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Methodenartikel

Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen

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⸱

DOI:

10.3791/52538

⸱

18. Februar 2015

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Obwohl Candida-Infektionsmodelle zur Verfügung stehen, um die Immunresistenz des Wirts zu untersuchen, fehlt ein Modell zur Untersuchung der T-Zell-vermittelten Immunpathologie im Zusammenhang mit Candida-Infektionen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Etablierung der Th17-Immunpathologie, die mit einer oralen Candida-Infektion bei immundefizienten Mäusen assoziiert ist.

Zusammenfassung

Oropharyngeale Candidiasis (OPC) Krankheit wird nicht nur durch das Fehlen einer Immunresistenz des Wirts verursacht, sondern auch durch das Fehlen einer angemessenen Regulation der infektionsinduzierten Immunpathologie. Obwohl Th17-Zellen an der antimykotischen Abwehr beteiligt sind, ist ihre Rolle in der Immunpathologie unklar. In dieser Studie wird eine Methode zur Etablierung der oralen Th17-Immunpathologie im Zusammenhang mit einer oralen Candida-Infektion bei immundefizienten Mäusen vorgestellt. Die Methode basiert auf der Rekonstitution lymphopenischer Mäuse mit in vitro kultivierten Th17-Zellen, gefolgt von einer oralen Infektion mit Candida albicans (C. albicans). Die Ergebnisse zeigen, dass ungezügelte Th17-Zellen zu Entzündungen und Pathologien führen und mit mehreren messbaren Messwerten verbunden sind, einschließlich Gewichtsverlust, proinflammatorische Zytokinproduktion, Zungenhistopathologie und Mortalität, was zeigt, dass dieses Modell bei der Untersuchung der OPC-Immunpathologie wertvoll sein kann. Der adoptive Transfer regulatorischer Zellen (Tregs) kontrolliert und reduziert die Entzündungsreaktion, was zeigt, dass dieses Modell verwendet werden kann, um neue Strategien zu testen, um oralen Entzündungen entgegenzuwirken. Dieses Modell kann auch bei der Untersuchung der oralen Th17-Immunpathologie im Allgemeinen im Zusammenhang mit anderen oralen Erkrankungen anwendbar sein.

Einleitung

Orale Infektionen und Entzündungen wurden mit Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht und haben dramatische Auswirkungen auf die allgemeine menschliche Gesundheit2,3. Opportunistische Infektionen und Entzündungen, die durch C. albicans verursacht werden, sind assoziiert mit primären Immundefekten (PID)4,5, entzündlichen Erkrankungen wie Parodontitis 6,7, Sjögren-Syndrom und Speicheldrüsenerkrankungen8,9 sowie dem oralen Plattenepithelkarzinom 10-12. C. albicans ist ein dimorpher kommensaler Pilz, der den Mund von 60% der gesunden Menschen asymptomatisch besiedelt, aber er ist der häufigste Pilzerreger, der Infektionen verursacht, wenn die Wirtsabwehr geschwächt ist13-15. Es verursacht wiederkehrende und chronische Infektionen und Entzündungen bei Patienten mit AIDS und PID sowie bei anderen immungeschwächten Personen. Als Kommensal ist seine Besiedlungslast mit der Veränderung der Diversität des gesamten oralen Mikrobioms verbunden16. Als Erreger verursacht es verschiedene Formen der oropharyngealen Candidiasis wie akute pseudomembranöse, akute atrophische, chronisch atrophische, chronische hypertrophe/hyperplastische und eckige Cheilitis.

Der Schutz gegen C. albicans wird nicht nur durch die Immunresistenz des Wirts bestimmt, sondern auch durch die Fähigkeit, die Candida-induzierte Immunpathologie angemessen zu kontrollieren. Obwohl Kommensalen wie C. albicans zur Modulation und Verschlimmerung anderer oraler Entzündungszustände beitragen, sind die Mechanismen, durch die Dysbiosen bei opportunistischen Infektionen auftreten, unklar. Neben der bekannten Rolle adaptiver Th17-Zellen bei der Gedächtnisreaktion auf C. albicans17 bleibt ihre Rolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung der Entzündungspathologie bei chronischen Infektionen unklar. Darüber hinaus sind orale entzündliche Erkrankungen wie das Sjögren-Syndrom und die Parodontitis mit der Th17-vermittelten Pathologie assoziiert. Interessanterweise sind diese Erkrankungen auch stark mit häufigen OPC verbunden. Die Wechselwirkungen zwischen Th17-Zellen, der oralen Immunpathologie von OPC und anderen oralen Entzündungskrankheiten sind jedoch nicht untersucht.

Obwohl Mausmodelle für die primäre und sekundäre Infektion der oralen Candidiasis verfügbar sind, ist ein Mausmodell zur Untersuchung der Candida-Infektions-assoziierten Th17-Entzündung, insbesondere im Zusammenhang mit Immundefizienz, nicht verfügbar. In dieser Studie wird eine Methode zur Feststellung einer oralen Th17-Entzündung im Zusammenhang mit einer oralen Candida-Infektion bei Mäusen vorgestellt. Eine Candida-Infektion bei Mäusen ist gekennzeichnet durch Pilzläsionen, Entzündungen in der Zunge, verminderte Nahrungsaufnahme, Gewichtsverlust und schließlich einen sterbenden Zustand. Die orale Pathologie ähnelt chronischen Candida-Infektionsläsionen sowie epithelialer Dysplasie bei Maus-Mundkrebsmodellen12,18.

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Protokoll

HINWEIS: Die Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Tierschutzausschusses (IACUC) Richtlinien durchgeführt.

1. Reconstituting der Rag-1 - / - Mäuse, die mit I n vitro kultiviert Th17-Zellen (drei Tage vor der Infektion)

  1. Zum Herstellen Th17 Zellen, der Kultur CD4 + CD25- CD44low CD62Lhigh naiven T-Zellen (3 x 104) in U-Boden-Platten mit 96 Vertiefungen allein oder Cokultur sie zusammen mit 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg in Gegenwart löslicher α-CD3 (1 & mgr; g / ml), α-CD28 (2 ug / ml) Antikörper und Antigen-präsentierenden Zellen unter Bedingungen, Th17 (polarisiert mit IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) und α-IL-4 (2 & mgr; g / ml)) für drei bis vier Tage.
    HINWEIS: Naive Zellen und T regs wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung sortiert (FACS) eind magnetische Zellisolierungsverfahren und kultiviert wie zuvor 19 bis 22 beschrieben.
  2. Am Tag 4 nach Resuspendieren der Th17-Zellen mit der Pipette, sammeln sie aus Kulturen und zentrifugieren unter sterilen Bedingungen.
    1. Nehmen Sie eine kleine Teilmenge dieser Zellen, um ihre Lebensfähigkeit und zur Phänotypisierung zu untersuchen. Resuspendieren sie in 500 ul RPMI-Medium, fügen Propidiumiodid (200 ng / ml) und eine Bewertung ihrer Rentabilität sofort mittels Durchflusszytometrie. Führen Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie Beurteilung der IL-17A Produktion nach Restimulation (siehe Abschnitt 6.3).
  3. Zentrifuge und wäscht die Hauptmasse der Zellen in sterilem PBS bei 480 × g für 6 Minuten bei 4 ° C in allen Stufen, wenn nicht anders angegeben.
  4. Verwenden Sie diese Zellen für die adoptive Transfer in 6-8 Wochen alte CD45.2 Rag1 - / - immundefizienten Mäusen.
    1. Resuspendieren der Zellen in 1 x 10 7 Zellen / ml Zelldichte mit kaltem sterilem PBS.
    2. Injizieren 100 ul der Zellen durch intraperitoneal Injektion, unter Verwendung von 25 G Nadeln auf 1 ml Tuberkulin-Spritze, derart, dass eine Maus erhält 1 x 10 6 Zellen. Einige Mäuse PBS oder Th17 Zellen nur zu empfangen, und andere Mäuse Th17 Zellen, co-kultiviert mit Treg-Zellen wurden erhalten.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter aseptischen Bedingungen.

2. Wachsende C. albicans für eine Infektion (einen Tag vor der Infektion)

  1. Vor der Inokulation zerstreuen fünf Kolonien der CAF2-1 C. albicans Laborstamm in 100 ul sterilem PBS-Suspension, und fügen Sie die Suspension auf die sterile Brühe.
  2. Impfen 5 Kolonien der C albicans in 50 ml des Hefe-Stickstoff-Base (YNB ohne Aminosäuren) / Peptone / Dextrose-Broth-Medium und Inkubation in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C für 15-18 h bei 130 Umdrehungen pro Minute.
  3. Überwachen Sie die Brühe für Bewölkung, denn das ist ein Indiz für das Wachstum des Pilzes.

3. CandidaErnte und Counting-Verfahren (Am Tag der Infektion)

  1. Sammeln Sie 10 ml Candida Brühe in 15 ml Tuben. Für größere Volumina, sammeln Candida in 50 ml Tuben.
  2. Zentrifugieren Blastosporen bei 1900 × g für 5 min bei RT in allen Stufen, wenn nicht anders angegeben. Pellet die Blastosporen durch Zentrifugation, gefolgt von der Entfernung des Überstandes.
  3. Wenn es mehr als ein Rohr Vereinige die Candida Blastosporen aus mehreren Rohren, Zugabe von sterilem PBS auf die Pellets und Resuspendieren sie in 10 ml PBS für die Zählung.
  4. Nehmen Sie 20 ul Blastosporen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 20 ul der 2X Para und Inkubation bei Raumtemperatur für 15-20 min. Zählen Sie die Fest Blastosporen mit dem Hämozytometer unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist krebserregend. Öffnen Sie die unverdünnte Lösung nur im Abzug durchführen.
  5. In der Zwischenzeit wiederholt wenigstens zweimal Waschen der Blastosporen durch Zentrifugieren them in PBS, und Pelletieren der Blastosporen. Halten Sie die Pellets in 15-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur, in der ABSL1 Haube, bereit für die Infektion.
  6. Lassen Sie etwas sterilem PBS bei RT Resuspendieren der Blastosporen für eine Infektion.
  7. Nach dem Zählen hinzufügen sterilem PBS in die Blastospore Pellet um die Zellzahlen Hefe Blastospore bis 2 x10 8 von Hefezellen / ml einzustellen. Dies ist der Blastosporen Suspension, verwendet, um die Mäuse zu infizieren wird.
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter aseptischen Bedingungen.

4. Mäuse Infektion (3-5 Tage nach der Zellübertragung)

HINWEIS: Die Grund Infektion Verfahren durchgeführt wird, wie oben beschrieben, 19,23-25.

  1. Wiegen Sie die Rag-1 - / - Mäuse, die PBS oder die Zellen drei Tage zuvor erhalten.
  2. Berechnen Sie die Dosis des Narkosemitteln mit ihrem Körpergewicht. Anesthetize der Mäuse durch die Verabreichung von Ketamin / Xylazin-Mischung (16,1 mg / ml und 1,6 mg / ml), unter Verwendung von 25 G Nadeln auf 1 ml Tuberkulin-Spritze durch intraperitoneal Injektion.
    1. Gabe von 50 & mgr; l pro 10 g Körpergewicht. (Das heißt, 0,8 mg Ketamin und 0,08 mg Xylazin / 10 g Körpergewicht oder 80 mg Ketamin und 8 mg Xylazin pro kg Körpergewicht beziehungsweise). Beachten Sie für toe Prise Reaktion alle 15 min nach der Narkose.
      HINWEIS: Diese Dosis wird 60-90 min der Anästhesie, die genug für die Infektion Verfahren einzuleiten.
    2. Übernehmen Sie die Augen Schmiermittel Salbe in den Augen der Mäuse, die Hornhaut vor dem Austrocknen zu verhindern. Da das Auge Schmiermittel kann austrocknen, wiederholen Augen Schmierung alle 45 min.
  3. Injizieren 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan am Rücken benachbart dem Vorderbein zu Rehydration der Mäuse während der Anästhesie zu helfen.
  4. Besorgen Sie sich einen neuen, sauberen Käfig. Folgen Sie der Infektion Verfahren eine Maus zu einem Zeitpunkt, indem jede Maus in den neuen Käfig einmal infiziert. Führen Sie die PBS / Schein-Infektion zuerst, und dann auf die Candida-Infektion gro gehenups.
  5. Nehmen Sie den narkotisierten Maus und öffnen Sie den Mund weit auf, um die Basis der Zunge zeigen.
    1. Legen Sie eine 3 mm Durchmesser Wattebausch mit 50 ul PBS oder Blastospore Aussetzung gesättigten, sublingual in der Mundhöhle für 90 min. Drehen Sie die Mäuse alle 15 min vor und zurück zu Staulunge zu vermeiden, sicherstellen, dass die Watte nicht zu bewegen.
  6. Einrichten eines Zeitgebers für jede Maus 90 Minuten von Sham oder Candida Inokulation in der Mundhöhle zu gewährleisten.
  7. Halten Sie sie in einem Käfig unter der Wärmelampe (4 Meter), und jede Maus auf Hitze Gel-Pads.
  8. Stellen Sie sicher, dass die Zunge in und von den Zähnen zurückgezogen, um die Zähne zerreißt die Zunge zu vermeiden.
  9. Am Ende der 90 Minuten, entfernen Sie den Wattebausch aus dem Mund der Maus. Sehen Sie für jede Maus, die aus der Narkose erholen kann früher als 75 Minuten. In einem solchen Fall zu betäuben sie wieder mit Ketamin (40 mg / kg) allein.

5. Beitrag procedure Monitoring (während der 90 Minuten Anästhesie)

  1. Verwenden Sie Hitze Gel-Pads während der 90 Minuten Narkose.
    1. Um die Körpertemperatur zu halten und zum Ersticken zu vermeiden, darf nicht zulassen, dass Mäuse, um auf den regulären Maiskolben Maus Betten erholen.
  2. Nach der Erholung von der Anästhesie verabreichen zusätzliche 1 ml steriler 0,9% NaCl subkutan an zwei Stellen auf der Rückseite.
  3. Bleiben Sie auf dem fünf PBS (Schein) geimpft Mäusen pro Käfig. Haus nur 1-2 infizierten Mäusen pro Käfig.
  4. Füllen Sie das Verfahren Karte mit Initialen jeden Tag nach dem Eingriff zu notieren, die Veränderungen im Körpergewicht, Körperpflege Gewohnheiten und die allgemeine Gesundheit.

6. Die Beurteilung der Entzündung

6.1) Gewichtsverlust

  1. Wiegen Sie die Mäuse jeden Tag während der Infektion, beginnend am Tag vor der Infektion Verfahren.
    HINWEIS: In der Regel werden die immundefizienten Mäuse mit Th17 Zellen und ohne T regs injiziert erliegen 20-30% Gewichtsverlust aufgrund erhöhter Pilzbelastung 19 und verschlimmert die Entzündung.

6.2) Histologie Scoring der Zunge

  1. Opfern die Mäuse durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte.
  2. Die Backen öffnen und sezieren die Zunge mit einer Schere und Pinzette. Verwenden stumpfen Pinzette, um den Mund zu halten und mit der Schere erreichen, um den hinteren Teil des Mundes, um das hintere Ende der Zunge einzuschneiden.
  3. Für immunzytochemische Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung der Zunge Gewebe, spülen Sie die Zunge Gewebe mit eiskaltem PBS. 5 ml 10% Formalin für 2-3 Zungen und befestigen Sie O / N in 15 ml Tuben.
    1. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Formalin und tauchen das Gewebe in 5 ml 70% Ethanol, um hyper-Fixierung zu verhindern. Senden Sie sie aus, um kommerziellen Dienst und Paraffineinbettung weiter, Schneiden und Färben von Paraffinschnitten.
      HINWEIS: Kommerzielle Histologie Service wird verwendet, um diese Schritte durchführen.
  4. Sobald die Dias aus dem Handels Histologie Service zurück, Grad der Entzündung durch die Beobachtung der Gewebeschnitte unter einem Lichtmikroskop.
    1. Score von 0 bis 5, wobei 0 keine Entzündung und 5 die schwerste Entzündungen. Ergebnis der Entzündung mit Tabelle 1.

6.3) Zytokin-Produktion von Th17-Zellen

HINWEIS: Übermäßiger TNF-α Produktion ist eine der Ablesungen für eine übermäßige Immunpathologie. Wenn Mäuse adoptiv mit Th17 Zellen nur übertragen, verursacht es Immunpathologie, die mit übermäßiger TNF-α-Produktion in Th17-Zellen assoziiert ist.

  1. Sammeln Sie eine Einzelzellsuspension aus Milz, Lymphknoten, axillären Lymphknoten, und der Zunge, mit zuvor beschriebenen Verfahren 19,26.
  2. Restimulieren der Zellen mit Phorbolmyristatacetat (PMA) (50 ng / ml) und Ionomycin (500 ng / ml) für 4 h mit Brefeldin A (10 ug / ml) in der l hinzugefügtast 2 Std. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit einem handelsüblichen Fixierung / Permeabilisierung Kit gemäß Herstellerangaben.
  3. Führen intrazelluläre Cytokin Färbung mit dem Fluorochrom konjugierten anti-TNF-α, Anti-IL-17A und ROR & ggr; t-Antikörper wie zuvor beschrieben 19.
  4. Kurz gesagt, die Zellen werden in dem 1X Permeabilisierung Puffer mit dem Cocktail von Anti-TNF-α, Anti-IL-17A und ROR & ggr; t-Antikörper, jedes Antikörpers mit einem 2 - 3 ug / ml Endkonzentration.
  5. Inkubieren der Zellen für 1 h bei RT.
  6. Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen mit 1X Permeabilisierung Puffer.
  7. Zellpellet in 500 ul PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin für die Durchflußzytometrie-Analyse.

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Ergebnisse

In diesem Modell werden sowohl die Candida infizierten Mäusen und nicht-infizierte Mäuse in Rag-1 - / - immundefizienten Hintergrund wurden adoptiv mit Th17 Zellen 3-5 Tage vor der Infektion übertragen. Insgesamt 10-12 Mäuse wurden für die Experimente verwendet, mit 2 Mäuse in jeder Sham infizierten Gruppen und 4-5 in jedem der Candida infizierten Gruppen. Naive Zellen wurden von kongenen Thy1.1 oder CD45.1 Mäusen stammten, damit injiziert Th17 Zellen wurden in vivo unter Verwendung...

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Diskussion

Dieses Modell basiert auf Induktion von oraler C basiert albicans-Infektion abhängig Th17 Entzündung. Wegen der Abwesenheit von regulatorischen T ist die Th17 Zelle induzierte Entzündung ungebremst und führt zu schlecht aufgelöst Immunpathologie. In vitro abgeleitet naiven CD4-Zellen polarisiert Th17 Zellen wurden für die adoptive Übertragung verwendet. 40 bis 50% des gezüchteten CD4 + Zellen zeigen nachweisbare IL-17A-Expression um Tag 3 (Th17-Zellen), und wurden daher für die Inje...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Helene Bernstein für den Zugang zu ihrem Durchflusszytometer. Wir danken auch der CFAR-Durchflusszytometrie-Einrichtung für die durchflusszytometrischen Dienstleistungen. Dieses Projekt wurde teilweise durch die CTSC-Kernnutzungsfinanzierung und den Zuschuss der STERIS Corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases an PP unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CAF-2Universität von Pittsburgh (Sarah Gaffen)-Candida-Kultur
U-Boden 96 Well-Platten Fisher055588Wird für die Zellkultur
von a-CD3 eBiosciences16-0031-85Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen
a-CD28 eBiosciences16-0281-85Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen
m-IL-6Bio BasicRC232Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen
h-TGF-b Forschung & Forschung D240-BPolarisation der Zellen auf Th17-Bedingungen
a-IFN-g eBiosciences16-7311-85Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen
a-IL-4 eBiosciences16-7041-85Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen
α-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82Für Zellkulturen - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41Für Zellkulturen - 1:100
α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82Wird für Zellkulturen verwendet - 1:50
YNB ohne Aminosäuren)/Pepton/Dextrose-Bouillon Medium Bio BasicS507. GRÖSSEMediium für das Candida-Wachstum
Shaker-Inkubator New Brunswick ScientificInnova 4300Inkubationswachstum für Candida
15 ml RöhrchenBio BasicBT888-SYFür Zellkulturen und Candida-Wachstum
50 ml RöhrchenBio BasicCT 788-YSFür Zellkulturen und Candida-Wachstum
TischzentrifugeVWR International LLC82017-654Für die Pelletierung von Candida -900 g
Allegra ZentrifugeBeckman Coulter392302Zellkultur - 480 g
1,5 ml Eppendorf-RöhrchenBio BasicBT620-NSVorbereitung der Endkonzentration von Candida
2x ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences15710Fixierung von Candida für die Zählung
HämozytometerVWR International LLC15170-172Zählzellen
PBS - Phosphatgepufferte KochsalzlösungBio BasicPD8117Zubereitung von Puffern
Ketamin/Xylazin  Case Western Reserve University - Animal Resource Center-Gewonnen aus dem von ARC genehmigten Protokoll für die Anästhesie
Ophthalmic Lubricant Salbe Allergan-Augensalbe für Tiere zur Vorbeugung von Trockenheit
Kochsalzlösung (0,9 % NaCl)G Biosciences786-561Verabreichung an Tiere zur Vorbeugung von Austrocknung
Wattebausch mit 3 mm Durchmesser VWR International LLCBP76033 mm Kugeln für Candida-Infektionen
Wärmegel-PadsCase Western Reserve University - Animal Resource Center-zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und schnelle Genesung
Hämatoxylin- und Eosin-FärbungHistoserv -MD-Gewebehistologie
10% Formalin ElektronenmikroskopieWissenschaften JC1111/MCGewebehistologie
70% Ethanol VWR International LLC97064-490Sterilisationszweck
PMA - Phorbol 12-Myristat 13-acetatSigma-AldrichP1585-1MGRestimulation von Zellen
IonomycinLife Technologies124222 1mgRestimulation von Zellen
FixierungspermeabilisierungskiteBiosciencesE16913-106Fixierung von Zellen für die Durchflusszytometrie
TuberkulinspritzenBD Biosciences309659Mäuseinjektion
25 G x 3/8 NadelnBD Biosciences309626Mäuseinjektion
Rag1 -/- MäuseJackson LaboratorienBest.-Nr.: 002216Empfängermäuse
CD45.1 kongene MäuseJackson Laboratorien Best.-Nr.: 002014 Spender von Th17-Zellen
CB17-SCID-MäuseJackson LaboratoriesStock-Nr.: 001303Empfängermäuse
Balb/c MäuseJackson LaboratoriesStock-Nr.: 000651Spender Th17-Zellen

Referenzen

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Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen
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