Methodenartikel

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

DOI:

10.3791/52487

22. Dezember 2014

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Anatomische Pfadverfolgung ist von entscheidender Bedeutung, um die Beziehung zwischen Gehirn und Verhalten zu entschlüsseln. Die Entschlüsselung der Bildung neuronaler Schaltkreise während der embryonalen Reifung des Gehirns ist jedoch eine technische Herausforderung, da die meisten bisher entwickelten transsynaptischen Tracing-Methoden auf stereotaktischer Tracer-Injektion basieren. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine binäre genetische Strategie für die bedingte genetische transsynaptische Nachverfolgung im Gehirn von Mäusen entwickelt. Zu diesem Zweck haben wir zwei komplementäre Knock-in-Mausstämme generiert, um selektiv den bidirektionalen transsynaptischen Tracer Gerstenlektin (BL) und den retrograden transsynaptischen Tracer Tetanustoxin Fragment C aus dem ROSA26-Locus nach Cre-vermittelter Rekombination zu exprimieren. Die zellspezifische Tracerproduktion in diesen Mäusen ist genetisch kodiert und hängt nicht von einer mechanischen Tracer-Injektion ab. Daher ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Gehirn von Mäusen zu untersuchen. Da der Tracer-Transfer zwischen Synapsen von der synaptischen Aktivität abhängt, können diese Mausstämme außerdem verwendet werden, um die Kommunikation zwischen genetisch definierten neuronalen Populationen während der Gehirnentwicklung mit einer Einzelzellauflösung zu analysieren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das transsynaptische Tracing in Mausembryonen unter Verwendung der neuartigen rekombinanten ROSA26-Allele zur Verfügung. Wir haben diese experimentelle Technik verwendet, um die neuronalen Schaltkreise zu beschreiben, die der Reifung der Fortpflanzungsachse im sich entwickelnden weiblichen Mäusegehirn zugrunde liegen.

Einleitung

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Anatomische Pfadverfolgung ist eine der am häufigsten verwendeten Werkzeuge, um die Beziehung zwischen Gehirn und Verhalten 1 entziffern. Fortschritt in neuronalen Schaltkreis Tracing Technologien hat Neurowissenschaftler mit der Fähigkeit, neuronale Schaltkreise genetisch identifiziert Neuronenpopulationen in Mäusen 2 Spuren verliehen. Trotz dieser technischen Fortschritt bleibt es schwierig, die Bildung von neuronalen Schaltkreisen vor allem während der embryonalen Reifung zu entwirren. Das ist, weil die meisten der bisher entwickelten Tracing-Verfahren basieren auf stereotaktische Injektion von transsynaptische Tracer oder gentechnisch veränd....

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Protokoll

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HINWEIS: Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierschutzkommission der Universität Hamburg und der Universität des Saarlandes genehmigt.

1. Vorbereitung und Fixierung von embryonalem Gewebe

  1. Vereinbaren Sie alle mussten sezieren die Embryonen und die Lösungen für die anschließende Fixierung des Gewebes vor dem Töten der Tiere Ausrüstung.
    HINWEIS: Immer eine frische 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (4% PFA in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert auf 7,4).
  2. Euthanize zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren.
  3. Übertrage....

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Ergebnisse

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Dieser Abschnitt zeigt repräsentative Ergebnisse, die erhalten wird, kann die Arbeit mit dem R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) und der R26-GTT (G FP TT C) Allele werden. Hier verwenden wir die R26-BIZ und der R26-GTT-Allele, die Reifung der neuronalen Schaltkreise Regulierung der reproduktiven Achse analysieren. Die Vervielfältigung in Wirbeltieren wird zentral von einer kleinen Untergruppe von Neuronen im Hypothalamus, die Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) abs.......

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Diskussion

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Ausdruck transsynaptische Tracer als Transgene, die neuronale Schaltkreise genetisch definierten neuronalen Populationen verfolgen hat mehrere Vorteile gegenüber dem stereotaktische Injektion von Tracern oder neurotopic Viren. Zuerst wird der Tracer als endogenes Protein erzeugt und daher keine Immunantwort hervorzurufen und eine selektive neuralen Weg kann in verschiedenen Tieren, die mit hoher Reproduzierbarkeit zu analysieren. Zweitens, weil dies eine nicht-invasive Methode kann verwendet werden, um die Schaltungen v.......

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Offenlegungen

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Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.

Danksagungen

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Wir danken Michael Candlish für kritische Kommentare zum Manuskript. Dieses Projekt wurde gefördert durch die Förderungen BO1743/6 der Deutschen Forschungsgemeinschaft und SFB/TRR 152 P11 und Z02 an Ulrich Boehm.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bisbenzimid (Hoechst 33258 Farbstoff)Sigma14530-100MG
EthanolSigma32205-1L
Kryo-Form (Peel-a-way)Polyscience Inc.18646A-122 x 22 x 20 mm
DMSOSigmaD8418-100ML
Dimethylformamid (DMF)VWR Chemicals23470,293
EGTAROTH3054.3
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
GlutaraldehydSigmaG5882-50ML
WasserstoffperoxidSigma34988-7
Isopentan (Methyl-2-butan)SigmaM32631-2.5L
Kaiser's Glycin GelatineMerck1092420100
MethanolSigma494437-1L
MgCl2SigmaM2670-100G
NaClROTHHN00.2
NBTSigma298-83-9
Nonidet P40 ErsatzFluka743.85
OCTLeica14020108926
PAP penDakoS2002
ParafarmaldehydSigmaP6148-1KG
NatriumdesoxycholatSigmaD6750-25G
SaccharoseSigmaS7903-1KG
Superfrost RutschenThermo ScientificFT4981GLPLUS
TSA KitPerkinElmerNEL700
TSA plus KitPerkinElmerNEL749A001KT
TrisROTHAE15.2
Triton-X 100ROTH3051.2
Tween 20ROTH9127.1
X-galROTH2315.1
KryostatLeicana
Lichtmikroskop ausgestattet mit DIC-BildgebungZeissAxioskop2 ausgestattet mit Axio Vision Software
Fluroszenz MikroskopZeissAxioskop2 ausgestattet mit Axio Vision Software
PhotoshopAdobePS6
Ziege Anti-WGA (erkennt BL)Vector LaboatoriesAS-2024
Biotinylayted Pferd Anti-Ziegen-IgG-VektorLaboatoriesBA-9500
Biotinyliertes Kaninchen Anti-Kaninchen Anti-Kaninchen IgGVektor LaboatoriesBA-1000
Kaninchen Anti-GFP (erkennt GTT)InvitrogenA11122
Kaninchen Anti-GnRHAffinity Bio ReagenzPA1-121
Dylight488-Esel Anti-Kaninchen-IgGThermo ScientificSA5-10038
SA-Alexa Fluor 546Life TechnologiesS-11225<
BL Fwd (für BIZ-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (für BIZ-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonAGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (für Cre-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (für Cre-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (für GTT-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (für GTT-Genotypisierung)Eurofins MWG OperonGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (für Geschlechtsgenotypisierung)Eurofins MWG OperonTGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (für die Geschlechtsgenotypisierung)Eurofins MWG OperonCCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 FwdEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTGAGTTGTTATC
ROSA26 RevEurofins MWG OperonGCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA RevEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
td colspan="4">Primer

Referenzen

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  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in t....

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Schlagwörter

Bedingtes genetisches TracingBildung neuronaler SchaltkreiseCre vermittelte RekombinationROSA26 AlleleGerstenlektin TracerTetanustoxin Fragment CEinzelzellaufl sungReifung der Fortpflanzungsachse

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