Methodenartikel

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

DOI:

10.3791/52504

⸱

1. Februar 2015

 ,  ,  , 
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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TALEN-vermittelte Geneditierung am Safe-Harbor-AAVS1-Locus ermöglicht eine hocheffiziente Transgen-Addition in humanen iPSCs. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Vorbereitung von iPSCs für die TALEN- und Donorvektorverabreichung, zur Transfektion von iPSCs und zur Auswahl und Isolierung von iPSC-Klonen, um eine gezielte Integration eines GFP-Gens zur Erzeugung von Reporterlinien zu erreichen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die gezielte Addition von Transgenen kann eine persistente Genexpression ermöglichen und gleichzeitig das Gen-Silencing und die Insertionsmutagenese umgehen, die durch die zufällige Integration viraler Vektoren verursacht werden. Dieses Protokoll beschreibt eine universelle und effiziente Transgen-gezielte Additionsplattform in humanen iPSCs, die auf der Verwendung validierter Open-Source-TALENs und eines Genfallen-ähnlichen Donors basiert, um Transgene in einen Safe-Harbor-Locus zu bringen. Wichtig ist, dass eine effektive Gen-Editierung durch die Verabreichungseffizienz von Gen-Editing-Vektoren begrenzt ist. Daher konzentriert sich dieses Protokoll zunächst auf die Vorbereitung von iPSCs für die Transfektion, um eine hohe nukleare Abgabeeffizienz zu erreichen. Wenn iPSCs mit einem sanftzelligen Dissoziationsreagenz in einzelne Zellen dissoziiert und mit einem optimierten Programm transfiziert werden, können >50%-Zellen dazu gebracht werden, die großen Gen-Editing-Vektoren aufzunehmen. Da sich der AAVS1-Locus im Intron eines aktiven Gens (PPP1R12C) befindet, wurde ein Spleißakzeptor (SA)-verknüpftes Puromycin-resistentes Gen (PAC) verwendet, um gezielte iPSCs auszuwählen, während nur zufällige Integrationszellen und nicht transfizierte Zellen ausgeschlossen wurden. Diese Strategie erhöht die Chance, gezielte Klone zu erhalten, erheblich und kann auch in anderen aktiven Gen-Targeting-Experimenten verwendet werden. Zwei Wochen nach der Auswahl von Puromycin in der für die spezifische iPS-Linie angepassten Dosis sind die Klone bereit, durch manuelles Sezieren großer, isolierter Kolonien in kleinere Stücke ausgewählt zu werden, die für die weitere Expansion und das genetische und funktionelle Screening in ein frisches Medium in einer kleineren Vertiefung überführt werden. Man kann diesem Protokoll folgen, um problemlos mehrere GFP-Reporter-iPSC-Linien zu erhalten, die für die In-vivo- und In-vitro-Bildgebung und Zellisolierung nützlich sind.

Einleitung

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Die Fähigkeit, menschliche Körperzellen in embryonale Stammzellen-ähnliche pluripotenten Stammzellen umprogrammieren (iPS) wurde zuerst von Takahashi et al entdeckt. 2007 1. Humane dermale Fibroblasten, die mit Retroviren exprimieren vier Transkriptionsfaktoren transduziert (die so genannt Yamanaka Faktoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc und Klf4) gezeigt wurden hoch ähnlich menschliche embryonale Stammzellen (hES) auf der Grundlage der Morphologie, Proliferation, Genexpression und epigenetische Zustand zu sein; entscheidend ist, sind ebenfalls iPSCs und zur Differenzierung zu Zellen von allen drei Keimschichten 1. Die Proliferationspotential und Differenzierung Kapazität von iPS-Zellen macht sie sehr attraktiv Werkzeuge; durch Umprogrammieren Zellen von Patienten mit bestimmten Krankheiten, iPSCs sowohl in vitro Krankheitsmodellsystemen und als potentielle Therapeutika verwendet werden.

Zu letzterem Zweck müssen mehrere Probleme, bevor das volle Potenzial von iPS-Zellen behandelt werdenin einer klinischen Umgebung realisiert werden kann; das tumorigene Potential von in vitro kultivierten hESCs und iPSCs, die Verwendung von xenogenen Derivate während Umprogrammierung und Zellerhaltung, und die Notwendigkeit der transplantierten Zellen in vivo zu verfolgen sind entscheidende Hürden für die klinische Anwendung von pluripotenten Stammzellen (Bewertet von Hentze et al. 2). Eine ideale Lösung für den Bedarf für die Verfolgung von differenzierten Zellen nach Transplantation würde eine visuell detektierbare Markierung, Resists Silencing und Buntheit unabhängig von der Anwendung. Robust und nachhaltig Ausdruck der integrierten Transgene ist am leichtesten erreichbar sind, wenn exogene DNA in die Safe-Harbour-Loci eingeführt; das heißt, Genomorte, die ausreicht, die Transkription eines integrierten Vektor zu ermöglichen, während gleichzeitig die Minderung Perturbationen Expression benachbarter Gene in 3. Ein solcher Ort, der sehr gut charakterisiert ist seit seiner Entdeckung ist das Adeno-assoziierte Virus integration Site 1 (AAVS1), in dem ersten Intron des Proteinphosphatase 1 regulatorischen Untereinheit 12C (PPP1R12C) -Gen. Dieser Locus wurde gezeigt, nicht nur aufrechterhalten und robuste Expression von integrierten Transgenen durch ausgedehnte Zeit in der Kultur und in vitro Differenzierung 3 zu ermöglichen, sondern auch zum Schutz der umgebenden Gene von Transkriptionsstörungs 4; Beide Funktionen werden angenommen, dass aufgrund der Anwesenheit von endogenen Chromatin Isolatorelemente flankieren den AAVS1 Website 5.

Fortschritte in der Genom-Engineering-Tools über nur den letzten zehn Jahren haben die Leichtigkeit und Effizienz, mit der genetischen Manipulationen in jedem Zelltyp erreicht werden erheblich erleichtert. Während frühe erfolgreiche Experimente angeführten überaus niedrige Niveaus von endogenen homologen Rekombination (HR) mit einer eingebrachten Geber für das Gen-Targeting in WSR 6,7 erreichen, wird die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs), daß signinifikant induzieren homologe Rekombination durch die Erzeugung einer doppelsträngigen DNA-Bruch hat den Wirkungsgrad solcher Experimente 8,9 stark erhöht. Die Umnutzung der beiden Transkriptionsaktivator ähnlichen Effektoren (Erzählungen) von pflanzenpathogenen Xanthomonas Gattungen und die prokaryotischen Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 System in effiziente ortsspezifische Designer-Nukleasen hat Gen-Targeting in pluripotente Stammzellen aus einem zugänglichen und praxisnahe Methodik 10-13.

Eine kürzlich durchgeführte Papier beschrieben, ein effizientes Verfahren für die stabile Integration eines grün fluoreszierenden Reporterkassette in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus in menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung von TALE Nukleasen (Talens) 14. Diese gezielten iPSCs behielten ihre Fluoreszenz selbst nachdem eine gerichtete Differenzierung zu Herzmuskelzellen und die Transplantation in einem Mausmodell für Myokardinfarkt (MI), ein starker Hinweis für die Nützlichkeit solcherstabil fluoreszierende pluripotenten Stammzellen 14. Gezielt Kolonien zu erhalten, wurde ein Gen-Trap-Verfahren verwendet, wobei ein Spleiß-Akzeptor (SA), plaziert 2A selbstspaltende Peptidsequenz, die das Puromycin-N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors PPP1R12C; also nur iPS, die die DNA-Donor am AAVS1 Locus integriert haben äußern PAC, wodurch sie auswählbar auf Puromycin-Resistenz beruht; (Figur 1, 15). Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erzeugung von AAVS1-GFP-iPS-Zellen berichtet in der jüngsten Papier 14, das den Prozess der Transfektion von iPS-Zellen mit Talens und ein 9,8 kb Spender, um ein 4,2 kb DNA-Fragment in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus zu integrieren, die Auswahl iPS-Zellen auf Basis von Puromycin-Resistenz und Kommissionierung Kolonien klonalen Expansion. Die hierin beschriebenen Techniken können auf viele Genomtechnik-Experimente angewendet werden.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffartikel

  1. Das tiefgefrorene Basalmembranmatrix Lager von -20 ° C auf Eis aufgetaut und über Nacht bei 4 ° C.
  2. Nach dem Auftauen Pipette 2 mg Aliquots von Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen. Bewahren Sie diese bei -20 ° C, bis sie benötigt.
  3. Um Basalmembranmatrix beschichteten Platten vorbereiten, tauen ein Aliquot auf Eis bis zum letzten Stück Eis in den Eppendorf-Röhrchen ausgeblendet wird (in der Regel innerhalb von ca. 2 h).
  4. Nach dem Auftauen hinzuzufügen Basalmembranmatrix bis 12 ml kaltem (4 ° C) DMEM / F12, um Basalmembranmatrix Beschichtungslösung herzustellen.
  5. Hinzufügen Basalmembranmatrix Lösung des geeigneten Kulturgefäß. Für eine Platte mit 6 Vertiefungen, zu verzichten 1 ml pro Vertiefung. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, die Basalmembran-Matrix-Lösung vollständig bedeckt jede Vertiefung.
  6. Parafilm verschließen Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, und Inkubation bei room Temperatur 1 Stunde vor der Verwendung. Alternativ Shop Basalmembranmatrix beschichteten Platten / Geschirr bei 4 ° C lagern und innerhalb von 2 Wochen nach Beschichtung.
    HINWEIS: Fügen Sie Zusatz DMEM / F12 mit dem Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale um ein Austrocknen zu verhindern. Vor der Verwendung 4 ° C gelagert Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten zu kommen.
  7. Aspirat Basalmembranmatrix vollständig vor der Zugabe von Medium und Zellen.

2. Herstellung von E8 Medium

  1. Bereiten E8 Kulturmedium durch Auftauen E8 Ergänzung über Nacht bei 4 ° C.
  2. Entfernen 10 ml E8 Grundmedium aus der 500 ml Lager und entsorgen.
  3. Pipettieren Sie die gesamte 10 ml Fläschchen mit E8 Ergänzung direkt in 490 ml E8 Grundmedium. Nicht warmen komplette E8 Medium in einem 37 ° C Wasserbad, als wiederholte Temperaturschwankungen können die bFGF im comple abbauente E8 Medium.
  4. Verwenden Sie vollständige E8 Medium innerhalb von 2 Wochen nach der Zugabe der Ergänzung.

3. Auftauen von iPS-Zellen

  1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen iPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und auf Trockeneis.
  2. Schnell auftauen das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad; Schwenken Sie die Durchstechflasche in das Wasserbad, bis nur noch ein winziges Fragment des Eises bleibt.
  3. Sprühen Sie die Flasche mit 70% Ethanol und Transfer zu einem biologischen Sicherheitsschrank.
  4. 1 ml Raumtemperatur E8 Medium tropfenweise direkt in das Fläschchen.
  5. Mit einem 2 ml Pipette die Zellsuspension unter Rühren in 9 ml E8 Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen. Schwenken Sie den Schlauch häufig, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut mischen schnell.
  6. Zentrifugiere die Zellen bei 200 g für 5 min.
  7. Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in einem geeigneten Volumen von E8 mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt.
  8. Fügen Sie die Zellen, um eine entsprechende Anzahl von Keller Membrane Matrix-beschichteten Vertiefungen und in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator über Nacht. Es wird empfohlen, mindestens 0,2 x 10 6 iPSC pro Vertiefung einer 6-Well-Platte Platte auf eine schnelle Wiederherstellung nach dem Auftauen zu ermöglichen.

4. Wartung und Routine Passagieren von iPS-Zellen

  1. Aktualisieren E8 Medium täglich.
  2. Überwachen der Morphologie und der Konfluenz der Zellen mit einem inversen Mikroskop. iPS-Zellen von hoher Qualität wachsen in flache Kolonien mit deutlichen Grenzen; Einzelkolonien besitzen eine "pflastersteinartigen" Aussehen.
  3. Passage die iPS-Zellen, wenn sie zu erreichen ~ 70% Konfluenz.
  4. Bereiten Sie eine EDTA Passagieren Lösung durch Zugabe von 0,9 g NaCl und 500 ul 0,5 M EDTA zu 500 ml DPBS. Gut mischen, um NaCl und Vakuumfilter lösen, um zu sterilisieren. Erwärmen eines Aliquots der Passagierung Lösung in einem 37 ° C Wasserbad vor Passagierung.
  5. Um den Durchgang, absaugen verbrauchten Kulturmedium und wäscht die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von warmem passaging Lösung. Aspirate und Pipetten genug EDTA Passagierung Lösung zur Beschichtung der Zellen (1 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen).
  6. Legen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop und beobachten Sie die iPSC Kolonien. Das Auftreten von Löchern in Kolonien und hob Grenzen sollte deutlich werden innerhalb von 2 bis 5 Minuten.
  7. Sorgfältig absaugen EDTA Passagieren Lösung.
  8. Unter Verwendung einer 10 ml Pipette verzichtet 4 ml E8 Medium (bei Verwendung einer Platte mit 6 Vertiefungen) unter hohem Druck direkt in jeder Vertiefung passagiert werden.
  9. Sammeln Sie die iPSC Klumpen und aufgeteilt in eine entsprechende Anzahl von Vertiefungen in Abhängigkeit von der Split-Verhältnis von 1: 8 bis 1:12. Nicht zu pipettieren, als Aufgliederung der Zellklumpen zu einer schlechten Rentabilität führen.
  10. Die Platte wird in einem Brutkasten, und Rock die Platte hin und her und von Seite zu Seite mehrmals, um die Zellen zu dispergieren.

5. Herstellung von MEFs und iPS-Zellen für Tansfection

  1. 48 Stunden vor der transfection, Passage iPSCs bei ~ 1: 6 in vier oder mehr Vertiefungen einer Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte, so dass sie zu 70% konfluent 2 Tage damit sein.
  2. Am nächsten Tag auftauen DR4 MEFs in MEF Medium, das aus DMEM (hoher Glukose) mit 10% FBS und 1x MEM-NEAA ergänzt.
  3. Platte DR4 MEFs in zwei 10-cm-Schalen bei ~ 2 x 10 4 Zellen / cm 2 beimpft und über Nacht bei 37 ° C.
  4. Am Tag der Transfektion ändern MEF mittlere bis E8 mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt 30 Minuten vor der Durchführung der Transfektion auf iPS-Zellen.
  5. Optional: Wenn durchflusszytometrische Analyse von iPS-Zellen nach der Transfektion gewünscht ist, entfernen Sie einen Basalmembranmatrix beschichteten Platte von 4 ° C und bei Raumtemperatur.
  6. Optional: 4 h vor der Transfektion ergänzen vorge Transfektion iPSC Kultur Y-27632 in einer Endkonzentration von 10 uM.

6. Gentle-Zelle Dissoziation Reagenz Behandlung einnd Transfektion von iPS-Zellen mit einem Elektroporationssystem

  1. Entfernen P3 primären Zell Transfektionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen ~ 30 min. Fügen Sie die gesamte 100 ul Ergänzung zur Transfektion Lösung vor der Verwendung.
  2. Warm sanfte-Zelldissoziation Reagenz in einem 37 ° C Wasserbad.
  3. Erhalten AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) und AAVS1-CAG-EGFP Geber von -20 ° C.
  4. IPS-Zellen zu entfernen aus dem Inkubator und einmal mit DPBS waschen.
  5. 1 ml der sanfte-Zelldissoziation Reagenz pro Vertiefung und inkubieren iPS-Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis mehr als 50% der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert.
  6. Pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten ein paar Mal mit einer p1000-Pipette, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kulturgefäß zu distanzieren und zu brechen iPSC Klumpen.
  7. 2 ml E8 Medium in jede Vertiefung und Pipette auf und ab mehrmals mit einer 10 ml Pipette nach Fürther disaggregieren Zellklumpen in einzelne Zellen
    HINWEIS: Die Transfektionseffizienz sinkt deutlich, wenn Zellklumpen nicht ausreichend aufgeschlüsselt.
  8. Sammeln iPSCs in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 100 × g für 3 min.
  9. Überstand wird abgesaugt und die Zellen in einer minimalen Menge von E8 Medium.
  10. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach der Anwendung eines Vitalfarbstoffes wie 0,4% Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Zellen ausreichend dissoziiert beim Zählen (1-3 Zellen pro "Klumpen").
  11. Verzichtet werden 3 x 10 6 Zellen in jeweils zwei 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 100 × g für 3 min.
    HINWEIS: Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit reduziert die Zellstress und ermöglicht eine einfache Resuspension von iPS-Zellen vor der Elektroporation.
  12. Stellen Sie die Elektroporation System auf den Zelltyp-spezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 (Programm CB-150).
  13. Nach dem Zentrifugieren den Überstand aspirieren vom cell Pellets. Um ein Pellet, mit 10 ug des HR Spender als Kontrollprobe. Zu den weiteren Pellet hinzufügen 10 ug des HR Spender, zusammen mit 5 ug jedes TALEN (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) als Versuchsprobe.
  14. Resuspendieren jedes Zellpellet in 100 ul P3 primären Zell Transfektionslösung und übertragen in eine Küvette.
  15. Führen Sie die Transfektion und sofort fügen 500 ul Raumtemperatur E8 Medium zu jeder Küvette.
  16. Übertragen Sie die transfizierten iPSCs tropfenweise zu einer 10-cm-Schale mit DR4 MEFs in Schritt 5.4 vorbereitet.
  17. Optional: Fügen Sie einige Tropfen aus jedem Experiment in eine Vertiefung einer Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen, wenn Durchflusszytometrie anaylsis der Transfektionseffizienz gewünscht wird.
  18. Wiederholen Sie die Schritte von 6,15 bis 6,17, beide Proben zu beenden. Am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal und schalten Kulturmedium zu NutriStem, die iPSC Kultur auf Feeder unterstützt besser als E8 erscheint.
  19. TrAnsient EGFP-Expression Peaks bei 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion; beurteilen Transfektionseffizienz nach Wunsch.

7. Puromycin Auswahl der Targeted iPSCs

  1. Beginnen Puromycin-Selektion 72 Stunden nach der Transfektion, wenn die iPS-Zellen zu erreichen 70% Konfluenz.
  2. Für NCRM5 iPSCs beginnen Puromycin-Selektion bei 0,5 ug / ml Puromycin (1/2 der vollen Dosis) in NutriStem Kulturmedium verdünnt. Die optimale Puromycin Konzentration von 0,25 bis 1 & mgr; g / mIL einigen iPSC Linien variieren.
  3. Kultur iPS-Zellen in NutriStem + 0,5 ug / ml Puromycin für 3 Tage, erfrischend das Medium täglich.
  4. Nach 3 Tagen, erhöhen die Konzentration von Puromycin bis 1 ug / ml.
  5. Kultur iPS-Zellen unter 1 ug / ml Puromycin-Selektion für weitere 7 bis 8 Tage, oder bis deutliche Kolonien erscheinen groß genug für Kolonie Kommissionierung.

8. Kolonie Kommissionierung und Ausbau von gezielten iPSCs

  1. Verwenden BasalmembranMatrix zu beschichten, eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Dispensieren 50 ul Basalmembranmatrix Beschichtungslösung (2 mg Basalmembranmatrix in 12 ml DMEM / F12 verdünnt) in jede Vertiefung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht vor dem Gebrauch.
  2. Nachdem man die Basalmembranmatrix beschichteten Platte auf Raumtemperatur kommen, saugen Sie den Basalmembranmatrix zubereitet, und 100 & mgr; E8 mit 10 & mgr; Y-27632 in jede Vertiefung ergänzt.
  3. Ein inverses Mikroskop in einem biologischen Sicherheitsschrank und Spray leicht mit 70% EtOH zu sterilisieren.
  4. Ziehen Sie ein Glas Pasteur Pipette über einem Bunsenbrenner, eine ideale Kolonie-Picking-Tool, das einen kleinen "Haken" an der Spitze zu erhalten. Sterilisieren mit 70% EtOH, und legen Sie in der Haube, um zu trocknen.
  5. Entfernen Sie die Schale mit gezielten iPSC Kolonien aus dem Inkubator, und legen Sie in die Haube unter dem Mikroskop.
  6. Wählen iPSCs durch Verfolgung einen Kreis um die Kolonie Grenze der Kolonie-Picking-Tool.
  7. Verwenden Sie den "Haken" der Kolonie Kommissionierung Werkzeug vorsichtig abkratzen und entfernen Sie die iPSC Kolonie von der Oberfläche der Platte. Bei größeren Kolonien, Zeichnen eines X mit dem Kolonie-Picking-Tool zu Quartal die Kolonie wird das Zellwachstum nach erneuter Beschichtung zu erleichtern.
  8. Sobald Zellklumpen sind freistehend und frei schwebend, mit einem p200 Pipette eingestellt auf ~ 30 & mgr; l, um die iPS-Zellen zu sammeln. Plattenzellen direkt in die 96-Well-Platte.
  9. Optional: mit einem p20-Pipette, um ~ 5 & mgr; l eingestellt, um die iPS-Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, dann fügen Sie 50 ul sanft-Zelldissoziation Reagenz für 5 min bei 37 ° C verdaut. Nach der Verdauung, fügen Sie 500 ul E8 Medium in die Eppendorf-Röhrchen, um die sanfte-Zelldissoziation Reagenz verdünnen und Spin-down der Zellen bei 200 xg in einer Standardtischmikrozentrifuge 5 min. Dann saugen die meisten mittel- und verlassen ~ 30 & mgr; l zu resuspendieren und übertragen Sie die Zellen in 96-Well-Platte.
    HINWEIS: DieseAnsatz wird die Dissoziation des Zellklumpen und schnelle Expansion des abgeholt Kolonie zu erleichtern.
  10. Weiter Kolonieaufnahme bis eine ausreichende Anzahl von iPSC Kolonien wurden gesammelt (etwa 20-30 Kolonien pro Experiment wird empfohlen).
  11. Nach Kolonie Kommissionierung, legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Inkubator über Nacht. Aktualisieren mit kompletter E8 Medium am nächsten Tag, und Kultur, bis ~ 70% konfluent.
  12. Passage-Zellen aus dem 96-Loch in eine 24-Loch, dann in eine 6-Loch, wie in Schritten von 4,5 bis 4,10 beschrieben.
    HINWEIS: die Volumina der EDTA-Lösung und E8 Medium sollte bei der Verwendung von Brunnen kleiner als eine Platte mit 6 Vertiefungen entsprechend zu reduzieren.
  13. Beurteilen Sie Targeting den Erfolg von Anschluss PCR und Southern-Blot-Analyse, gezielte Kassette Integration und das Fehlen von nach dem Zufallsprinzip eingefügt Vektoren 16 zu bestätigen.

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Ergebnisse

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Eine Visualisierung des Protokolls ist in Abbildung 2, mit Zeiten, in denen iPS-Zellen sind in unterschiedlichen Medium entweder grün oder blau E8 für NutriStem hervorgehoben kultiviert. Es ist wichtig, nur hochwertige iPS-Zellen zu transfizieren; untersuchen Kulturschalen ganz routinemäßige Wartung und prüfen, ob iPS Kulturen enthalten hauptsächlich verschiedene Kolonien die mit einem Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie (3A); differenzierten Zellen sollten nicht mehr als 10% der Kul...

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Diskussion

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Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von AAVS1 Safe-Harbour gezielte menschlichen iPS-Zellen sind: (1) der effizienten Erbringung von TALEN und Donorplasmiden in iPS-Zellen durch Transfektion; (2) Optimierung der Dissoziation von iPS-Zellen in einzelne Zellen vor der Transfektion und Beschichtungs-Dichte nach der Transfektion; (3) Optimierung der Dosis und der Zeit der Medikamentenauswahl basierend auf dem Wachstum von iPSC Leitung; (4) sorgfältig seziert und Kommissionierung gezielte Kolonien und die...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde vom NIH Common Fund und dem Intramural Research Program des National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran-Matrix, *LDEV-frei, 10 mlCorning354230Bei -20 °C lagern.
DMEM/F-12Life Technologies11320-033Lagern bei 4 & Grad.
Costar 6 Well Clear TC-behandelte Multi-Well-PlattenCorning3506
Essential 8 MediumLife TechnologiesA1517001Basalmedium bei 4 °C lagern. Ergänzungsmittel bei -20 °C lagern.
Y-27632 DihydrochloridTocris1254Bei Raumtemperatur lagern. Nach dem Auflösen in H2O bei -20 °C lagern.
NatriumchloridSigmaS5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575-020
DPBS, kein Kalzium, kein MagnesiumLife Technologies14190-250 100
mm TC-behandelte KulturschaleCorning430167
DR4 MEF 2M IRR - AcademicGlobalStemGSC-6204GIn flüssigem Stickstoff lagern.
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatLife Technologies11995-040Bei 4 & Grad C lagern.
Definiertes fötales Rinderserum, US-UrsprungHyCloneSH30070.03Bei -20 °C lagern. Auftauen bei 4 °C; C über Nacht und aliquot. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C bis zur Nötigung.
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)Life Technologies11140-050Bei 4 μC lagern.
4D-Nukleofector Core Unit LonzaAAF-1001Bist Teil des Elektroporationssystems
4D-Nucleofector X Einheit LonzaAAF-1001XTeil des Elektroporationssystems
P3 Primärzelle 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)LonzaV4XP-3024Bei Ankunft die Primärzelllösung entfernen und ergänzen und bei 4 °C lagern.
StemPro Accutase ZelldissoziationsreagenzLife TechnologiesA1110501bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 4 °C auftauen; C und erwärmen Sie ein Aliquot in einem 37°; C Wasserbad vor Gebrauch.
NutriStem XF/FF NährmediumStemgent01-0005Bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 4 °C auftauen; C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 und pZT-AAVS1-R1)Addgene52637 und 52638<
AAVS1-CAG-EGFP Homologer RekombinationsspenderAddgene22212
Puromycin DihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Bei -20 μC lagern. Arbeitsaliquoten von 1 mg/ml in ddH2O vorbereiten.
Einweg-Pasteurpipetten aus BorosilikatglasFisher Scientific13-678-20A
Sorvall Legend XTR (gekühlt), 120 V 60 HzThermo Scientific75-004-521
TX-750 4 & 750 ml AusschwingrotorThermoScientific 75003607
Trypanblaue Lösung, 0,4%Life Technologies15250-061
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Referenzen

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