Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

10.5K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/52539

⸱

28. Mai 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Zusammenfassung

Gene Targeting ist ein kritischer Ansatz zur Charakterisierung von Genfunktionen in der modernen biomedizinischen Forschung. Allerdings ist die Effizienz des Gen-Targeting in menschlichen Zellen ist gering, was die Herstellung von humanen Zelllinien mit einer gewünschten Geschwindigkeit verhindert. Die letzten zwei Jahre haben eine schnelle Progression auf die Verbesserung der Effizienz der genetischen Manipulation von Genom-Editing-Tools wie dem CRISPR (Clustered regelmäßig beabstandet Short Palindromic Repeats) / CAS (CRISPR-assoziierten) System erlebt. Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von linienspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reportern mit CRISPR / Cas-System unterstützt die homologe Rekombination. Verfahren für den Erhalt notwendigen Komponenten für die Herstellung von neuralen Abstammung Reporter Linien mit dem CRISPR / Cas-System, die sich auf Bau von Targeting-Vektoren und einzelne Führungs RNAs, werden beschrieben. Dieses Protokoll kann zu Plattform Einrichtung und Mutation Korrektur in hiPSCs verlängert werden.

Einleitung

CRISPR (Clustered regelmäßig beabstandet Short Palindromic Repeats) / CAS (CRISPR-assoziierten) System, zusammen mit anderen Genom-Editing-Tools, hat das menschliche Genom Manipulation in den letzten Jahren 1-7 revolutioniert. Hauptkomponenten in der CRISPR / Cas9 System sind einzelne Führungs RNA (sgRNA) und Cas9. Cas9 ist ein RNA-geführten Typ-II-DNA-Endonuklease. Es hat zwei Nuklease Domänen HNH und RuvC, die neben einer protospacer benachbarten Motiv für die Herstellung von DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) zu einem bestimmten genomischen Region verantwortlich sind (PAM) 7-10 .Ein sgRNA hat eine kombinierte Funktion derjenigen crRNA und tracrRNA, zwei adaptive in Bakterien (wie Streptococcus pyogenes) und Archaeen identifiziert Immunität RNA-Moleküle, gegen DNA Invasion von exogenen Quellen 9-11 kämpfen. Bei entsprechend gestalteten und auf Säugerzellen co-eingeführt erkennt der sgRNA die PAM-Sequenz, Basenpaare mit dem komplementären Strang der Ziel-DNA, und Führungen und transaktiviert Cas9 abzuspaltenan beiden DNA-Stränge unmittelbar stromauf von PAM 7. Anschließend homologen Rekombination (HDR, in Gegenwart eines Targeting-Vektors) oder nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) auftreten wird, um die Doppelstrangbrüche zu reparieren. Transgene, wie beispielsweise cDNAs, Reporterkassetten oder Antibiotika-resistente Fragmente können integriert werden, und transgene oder knockin Linien.

Obwohl die CRISPR / Cas9 System ist sehr effizient und relativ spezifisch, unerwünschte Off-Target Aktivitäten wurden berichtet 12-15. Um Off-Target-Ereignisse zu minimieren, haben Cas9 nickases (Cas9n) auch ausgeführt worden, 9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A oder Cas9 H840A) ist Cas9 Enzym mit Mutationen in einem der zwei Nuklease Domänen, die nur löst eine nick an einem DNA-Strang. Zur Spaltung an beiden Strängen zu erzielen, werden zwei sgRNAs gestaltet, um ein Paar nickases, die separat an den nahe gelegenen Orte der zwei verschiedenen DNA-Stränge schneidet führen. Die "Doppel Nicking" Strategie erfordert eine more strengen Design als die herkömmliche Cas9 Plattform und bietet sowohl eine hohe Effizienz und eine hohe Spezifität für die Gen-Bearbeitungs Experimenten.

Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von linienspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reporter mit CRISPR / Cas-System unterstützt die homologe Rekombination. Schritte zur Erlangung der erforderlichen Komponenten für die Herstellung von neuralen Abstammung Reporter Linien mit dem CRISPR / System vermittelt Cas Genom Bearbeitung beschrieben, mit einem Fokus auf Bau von Targeting-Vektoren und sgRNAs. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in mehreren hiPSC Leitungen einschließlich von gesunden Personen und von Patienten mit Erkrankungen des ZNS abgeleitet wiederholt. Gene, die in unserem Labor gezielt gehören OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 und SOD1. Targeting-Effizienz von CRISPR / Cas System vermittelte homologe Rekombination in hiPSCs im Bereich von 20-40%, was mit früheren Berichten 1,18,19 ist. Im Vergleich zu einem typical Effizienz von 1-2% in konventionellen Gen-Targeting-Experimente wird das Targeting-Effizienz deutlich verbessert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Design und Vektorkonstruktion für das Targeting von Vektoren

  1. Sobald der linienspezifische Marker bestimmt ist, lokalisieren Sie die genomische Sequenz des Gens und gestalten Sie die Homologiearme entsprechend. Die Länge des 5'-Homologiearms beträgt ~1 kb und die des 3'-Homologiearms ~1,5 kb (Abbildung 1).
  2. Die Reporterkassette wird sequenziell stromabwärts der genomischen Sequenz direkt vor dem Stoppcodon durch Subklonierung markiert, so dass die endogene Expression nicht verändert oder gestört wird. Verknüpfen Sie den Reporter oder die Dual-Reporterkassette(n) mit selbstspaltenden 2A-Peptidsequenzen (F2A, E2A oder T2A) 20,21 oder der internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES).
    Hinweis: Zu den Reportern gehören fluoreszierende Proteine wie GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, Luciferase oder Antibiotikaresistenzkassette, eine Kombination aus fluoreszierendem Protein und Antibiotikaresistenzkassette. In Abbildung 1 ist ein Beispiel für die Konstruktion eines Targeting-Vektors für das menschliche ALDH1L1 Gen dargestellt, das mit EGFP und Neomycin-Resistenzkassette markiert ist.
  3. Fügen Sie dem Reporter eine Positivauswahlkassette nach. Bei der positiven Selektion handelt es sich um eine floxierte antibiotikaresistente Kassette, die aus den Ziel-iPSCs herausgeschnitten wird, nachdem die positiven Klone ausgewählt und isoliert wurden.
  4. Fügen Sie eine Negativ-Selektionskassette außerhalb des 3'-Homologiearms ein. Gängige Kassetten mit negativer Selektion sind Thymidinkinase, TK und Diphtherietoxin A (DTA) 22.
  5. Erhalten Sie einen humanen BAC-Klon, der die Sequenz des Abstammungsmarkers enthält, und verifizieren Sie den Klon durch PCR-Amplifikation. Konstruiert den Zielvektor in pKD46, der DH5α enthält, unter Verwendung von Rekombinierung, um die Zielstelle 23 nach unten zu ziehen. Wenden Sie bei Bedarf Multisite-Gateway, Golden-Gate-Strategien23,24 an.

2. Design und Vektorkonstruktion von sgRNAs für das CRISPR/Cas9-System.

  1. Bestimmen Sie den herkunftsspezifischen Marker, der zum Reporter gemacht werden soll. Kopieren Sie die cDNA-Sequenz aus der NCBI-Datenbank. Gehen Sie zur menschlichen BLOB-Suche, um die genomische DNA-Ausrichtung zu erhalten.
  2. Klicken Sie auf den Reiter "Browser", um den Aufbau des Gens zu sehen. Klicken Sie auf der Registerkarte "Ansicht" auf "DNA", um die vollständige genomische DNA-Sequenz im FASTA-Format zu erhalten.
  3. Lokalisieren Sie das Stoppcodon innerhalb der DNA-Sequenz, wo die 2A-Sequenz und die Reporterkassette markiert werden.
  4. Suchen Sie nach dem Protospacer-Nachbarmotiv (PAM, d.h. NGG) innerhalb der Vinizität (~100 bp Flankenfläche) des Stoppcodons. Scannen Sie beide Stränge, um die entsprechende NGG-Sequenz zu finden. Berücksichtigen Sie die Spezifität der Upstream-Sequenzen, um potenzielle Off-Target-Ereignisse zu vermeiden. Verwenden Sie Open-Source-Tools wie BLAST und CasOT (siehe Schritt 5 für Details).
  5. Kopieren Sie die Sequenz von 20 Basen unmittelbar stromaufwärts von NGG und fügen Sie sie in das Webdesign-Tool ZiFit ein, um Oligos mit Überhängen zu entwerfen, die mit dem human-gRNA-Expressionsvektor (mit dem U6-Promotor) MLM3636 kompatibel sind.
  6. Synthetisieren Sie sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-Oligos 7.
  7. Um doppelsträngige sgRNA herzustellen, denaturieren Sie beide Oligos 15 Minuten lang bei 70 °C und kühlen Sie allmählich auf RT ab. Für eine 50-μl-Reaktion fügen Sie jeweils 22,5 μl Forward- und Reverse-Oligos (Stammkonzentration beträgt 0,1 mM) und 5 μl Annealing-Puffer (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0) hinzu.
  8. Die aus Schritt 2.7 erhaltenen Oligos werden mit einem BsmBI-verdauten human-gRNA-Expressionsvektor (mit U6-Promotor) MLM3636 gemischt und ligiert. Für eine 20-μl-Reaktion fügen Sie 1 μl Oligos aus Schritt 2.7, 100 ng MLM3636 und 1 μl (400 E) T4-Ligase hinzu. Inkubieren bei RT O/N.
  9. Transformieren Sie DH5α-kompetente Zellen mit dem Ligationsprodukt durch Hitzeschock bei 42°C für 30 Sekunden. Züchten Sie die Bakterien in LB-Agar-Ampicillin-Platte (100 μg/ml) bei 37°C O/N. Entnehmen Sie 3~5 Kolonien für Plasmid-Miniprep gemäß dem Protokoll des Herstellers. Sequenzieren Sie die Plasmid-DNA, um dies mit kommerziellen Anbietern zu bestätigen. Maxiprep das richtige Plasmid gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  10. Bewerten Sie die sgRNA mit einem T7-Endonuklease 1 (T7E1)-Assay (siehe Schritt 4 für Details). Transfizierte hiPSCs mit dem Plasmid und der sgRNA werden unter dem eingebauten U6-Promotor im MLM3636 Rückgrat exprimiert (siehe Schritt 6 für Details).

3. Design und Konstruktion der Cas9n Doppel-Nickase sgRNA

  1. Erhalten Sie den doppelten Nickase-Cas9n-D10A-Vektor pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
  2. Entwerfen Sie ein Paar von Vorwärts- und Rückwärts-Oligos für jeden Ziellocus. Kopieren Sie die Sequenz von 20 Basen unmittelbar vor NGG, wie in Schritt 2 beschrieben, und fügen Sie sie in das Webdesign-Tool ZiFit ein
  3. Um Oligos mit Überhängen zu erhalten, die mit pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) kompatibel sind, entfernen Sie die erste und letzte Basis von Vorwärts- und Rückwärts-Oligos, die vom ZiFit-Designwerkzeug angezeigt werden.
  4. Synthese von Vorwärts- und Rückwärts-Oligos7. Benennen Sie diese Oligos als f(n)-F, f(n)-R für PAMs auf der einen Seite der Zielstelle, r(n)-F, r(n)-R für PAMs auf der anderen Seite der Zielstelle. Von diesen ist n die Zahl, um verschiedene PAMs zu bezeichnen, die Kleinbuchstaben f und r stellen die Position der PAMs entweder am Sense- (f) oder Antisense-Strang (r) dar, F und R stellen Forward- und Reverse-Oligos dar.
    1. Testen Sie mehrere Paare (z. B. r5 und f2) mit dem T7E1-Assay (detailliert in Schritt 4), um das optimierte Paar von sgRNAs zu identifizieren, das für Cas9n verwendet werden soll.
  5. Um doppelsträngige sgRNA herzustellen, denaturieren Sie beide Oligos 15 Minuten lang bei 70 °C und kühlen Sie allmählich auf RT ab. Für eine 50-μl-Reaktion fügen Sie jeweils 22,5 μl Forward- und Reverse-Oligos (Stammkonzentration beträgt 0,1 mM) und 5 μl Annealing-Puffer (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0) hinzu.
  6. Die in Schritt 3.5 erhaltenen Oligos werden mit BbsI-aufgeschlossenem pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) gemischt und ligiert. Für eine 20-μl-Reaktion fügen Sie 1 μl sgRNA aus Schritt 3.5, 100 ng Cas9n (D10A) und 1 μl (400 U) T4-Ligase hinzu. Inkubieren bei RT O/N.
  7. Transformieren Sie DH5α-kompetente Zellen mit dem Ligationsprodukt durch Hitzeschock bei 42 °C für 30 Sekunden. Züchten Sie die Bakterien in LB-Agar-Ampicillin-Platte (100 μg/ml) bei 37 °C O/N. Entnehmen Sie 3~5 Kolonien für Plasmid-Miniprep gemäß dem Protokoll des Herstellers. Sequenzieren Sie die Plasmid-DNA, um dies mit kommerziellen Anbietern zu bestätigen. Maxiprep das richtige Plasmid gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  8. Bewerten Sie die sgRNA mit einem T7E1-Assay (siehe Schritt 4 für Details). Die transfektive hiPSC mit dem Plasmid und der sgRNA wird unter dem eingebauten U6-Promotor im Cas9n (D10A)-Rückgrat exprimiert (siehe Schritt 6 für Details).

4. Bewertung von sgRNAs mittels T7 Endonuclease1 (T7E1) Assay

  1. Für eine 24-Well-Platte 2 x 105 293FT-Zellen pro Well einen Tag zuvor (Tag -1) plädieren.
  2. Am Tag der Transfektion (Tag 0) co-transfiziert 293FT-Zellen mit dem sgRNA-Plasmid und dem Cas9-Expressionsvektor. Fügen Sie 0,5 μg sgRNA-Vektor, 0,5 μg Cas9-Expressionsvektor JDS246 (Cas9-003) und 1,5 μl Lipofectamine 2000 hinzu.
    1. Für die Negativkontrolle fügen Sie 0,5 μg GFP-Expressionsvektor (z. B. CMV-Promotor-getriebenes GFP in einem pcDNA3-Rückgrat) anstelle von sgRNA-Vektoren hinzu.
  3. Nach 72 Stunden (Tag 3) entnehmen Sie die Zellen, indem Sie 100 μl DNA-Schnellextraktionspuffer hinzufügen und kräftig verreiben.
  4. Die Mischung 15 min lang bei 68 °C und dann 8 min lang bei 95 °C inkubieren. Dies ist die Vorlage für die nachfolgenden PCR-Experimente.
  5. Entwerfen Sie sowohl Forward- als auch Reverse-PCR-Primer, um die Sequenz zu amplifizieren, die PAM flankiert. In der Regel ist das Targeting-PCR-Produkt etwa 400-500 bp lang. Synthetisieren Sie die Oligos7.
  6. Für eine PCR-Reaktion von 50 μl fügen Sie 1 μl Template aus Schritt 4.5, 0,5 μl Herculase II, 0,5 μl DMSO, 10 μl 5x Puffer, 0,5 μl dNTP-Mix und 1 μl Forward- und Reverse-Primer-Mix hinzu.
  7. Verwenden Sie die folgenden PCR-Parameter: 98 °C für 2 min, 35 Zyklen à 98 °C für 20 Sekunden, 59 °C für 20 Sekunden, 72 °C für 1 min, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 min.
    Hinweis: Die hier beschriebenen PCR-Parameter ergeben spezifische Produkte für mehrere getestete Gene. Diese Bedingungen hängen jedoch von den vom Benutzer ausgewählten Genen ab. PCRs, bei denen genomische DNA als Template verwendet wird, müssen oft optimiert werden, um sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Banden auftreten. Diese zusätzlichen Banden können mit Spaltprodukten nach dem T7E1-Assay verwechselt werden.
  8. Messen Sie die DNA-Konzentration der PCR-Produkte mit einem Spektrometer an A260.
  9. 400 ng PCR-Produkte zu 2 μl Aufschlusspuffer 2 geben. ddH2O bis zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 19 μl zugeben. 5 min in kochendem Wasser inkubieren. Lassen Sie die Reaktion auf der Bank ruhen und kühlen Sie auf natürliche Weise auf RT ab (45-60 min).
  10. 1 μl (10 Einheiten/μl) T7E1 zugeben, 15 min bei 37 °C inkubieren. Die Reaktion durch Zugabe von 2 μl 0,25 M EDTA gemischt mit 6x DNA Loading Dye stoppen.
  11. Löse 2,5 g Agarosepulver in 100 ml 1xTAE auf. Die Mischung in der Mikrowelle erhitzen und das Gel auf eine Gelbox gießen. Wenn das Gel gebildet ist, laden Sie die gesamte 20 μl Reaktion auf das 2,5%ige Agarosegel. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 100-150 V laufen.
  12. Untersuchen Sie das Gel unter UV-Licht (Abbildung 3). T7E1 schneidet an den nicht übereinstimmenden Stellen. Bei sgRNAs, die eine nicht-homologe Endverbindung verursacht haben, weisen die PCR-Produkte im Vergleich zur Negativkontrolle (beschrieben in Schritt 4.3) zusätzliche schnell migrierende Banden (kleiner in der Größe) auf.
  13. Schätzen und ordnen Sie die sgRNA-Schneideffizienz sowie den Insertions- und Deletionsprozentsatz (indel%) ein, indem Sie die Bandendichte mit der Image J-Software vergleichen.
    1. Für jede Probe, die auf dem Gel verläuft, werden die Gelbanden als ungeschnittene Bande bezeichnet, Bande 1 und Bande 2 geschnitten.
    2. Messen Sie die Dichte jedes Bandes mit ImageJ gemäß dem Softwarehandbuch.
    3. Berechnen Sie denf-Schnitt mit der folgenden Formel:f-Schnitt = (Schnittband 1 + Schnittband 2) / (ungeschnittenes Band + Schnittband 1 + Schnittband 2)
    4. Berechnen Sie Indel% mit der folgenden Formel: Indel=1- √(1-f-Schnitt).

5. In-silico-Vorhersage potenzieller Off-Target-Standorte

Hinweis: Potentielle Off-Target-Sites können mit einem Online-Open-Source-Tool namens CasOT17 vorhergesagt werden, das ein Perl-basiertes Programm ist.

  1. Für ein Windows-System laden Sie das CasOT-Programm und die Dateien der Humangenomdatenbank auf die lokale Festplatte herunter.
  2. Bereiten Sie die Zieldatei der entworfenen sgRNA im FASTA-Format vor.
  3. Öffnen Sie die Datei mit dem Namen "casot". Ein Befehlsfenster wird angezeigt. Lassen Sie es vorerst so, wie es ist.
  4. Öffnen Sie die Datei mit dem Namen "opt-generator", um eine Optionszeichenfolge zu generieren. Fügen Sie den Pfad und den Namen der Zieldatei in den Dialog der Option "-t" oder "-target" ein.
  5. Fügen Sie den Pfad der Genomsequenzdatei in den Dialog der Option "-g" oder "-genom" ein.
  6. Eingabewerte von –s oder –seed (Standardwert ist 2) und –n oder -nonseed (Standardwert ist 255). Die Optionszeichenfolge wird generiert und im Feld oben auf der Seite angezeigt.
  7. Kopieren Sie den Optionsstring und fügen Sie ihn in das CasOT-Befehlsfenster ein, das in Schritt 5.3.
    beschrieben wurde. Hinweis: Es kann 30-90 Minuten dauern, bis das CasOT-Programm ausgeführt wird, abhängig von den Optionen und dem verwendeten Computer. Nach Abschluss des Vorgangs wird ein Ordner mit dem Namen "--" generiert. Der Ordner enthält zwei Dateien, eine ".stat"-Datei, die die Statistiken beschreibt, und eine .csv-Datei (durch Kommas getrennte Werte), die die detaillierten Suchergebnisse enthält.
  8. Öffnen Sie die .csv Datei mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Die folgenden Informationen werden in der Datei für jede Off-Target-Stelle bereitgestellt: chromosomale und genomische Lokalisation, Sequenz der Lokalisation, Mismatch-Typ (Mm), Gesamtzahl der nicht übereinstimmenden Basen und Exon-Informationen in Bezug auf die Off-Target-Site.
  9. Entwerfen Sie PCR-Primer für die Stellen, die <2 Mm in der Seed- oder Nicht-Seed-Sequenz aufweisen.
  10. Führen Sie die PCR für ausgewählte positive hiPSC-Klone unter den folgenden Bedingungen durch: 98 °C für 2 Minuten, 35 Zyklen von 98 ΰC für 20 Sekunden, 59 °C für 20 Sekunden, 72 °C für 1 Minute, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten< br /> Hinweis: Die hier beschriebenen PCR-Parameter ergeben spezifische Produkte für mehrere Gene, die in unserem Labor getestet wurden. Diese Bedingungen hängen jedoch von den vom Benutzer ausgewählten Genen ab. PCRs, bei denen genomische DNA als Template verwendet wird, müssen oft optimiert werden, um sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Banden auftreten.
  11. Sequenzieren Sie die PCR-Produkte, gleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit den vorhergesagten Sequenzen ab und suchen Sie nach Mutationen. Wenn Mutationen vorhanden sind, werden Off-Target-Ereignisse identifiziert.

6. Elektroporation von hiPSCs zur Herstellung von Reportern der neuronalen Linie

  1. Kultivieren Sie hiPS-Zellen in TeSR-E8-Medium auf Geltrex-beschichteten Schalen. Wechseln Sie das Medium zwei Tage vor der Elektroporation auf MEF-CM (Mouse embryonic fibroblasts conditioned medium). Inkubieren Sie 5 Minuten lang in 2 ml Accutase und sammeln Sie Zellen.
  2. Elektroporatisieren Sie hiPSCs mit linearisiertem Targeting-Vektor, Cas9-003-Expressionsvektor und sgRNA-Vektor unter folgenden Bedingungen: 1 x 107 hiPSCs, co-transfiziert 2,5 μg sgRNA, 2,5 μg Cas9 und 50 μg Targeting-Vektor. Für die Doppel-Nickase-Strategie fügen Sie 50 μg Zielvektor hinzu, 2,5 μg jeder sgRNA (wobei Cas9n durch den Vektor co-exprimiert wird).
  3. Selektieren Sie Klone durch positive und negative Selektionen, wie beschrieben24,25.
  4. Identifizierung positiver Klone durch Southern-Blot-Analyse oder genomische Langstrecken-PCR24,25.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Vektoren mit allen notwendigen Komponenten, einschließlich Homologiem Armen, Reporterkassette, positiven und negativen Selektionskassetten, werden konstruiert (Abbildung 1). Basierend auf dem endogenen genomischen Locus werden mehrere (2 bis 3) sgRNAs (bei Verwendung des Cas9-Systems) oder sgRNA-Paare (bei Verwendung der Cas9n-Doppel-Nickase-Strategie) entworfen und in die human-gRNA-Expressionsvektoren MLM3636 oder pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) eingebaut (Abbildung 2). Vor de...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Gen-Targeting ist ein wesentliches Werkzeug zur Charakterisierung von Genfunktionen. Der relativ geringe Wirkungsgrad erfordert jedoch arbeits- und zeitintensive Arbeit. In jüngster Zeit hat die Entwicklung von Genom-Editing-Tools wie dem CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-assoziiert) die Targeting-Effizienz erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung von linienspezifischen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reportern unter Verwendung d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Abteilung für Neurochirurgie, dem Staman Ogilvie Fund der Memorial Hermann Foundation, dem Bentsen Stroke Center am Health Science Center der University of Texas in Houston und der Mission Connect TIRR Foundation.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgen20350
pKD3 Addgene45604
pKD46Das Coli Genetic Stock Center, CGSC7634
PGK-neo-bpA-Sequenz Addgene13442
Humane BAC-Klone von Zielgenen 
JDS246 (Cas9-003), Säugetier-Codon-optimierter Streptococcus pyogenes Cas9-3X FlagAddgene43861
MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector mit U6-Promotor Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)Addgene42335
sgRNA-Design, ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/ Off-Target-Vorhersagetool
CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA Primer SyntheseSigma
One Shot Top10 Electrocomp E. Coli Kompetente ZellenLife TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
RestriktionsenzymeNEB und Life Technologies
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearechD4007
DNA-SchnellextraktionspufferEpizentrumQE0905T
Herculase II Fusion DNA-PolymerasenAgilent Technologies600675
Verdauungspuffer 2New England Biolab
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
TeSR-E8 Kit für hESC/hiPSC-Erhaltungs-Stammzelltechnologien05940
Ultrareine AgaroseLife Technologies16500-100
50xTAELife TechnologiesB49
Essential 8 medium Life TechnologiesA1517001
Dulbecco s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium Life TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 mit Glutamax Life Technologies10565018
D-MEM mit Glutamax Life Technologies10566040
für fötales Rinderserum-ES-Zellen qualifiziert Life Technologies10439
Knockout-Serum-ErsatzLife Technologies10828010
2-Mercaptoethanol 1000X Life Technologies21985023
nicht-essentielle Aminosäuren Life Technologies11140050
Stempro Accutase Life TechnologiesA1110501
Distribution Life Technologies17105-041
0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung Life Technologies25200-056
Geltrex  Life Technologies     12760-013
ROCK-Inhibitor Y-27632Millipore    SCM075
SMC4 Reagenz BD354357
Neomycin-resistentes MEF MilliporePMEF-NL
Hygromycin-resistent MEF MilliporePMEF-HL
G418 (Geneticin)LifeTechnologies11811
Hygromycin B Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridin, 1-2-Desoxy-2-fluor-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil  Moravek Biochemikalien und Radiochemikalien    M251
Elektroporator: Genpulser Xcell Bio-Rad
0,4 cm Elektroporationsküvette Bio-Rad165-2088
DIG-Starterkit für die Prime-DNA-Markierung und -Detektion II Roche11585614910
Hybridisierungs-Denaturierungslösung VWR82021-478
PCR-DIG-Sonden-Synthesekit Roche11636090910
DIG Waschset Roche11585762001
Anti-Digoxigenin (DIG-AP)Roche11093274910
CSPD-Chemilumineszenz-System Roche11755633001
DIG Wasch- und Blockpuffer-Set Roche11585762001
50X TAE-PufferLife Technologies24710030
Blotting-Puffer (25 mM Tris pH 7,4,  0,15 M NaCl,  0,1% Tween20)
Hoefer Ultraviolett Vernetzer Fisher Scientific03-500-308
Spermidin FisherAC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7,5)VWR    200064-506
Denville Scientific blaue Biofolie 8x10 Fishernc9550782
DNA-Molekulargewichtsmarker II ( DIG-markiert )Roche11218590910
Amersham Blotting-Membran Hybond-N+ Roche95038-400
Pyrex Glas-Trockenschale Fisher15-242A
Kimberly-Clark Papierhandtücher mit C-Faltung Fisher06-666-32B
Whatman 3MM Papier (26X41)Fisher    05-713-336
Hybridisierungsbeutel Roche11666649001
Hybridisierungstuben Fisher13-247-300
Hybridisierung Ofen Drehspieß Shake 'n' Stack FisherHBMSOV14110
https://bacpac.chori.org

Referenzen

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  3. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
  4. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
  5. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  7. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
  8. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
  9. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
  10. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  11. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
  12. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
  13. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
  14. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
  15. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
  16. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
  17. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  18. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
  19. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  20. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
  21. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
  22. Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
  23. Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
  24. Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
  25. Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Generierung von Knockin ReporternKonstruktion des Targeting VektorsDesign der Single Guide RNAT7 Endonuklease AssayVorhersage von Off Target Stellenhomologe RekombinationPlasmidpr paration
Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.