Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4 + CD45RB Hoch T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4⁺CD45RB^hohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Zusammenfassung

Es gibt viele verschiedene Tiermodelle zum Untersuchen der Pathogenese von menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile vorhanden. Wir beschreiben hier eine experimentelle Colitis-Modell, das durch adoptiven Transfer von syngenen Milz CD4 ⁺ CD45RB ^hoch -T-Zellen in T-und B-Zell-defizienten Mäusen Empfänger eingeleitet wird. Die CD4 ⁺ CD45RB ^hoch T-Zellpopulation, die größtenteils aus naiven Effektorzellen induzieren kann chronische Darmentzündung, sehr ähnlich wichtige Aspekte der menschlichen IBD. Dieses Verfahren kann manipuliert werden, um Aspekte der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu untersuchen. Zusätzlich kann es für die Funktion der angeborenen, adaptive und regulatorische Immunzellpopulationen, und die Rolle von Umweltfaktoren, das heißt, die Mikroflora im Darmentzündung zu untersuchen. In diesem Artikel erläutern wir die Methode zur Induzierung ulcerosa mit einer Schritt-für-Schritt-Protokoll. Diese includes eine Video-Demonstration der wichtigsten technischen Aspekte erforderlich, um diese Mausmodell der experimentellen Kolitis zu Forschungszwecken erfolgreich zu entwickeln.

Einleitung

Die entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn und Colitis ulcerosa resultieren aus einem unvollständig definierten und komplexen Zusammenspiel zwischen Immunantworten des Wirts, genetischer Anfälligkeit, Umweltfaktoren und dem enterischen luminalen Gehalt¹. Jüngste genomweite Assoziationsstudien berichten über Assoziationen zwischen regulatorischen Genen von Immunzellen und IBD-Anfälligkeit^2,3. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunzell-intrinsische Gene sind in diesen Studien vertreten, was auf eine zentrale Rolle dieser Zellpopulationen in der IBD-Pathogenese hinweist.

Es existieren derzeit mehr als 50 Tie....

Protokoll

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Tier Protokolle werden von und in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Vorschriften und der National Research Council Handbuch für die Pflege und Verwendung von Labortieren zugelassen. Spendermäusen kann entweder männlich oder weiblich ist, aber Empfängermäuse sollte männlich. Wenn weibliche Empfänger zu verwenden sind, müssen die Spendermäuse female ⁵ sein. Pflegen Kolonien regelmäßig, unsteril Betten und nicht angesäuerten Wasser mit, da diese die Darmflora auswirken, und damit die Colitis Phänotyp der Mäuse ^5,6.

1. Versuchsvorbe....

Ergebnisse

Ca. 10 x 10 ⁶ CD4 ⁺ CD45RB ^hoch -T-Zellen aus 10 Milz von erwachsenen C57BL / 6 Spendermäusen sind zuverlässig isoliert. Diese Anzahl wird in Abhängigkeit von dem Alter und dem Stamm des Spendermaus und dem Können des Forschers variiert. Beim 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 CD4 ⁺ CD45RB ^hoch -T-Zellen in C57BL / 6 Rag1 übertragen ^{- / -} Empfängermäuse, klinischen Anzeichen einer Krankheit entstehen rund 5 Wochen nach der Sättigung oder früher, wenn .......

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Induzieren Kolonentzündung in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T-Zellen in immundefizienten Mäusen. Wir verwendeten C57BL / 6 Spender Milz und syngenen Rag1 ^{- / -} Empfängermäuse, obwohl auch andere Stämme (zB BALB / c, 129S6 / SvEv, nicht-übergewichtigen diabetischen (NOD)) und genetische Modelle der Immunschwäche (zB SCID, Rag2 ^{- / -),} können ebenfalls verwendet werde.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes/ Ausrüstung	Firma	Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm Rundbodenröhrchen	Falcon	352052
15 ml konisch	Corning	430790
26 G x 3/8 Nadel	BD Biosciences	305110
50 ml konisch	Corning
70 μ m Zellsieb	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-Mercaptoethanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Complete Medium			RPMI-1640, 1% Stift/Streptometer, 10 % FBS, 0,0004 % β-ME
FACS Röhrchen + Sieb	BD Falcon	352235
Glasmikroskop-Objektträger	Fisherbrand	12550A3
Hitzeinaktiviertes FBS	Gemini	100-106
Markierungspuffer			1x PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA
Lysepuffer			0,08 % NH4Cl, 0,1 % KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Maus CD4 T Lymphozytenanreicherungsset - DM	BD Biosciences	558131
Maus IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
Maus IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
Pasteurpipette	Fisherbrand	13-678-20D
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Petrischale	Fisherbrand	875713
Reines Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Spritze	BD Biosciences	309597
Trypanblau	Corning Cellgro	25-900-CI
Waschmittel			RPMI-1640, 1 % Stift/Strepto, 0,0004 % β-ME