoagulans und Prozess sofort (inn....

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Results

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Abbildung 1 skizziert den gesamten Verarbeitungssystem für die Isolierung und den Nachweis von EVs entweder mit dem Wulst-basierten Verfahren oder einzelne Nachweismethode. Individuelle Detektion EVs mit FCM funktioniert gut für die Analyse großer EVs aber die meisten Zytometer nicht fähig sind einzeln Detektieren von Teilchen so klein wie Exosomen. Ein Wulst basierte Ansatz erlaubt kleine EVs nachzuweisenden jedoch gibt es Nachteile bei der Verwendung dieser Verfahren verbunden sind, wie in Tab.......

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Discussion

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Zwei verschiedene Protokolle für die Isolierung, Behandlung und Analyse EVs vorgestellt, unter Verwendung entweder eines einzelnen Detektions oder Wulst-basierten Ansatz. Die Auswahl des geeignetsten Methode zu verwenden, ist nicht immer einfach und erfordert ein Verständnis der Probe, die ebenfalls getestet, wie die einzelnen Subpopulationen von Interesse. Weiterhin muss die Empfindlichkeit des Zytometer zur Erfassung verwendet bei der Auswahl des am besten geeigneten Verfahren sein. Oft gibt es keine einzelne beste Pr.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offen zu legen.

Acknowledgements

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Die Autoren bedanken sich bei Dale Hirsch von Blut Systems Research Institute für seine Hilfe bei Durchflusszytometer Geräteeinstellungen zu danken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt HL095470 und U01 HL072268 und DoD Verträge W81XWH-10-1-0023 und W81XWH-2-0028.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II Tisch-DurchflusszytometerBD Biosciences3-Laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blau, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violett und 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rot)
FACS Diva Software BD BiosciencesPC Version 6.0
FlowJo Software Treestar USMac Version 9.6.1 oder PC Version 7.6.5
Sphero Rainbow fluoreszierende PartikelBD Biosciences556298verwendet, um alle Kanalspannungen anzupassen, um die Konsistenz der Fluoreszenzintensität zu erhalten.
Ultra Rainbow fluoreszierende Partikel SpherotechURFP-10-5wird zusätzlich zu Megamix-Plus SSC-Kügelchen verwendet, um die Konsistenz des EV-Gating von Charge zu Charge zu gewährleisten
Megmix-Plus SSC-KügelchenBiocytex7803wird verwendet, um die FSC- und SSC-Spannungen anzupassen, um die Konsistenz zwischen den Durchläufen aufrechtzuerhalten. Kann auch zur Überwachung der Durchflussrate und zur Anpassung der Durchflussrate verwendet werden, um sicherzustellen, dass bei allen Läufen die gleiche Durchflussrate verwendet wird
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344wird für Kompensationskontrollen und negative AbC-Kügelchen verwendet, die für die auf Kügelchen basierende Methode
verwendet werden Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108wird in der Einzelnachweismethode nur zur Lyse von Proben nach der ersten Ablesung zur Verwendung als Negativkontrollen verwendet. Die Brühe kann in PBS auf 1:10 verdünnt und bis zu 1 Monat im Kühlschrank gelagert werden.
BD TruCOUNT RöhrchenBD Biosciences340334immer dann eingesetzt, wenn absolute EV-Konzentrationen benötigt werden
Ultrafree-MC, GV 0,22 µ m ZentrifugalfiltereinheitenMillipore UFC30GVNBzur Nachfärbung von EVs und/oder zur Fraktionierung von EVs basierend auf der Größe
verwendet Vacutainer-Glas Vollblutröhrchen ACD-ABD Biosciences364606
Facs Röhrchen 12x75 PolystrenBD Biosciences352058
50 ml Reservoirs einzeln verpacktPhenixRR-50-1s
- 10 & Mikro; lRaininGP-L10S
Green-Pak Pipettenspitzen -200 & Mikro; l RaininGP-L250S
Grün -Pak Pipettenspitzen - 1.000 µ l RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 Spitzen vorsterilisiertRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Kanal LTS  Einstellbar  Abstandhalter RaininLA8-300XLS
96-Well-GewebekulturplattenE& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Medien (ohne Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001Medien für die Bead-basierte Nachweismethode
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-frei, 0,2 &; Mikro; m gefilterteUCSF-ZellkulturanlageCCFAL003
Ultrazentrifugenröhrchen, dünnwandig, ultraklarBECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µ l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 µ l
CD16 V450BD Biowissenschaften5604742 &Mikro; l
CD28 FITCbiolegend3029062 µ l
CD152 APCBD Biosciences5558552 µ l
CD19 A700Biolegend3022262 µ l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 µ l
CD62L APCBiolegend3048102 µ l
CD108 PE BD Biosciences5528302 µ l
CD235a FITCbiolegend3491042 µ l
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 µ l
CD62p APCBiolegend3049102 &Mikro; l
CD66b PE Biolegend3051062 µ l
CD15 FITCexalphaX1496M5 µ l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBiolegend400230
Green-Pak Pipettenspitzen 344058

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

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Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

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