Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Zusammenfassung

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Zusammenfassung

Konfokale Mikroskopie ist das Verfahren der Wahl für die Analyse der Lokalisierung von mehreren Zelltypen in komplexen Geweben, wie Knochenmark. Jedoch ist die Analyse und Quantifizierung der zellulären Lokalisation schwierig, da es in vielen Fällen beruht auf manueller Zählung, wodurch damit das Risiko der Einführung einer Bewerterabhängigen Bias und Verringerung Interraterreliabilität. Darüber hinaus ist es oft schwierig, ob die Co-Lokalisation von zwei Zellen ergibt sich aus beliebiger Positionierung beurteilen, insbesondere wenn die Zelltypen unterscheiden sich stark in der Häufigkeit ihres Auftretens. Hier wird ein Verfahren zur Quantifizierung der zellulären unvoreingenommene Kolokalisation im Knochenmark eingeleitet. Das Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung zur histologischen Schnitten der gesamten murinen langen Knochen wie dem Knochenmark zu erhalten, sowie die Färbungsprotokoll und den Erwerb von hochauflösenden Bildern. Eine Analyse Workflow spannt sich von der Anerkennung der blutbildenden und nicht-Hematopoietic Zelltypen in 2-dimensionale (2D) Knochenmark Bilder in der Quantifizierung der direkt zwischen diesen Zellen präsentiert wird. Dies beinhaltet auch eine Nachbarschaftsanalyse, um Informationen über die zelluläre Mikroumgebung eines bestimmten Zelltyps zu erhalten. Um zu bewerten, ob die Co-Lokalisierung von zwei Zelltypen ist das bloße Ergebnis zufälliger Zellpositionierung oder reflektiert bevorzugte Verbindungen zwischen den Zellen, ein Simulationswerkzeug, das für die Prüfung dieser Hypothese im Falle von hämatopoetischen sowie Stromazellen, ist verwendet. Dieser Ansatz ist nicht auf die Knochenmark beschränkt und kann auf andere Gewebe verlängert werden, um reproduzierbare quantitative Analyse der histologischen Daten ermöglichen.

Einleitung

Aufgrund der jüngsten schnellen technologischen Entwicklungen in der Mikroskopie, einschließlich optischer Bildverarbeitung, ist die Analyse von Zellen im Rahmen des gesamten Gewebes für Immunologen immer zugänglich. Die Charakterisierung der einzelnen Zellen in Suspension eine wertvolle und unverzichtbare Methode, um zelluläre und molekulare Funktion zu verstehen. Jedoch ist die Analyse der Zellen in ihrem (Mikro-) -anatomical Umgebung wesentlich für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, die in komplexen Prozessen zusammenarbeiten wie die Entwicklung von Immunantworten.

Während es relativ einfach für Mikroskopikern qualitative Informationen aus Bildern erhalten bleibt es eine Herausforderung, diese Daten zu quantifizieren, teilweise aufgrund der Tatsache, dass die Analyse-Methoden in diesem Bereich hinter Vergleich zu dem, was in der Bildaufnahme möglich zurückbleibt. Viele Forscher verlassen sich immer noch auf zeitraubende manuelle Zellzählung in der Histologie Bilder,damit die Einführung einer Vorspannung zwischen verschiedenen Rater und behindern die Replikation von anderen Gruppen. Oft wird ein repräsentatives Bild gewählt, um eine Aussage über zelluläre Position oder Co-Lokalisation in einer Publikation zu unterstreichen, dass es schwer für den Leser auf die statistische Relevanz eines solchen Ereignisses zu beurteilen.

Zusammen mit der Tatsache, dass das volle Informationsgehalt der Bilddaten wird nur selten genutzt, unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine unvoreingenommene, schneller und umfassender Ansatz zur histologischen Bilder analysieren.

Das Knochenmark ist ein komplexes Gewebe, die auf wichtige Lebensfunktionen als Organ der Hämatopoese bei erwachsenen Wirbeltieren findet. Abgesehen davon, dass der Geburtsort für hämatopoetische Zellen ^1,2 und spielen eine wichtige Rolle in B-Lymphozyten-Entwicklung ^3, wirkt es auch als ein Ort, an dem Immunreaktionen ausgelöst werden ⁴ und unterstützt reifen, rezirkulierenden B-Zellen ^5. Zusätzlich ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung immunological Speicher wird zunehmend in den letzten zehn Jahren geschätzt, weil verschiedene Arten von Zellen Immungedächtnis bilden haben sich dort aufzuhalten, ^6-9.

Die Beziehung zwischen der komplexen Gewebearchitektur des Knochenmarks und seine Funktionen nach wie vor schwer. Im Gegensatz zu sekundären lymphatischen Organe, die in Makro Fächer wie T- und B-Zell-Zonen organisiert sind, fehlt dem Knochenmark eine klare Makro Kompartimentierung. Bisher getrennte Kompartimente im Knochenmark sind durch ihre Nähe zu der Knochenrinde bzw. an Vaskulatur definiert. Die Bedeutung der verschiedenen resident stromalen Zellpopulationen im Knochenmark für eine Reihe von Prozessen, wie Stütz Stammzellen, die Entwicklung von B-Zellen oder die Wartung von Gedächtnis-Immunzellpopulationen (wie langlebige Plasmazellen (PCs), CD4 ⁺ und CD8 ⁺ Gedächtnis-T-Zellen), zeigt deutlich, dass es einen gewissen Grad von Mikro-Kompartimentierung im Knochenmark.

Diese Beobachtungen haben zu dem Konzept der unterschiedlichen microanatomical Nischen, die in bestimmten Funktionalitäten (Erhaltung von Stammzellen, B-Zell-Entwicklung bei verschiedenen Stufen, und die Wartung des immunologischen Gedächtnisses) im Knochenmark spezialisierten geführt. Zwar scheint es eine gewisse Heterogenität zwischen den Nischen, die verschiedenen Funktionen dienen, einige der Faktoren, die von Stromazellen, wie CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) oder Interleukin 7 (IL-7), hergestellt werden, sind wichtige Komponenten für einige dieser Nischen ^10. Die Visualisierung und Charakterisierung von Stromazellen des Knochenmarks ist schwierig aufgrund ihrer morphologischen Merkmale mit langen, dünnen dendritischen Fortsätze bilden ein Netzwerk in der gesamten Knochenmark und das Fehlen geeigneter Marker stromal Subpopulationen zu unterscheiden.

Es ist noch nicht klar, inwieweit diese Nischen gemeinsame Merkmale hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen composition, und welche Elemente machen eine bestimmte Nische einzigartig. Neben Stromazellen wurden hämatopoetischen Zelltypen wurde gezeigt, dass eine entscheidende Rolle, indem sie bestimmte Signale zumindest für einige der Nischen spielen. Offensichtlich ist die Komplexität der Nische Zusammensetzung erfordert deren Analyse in situ, und es wird immer wichtiger für Immunologen und Hämatologen zum Vergrößern auf das Knochenmark-Mikroarchitektur, zum Beispiel durch die Analyse der räumlichen Beziehungen zwischen ihren zellulären Komponenten.

Hier wird eine Strategie, um zelluläre Kolokalisation und Nachbarschaftsbeziehungen im Knochenmark in einem automatisierten und unvoreingenommene Weise zu quantifizieren wird vorgestellt. Eine detaillierte Arbeitsablauf einschließlich der Erzeugung von chimären Mäusen, Beherbergung Fluoreszenz Stromazellen und nichtfluoreszierenden hämatopoetischen Zellen, Herstellung von histologischen Schnitten von entkalkte Knochen, Akquisition von konfokalen Bildern, die den gesamten Knochen, sowie die automatische Bildanalyse der zellulären co-Lokalisierung und dessen Validierung / Diskriminierung aus zufälligen Positionierung durch ein Simulationstool zur Verfügung gestellt (Abbildung 8).

Protokoll

Die Tierversuche wurden von den zuständigen staatlichen Komitees für Tierschutz (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) zugelassen und wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften (Tierversuch Lizenz G0194 / 11) durchgeführt.

1. Erzeugung von Fluoreszenz-Knochenmark-Chimäre Mäuse

HINWEIS: Die Erzeugung von Fluoreszenzknochenmark chimäre Mäuse zu Knochenmarkstromazellen visualisieren ausgeführt wie zuvor ⁹ beschrieben.

1. Starten Sie die Behandlung von Del-Cre x ROSA-tdRFP Mäusen (Mäusen Tandem rot fluoreszierendes Protein (tdRFP) ubiquitär ^11-13 Ausdruck), um sie für die Bestrahlung vor. Alternativ können Sie auch eine andere Sorte mit ubiquitäre Expression des fluoreszierenden Proteins. Verabreichen 1 mg / ml Neomycin und 1 mg / ml von Vitaminen (A, D3, E, C) über das Trinkwasser zwei Tage vor der Bestrahlung.
2. Bestrahlen Mäuse zweimal mit 3,8 Gray mit einem Cäsium-137 Gamma-Strahler widünn ein Intervall von 3 Stunden. Hierzu legen Mäusen in einer Bestrahlungs pie Käfig für den jeweiligen Bestrahlungs.
   HINWEIS: Bei der Bestrahlung von Mäusen, unser Institut keine Narkose. Befolgen Sie die lokalen institutionellen Richtlinien bezüglich Anästhesie für die Bestrahlung. Behandeln Tiere mit 5 mg / kg von Carprofen subkutan (sc) am Tag nach der Bestrahlung, wenn Anzeichen von Schmerz.
3. Am nächsten Tag rekonstituieren Mäuse durch intravenöse Injektion von 3 x 10 ⁶ Knochenmarkszellen von Röhrenknochen von C57BL / 6-Spendermäuse in Transferpuffer ⁹ hergestellt. Halten Sie die Maus auf Neomycin und Vitamine für bis zu 2 Wochen und ihr Wohlbefinden und das Gewicht in dieser Zeit zu überwachen. Warten Sie mindestens 4 Wochen bis zur Wiederherstellung des Immunsystems, bevor die spezifischen experimentellen Behandlungen ermöglichen (zB Impfungen) ^9.
4. Sacrifice Mäusen und legen Sie sie auf einer Dissektion Bord, sterilisieren die Beine mit 70% Ethanol. EuthanizE-Mäuse gemäß den örtlichen Institutionelle Politiken. Unser Institut führt Genickbruch.
5. Verwenden einer Pinzette und Schere, um die Haut von den Oberschenkeln zu entfernen. Entfernen Muskelgewebe um die Oberschenkelknochen aus. Luxieren die Oberschenkelknochen von der Hüfte und Kniegelenk mit einer Pinzette und Schere. Achten Sie darauf, nicht zu brechen oder schneiden Sie die Knochen.
6. Entfernen Sie vorsichtig verbleibende große Stücke von Muskelgewebe und Knorpel vom Knochen mit einer Schere. Entfernen Sie verbleibende Muskelgewebe durch Reiben der Knochen mit Laborseidenpapier. Sammeln der gereinigten Knochen in einer Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
7. Fix gesamten Femurknochen in 4% Paraformaldehyd (PFA, Elektronenmikroskopie-grade) für 4 - 6 Stunden.
8. Entsorgen PFA und Inkubation Knochen in 10% Saccharose in PBS O / N. Am nächsten Tag, brüten die Knochen in 20% Saccharose O / N. Der Tag nach, brüten die Knochen in 30% Saccharose O / N.

2. Kryoschneiden of Bones

HINWEIS: Nach der 16-24 h in 30% Saccharose, einfrieren Knochen und Kryoschnitt sie nach Kawamoto der Bandmethode ^14,15.

1. Bereiten Sie einen großen Becher (2000 ml Volumen) mit Trockeneis und Aceton (etwa 2: 1 Volumenverhältnis, beispielsweise 400 ml trockenem Eis und 200 ml Aceton) unter einer Abzugshaube. Setzen Sie einen kleinen Becher (150 bis 250 ml Volumen) mit Hexan innen (30 - 50 ml ungefähr). Warten für die Mischung abkühlen (etwa 10 min, bis zum Frost an der Außenseite des großen Becher erscheint).
2. Füllen ¾ des markierten cryomold Super Cryoembedding Medium (SCEM); Legen Sie das Knochen im Inneren, bis sie vollständig eingetaucht, wobei darauf geachtet, dass sie die Kanten der Form nicht berühren. Mit großen Zange halten Sie die cryomold in das Becherglas mit dem Boden der Form nur an der Oberfläche des Hexan berühren.
   1. Lassen die Außenkanten der SCEM Kühlschrank (durch Opazität deutet erfolgt dies etwa 15 sec). Dann die Form vollständig Drop in das Hexan und lassen Sie es freeze mit 1 - 2 Min. Nehmen Sie die gefrorene Probe und wickeln in Zellophan und Aluminiumfolie (die Probe vor dem Austrocknen zu schützen und Lichteinwirkung zu vermeiden). Lagerung bei -80 ° C bis Kryoschneiden.
3. Für Kryoschneiden der Oberschenkelknochen mit einem Standard-Mikrotoms und Mikrotomklingen für Hartgewebe.
4. Die Sample- und Schaufeltemperatur des Mikrotoms bis -24 ° C. Lassen Sie die Probe im Inneren des Mikrotoms sich für etwa 15 Minuten vor dem Schneiden.
   1. Befestigen Sie den Probenblock mit dem Metallprobenhalter mit SCEM oder optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium. Passen die Ausrichtung des Blocks, falls notwendig. Schneiden Sie die Probe, bis der Knochen vollständig geöffnet ist und das Mark zu sehen ist. Stellen Sie die Schnittdicke bis 7 um (verwerfen den ersten Abschnitt).
   2. Befestigen Sie ein Stück von Kawamoto Band mit der Klebeseite auf der Oberseite des Probenblocks mit einer Rotwild lederbezogenen Holzspachtel. Anschließend schneiden Sie die Probe, und schalten Sie das Band, so dass der Abschnittauf der Oberseite positioniert. Übertragen Sie das Band auf einem Objektträger mit einer Pinzette. Bringen Sie das Klebeband auf dem Objektträger mit Klebeband.
5. Lassen Abschnitte trocken für mindestens 30 Minuten und speichert sie bei -80 ° C bis zur Verwendung. Bewahren ungefärbten und post Folien in Kunststoffschieber Boxen mit Abstandshalter zwischen den einzelnen Folien, um zu vermeiden, dass sie zusammenhalten. Stained und Dias können bis zu einer Woche im Karton Dia Ordner bei 4 ° C gelagert werden.

3. Bildsammlung

1. Tauen und schmutz Kryoschnitte nach gemeinsamen Immun Protokolle ^9. Umfassen eine Kernfärbung, beispielsweise, 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI), um die Gewebeintegrität zu visualisieren.
   Hinweis: Beize, beispielsweise zur RFP Stromazellen (anti-RFP-Biotin-Antikörper und Streptavidin-Alexa Fluor 555), Flecken Eosinophilen mit Ratten-Anti-major basic protein (MBP) Antikörper und Anti-Ratten-Alexa Fluor 647-Antikörper zu visualisieren , B-Zellenmit Ratten-anti-B220-Alexa Fluor 594-Antikörper und PCs mit Anti-κ-Leichtkette-Fluorescein-iso-thiocyanat (FITC) und Anti-λ1 leichte Kette-FITC-Antikörper (Details des Färbungsverfahren sind in ⁹ beschrieben).
2. Montieren gefärbten Schnitten: setzen Sie einen Tropfen Fluoromount auf der Strecke und dann die Abdeckung mit einem # 1 Deckglas, wobei eine klare die Bildung von Luftblasen. Anschließend durchführen Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie mit einem Instrument mit Laserlinien für die Färbung ausgestattet.
3. Um Bilder zur automatisierten Co-Lokalisation von Knochenmark hämatopoetischen Zellen mit Stromazellen mit dem Wimasis Werkzeug, gelten die folgenden Einstellungen auf:
   1. Verwenden Sie eine 20-fach Objektiv und ein Sichtfeld von 708,15 x 708,15 & mgr; m. Für automatisierte Analyse, halten Sie die Größe aller Bilder konsistent 2048 x 2048 Pixel (px), um die Ergebnisse vergleichbar zu halten.
   2. Nehmen einen Kanal für Stromazellen Strukturen (zB 561 nm Laserlinie), einen Kanal für die Kerne (zB DAPI, 405 nm) und zusätzliche Kanäle für die hämatopoetischen Zellen von Interesse (zB 3 Kanälen 488/594/633 nm für Eosinophile, B-Zellen und PCs).
   3. Nehmen Sie Bilder mit Hilfe Linie durchschnittlich 4 ^16. Idealerweise decken die gesamte Oberschenkelbereich, indem sie einzelne nebeneinander liegende Bilder. Alternativ können Sie auch nicht benachbarte Bilder aus verschiedenen Regionen des Knochenmarks (diaphysären sowie Epiphyse).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Überschneidungen zwischen benachbarten Bilder (zum wiederholten Analyse von Zellen in den Überlappungsbereichen zu vermeiden) zu produzieren.
4. Speichern Sie die Bilder in einem Mikroskopie-Bilddateiformat. Überprüfen und, wenn nötig, passen Sie den Kontrast für alle Kanäle in der Bildanzeige / Analyse-Software.
5. Export 3 JPG-Dateien pro Bilddatei: eine JPG-Datei für die DAPI-Kanal (Rot / Grün / Blau (RGB) Format, falsche Farbe in gelb codiert), einer JPG-Datei für das Stroma Kanal (Graustufen) und einer .jpg Datei mitdie Kanäle für blutbildenden Zellen (3 Kanäle maximal, RGB-Format, zB FITC (PCs, falsche Farbe: grün) / Alexa Fluor 594 (B-Zellen, falsche Farbe: blau) / Alexa Fluor 647 (Eosinophilen, falsche Farbe: rot)) .

4. Automatisierte Bildanalyse

1. Verwenden Sie ein Bild-Analyse-Tool zur Bildsegmentierung, Quantifizierung von Co-Lokalisation und Nachbarschaftsanalyse (siehe Diskussion) durchzuführen.
2. Bei Verwendung der Wimasis Werkzeuge, wie folgt vorgehen:
   1. Laden Sie die Gruppen von 3 JPG-Dateien pro Bild mit dem gleichen Dateinamen, gefolgt von einem Unterstrich und einer Zahl, die die Art des Bildes.
   2. Verwenden _1 für die JPG-Datei mit blutbildenden Zellen, _2 für die JPG-Datei für die DAPI-Kanal, _3 für die JPG-Datei für das Stroma-Kanal. Zum Beispiel: Image1_1.jpg (blutbildenden Zellen), Image1_2.jpg (DAPI-Kanal) und Image1_3.jpg (Stroma-Kanal). Laden Sie die Bilder über das Kundenkonto.
   3. Für Zellkontakt Quantifizierungwählen Sie die Zell-Kontakt-Tool, indem Sie auf das entsprechende Feld. Für Zell Nähe Quantifizierung, wählen Sie die Zelle Nähe Werkzeug und geben Sie die bevorzugte Umgebung Radius um (die aus den Zellen "Kanten gemessen wird).
   4. Laden Sie die Ergebnisse.
      HINWEIS: Die Ergebnisse werden als JPG-Dateien, die die blutbildenden Zellen und die Stroma-Kanal mit den Grenzen der erfassten Objekte hervorgehoben, ebenso wie einzelne CSV-Dateien, die die Messwerte für jedes Bild auf eine Zusammenfassung zur Verfügung gestellt, die neben CSV-Datei, enthält die Daten für alle hochgeladenen Bilder.
3. Von der Kontaktmessungen bestimmen die Frequenz der hämatopoetischen Zellen (rote, grüne oder blaue Zellen) in Kontakt mit Stromazellen oder die Frequenzen der roten, grünen oder blauen Zellen Inkontaktbringen der anderen hämatopoetischen Zelltypen (ein Beispiel ist in Repräsentative Ergebnisse gezeigt , Abbildung 4). Um die Frequenzen zu bestimmen, teilen Sie die angegebenen Kontaktdaten Zählungen pro Bild durchdie Gesamtzellzahlen pro Bild.
   1. Für Experimente mit einzelnen Mäusen, fassen die Gesamtkontaktzahl aller Bilder für die einzelnen Mäuse und teilen sie durch die Summe der Gesamtzellzahl aller Bilder.
4. Aus der Umgebung Messungen bestimmen die Frequenz der roten, grünen oder blauen Zellen in der ausgewählten Entfernung von Stromazellen und / oder der Frequenzen der roten, grünen oder blauen Zellen in der bevorzugten Nähe zu den anderen hämatopoetischen Zelltypen, wie in Schritt 4.3 beschrieben ( siehe auch Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4).

5. Simulation von Zufallsknochenmarkpositionierung

1. Vor der Ausführung der Simulation von zufälligen Zellpositionierung auf den analysierten Knochenmark histologische Bilder, bereiten Sie die folgenden Dateien im Voraus: die einzigen CSV-Dateien, die vom Zellkontakt-Tool, den ursprünglichen JPG-Dateien für die DAPI-Kanal und den ursprünglichen JPG-Dateien zur Verfügung gestellt für die Stroma-Kanal.
2. Zur DurchführungBatch-Simulationen auf einer Reihe von Bildern (zB alle Bilder von einer Oberschenkelbereich), sammeln Sie alle Original-JPG-Dateien (_1, _2 und _3) und die entsprechenden einzelnen CSV-Dateien in einem Ordner.
   HINWEIS: Das Simulationstool für zufällige Knochenmarkzellpositionierung ist auf Anfrage erhältlich.
3. Starten Sie das Simulationswerkzeug, das Kontrollkästchen "Auto-Load-Bilddaten".
   HINWEIS: Das Programm wird die Zellzahl und durchschnittliche Zellgröße von der CSV-Datei automatisch gelesen. Diese Werte werden in den Feldern für "Die Zellzahl" und "Zellgröße AVG" (5A) angezeigt.
4. Geben Sie den gemeinsamen Tag für die CSV-Dateien, dh der gemeinsame Faktor in ihrem Namen. Geben Sie die Anzahl der Bilder, die für die im Batch-Verfahren Simulation verwendet werden sollen.
5. Laden Sie die vom Stroma Kanal erzeugt JPG-Datei (mit Dateiname endet _3).
6. Geben Sie die Einstellungen zur Erzeugung der Maske von der DAPI-Kanal:
   1. Markieren Sie das Kästchen "? Die Maske "Stellen Sie den Schwellenwert für die Umwandlung der DAPI-Bild in ein binäres Masken bis 10 (0 - 255).
   2. Markieren Sie das Kästchen "8-bit?" Das Kontrollkästchen "Dilate?" Und stellen Sie den Grad der Erweiterung um 5 Pixel. Aktivieren Sie das Feld "w / Erosion?".
   3. Der gewünschte Wert für die Umgebung Radius (Nachbarschaft Radius) zur Analyse der simulierten Bildern verwendet. Für ein Bild von 708.15 x 708.15 & mgr; m mit einer Größe von 2.048 x 2.048 Pixel (Pixelskalierung xy: 0,346 um), 29 Pixel entsprechen 10 & mgr; m.
7. Kontrollkästchen "Otsu?", Um Otsu-Algorithmus ¹⁷ für die automatische Erkennung von Stroma-Strukturen verwenden.
   Anmerkung: Dies ist das gleiche Algorithmus, der durch die Kontaktregion Werkzeug verwendet wird. Unter Verwendung des gleichen Bildsegmentierungsalgorithmus in der automatisierten Analyse der aufgezeichneten Bild und dem simulierten Bild ist, um die Daten vergleichbar zu halten entscheidend.
8. Geben Sie die Einstellungen für die blutbildenden Zellen, die are als Kreisformen simuliert.
   HINWEIS: Die Zellzahlen für Rot, Grün und Blau Zellen direkt aus der CSV-Datei geladen wird (siehe auch Schritt 5.6).
   1. Verwenden Sie das Simulations-Tool, um den mittleren Durchmesser in Pixel des roten, grünen und blauen Zellen zu berechnen. Bestimmung der durchschnittlichen Fläche einer einzelnen Zelle als die Gesamtfläche jedes Zelltyps in dem Bild in Pixel geteilt durch die Gesamtzellzahl pro Bild. Verwenden des Durchschnittsfläche, um den Radius einer Scheibe unter Verwendung der Formel berechnet werden. Verdoppeln des Radius, um den Durchschnittsdurchmesser zu bestimmen.
9. Messung der Zellgrößenverteilung der untersuchten Zelltypen bei jedem der Bildanalyse-Software, die Objektsegmentierung Funktionen umfasst. Bestimmen σ für alle hämatopoetischen Zelltypen ⁽¹⁸ und 5B).
   Anmerkung: Da die Zellgrößenverteilung der aufgenommenen Zellen werden nicht durch die automatisierte Bildanalyse bestimmt, mit einem Gauß-Verteilung als eine Annäherung an die realen Verteilungen. Die Breite ter Verteilungskurve wird durch σ beschrieben und kann ziemlich unterschiedlich für verschiedene Zelltypen sein. (Weitere Einzelheiten finden Sie 5B).
   1. Aus diesen Messungen bestimmen die "Zellgrße Cutoff": den Durchmesser in Pixel, die das kleinste Objekt noch als komplette Zelle durch das Bildanalysewerkzeug erfasst beschreibt.
10. Eingeben von Parametern in die entsprechenden Felder auf der grafischen Benutzerschnittstelle (5A).
    1. Geben Sie die Zellgröße abgeschnitten, dh die minimale Zellgröße in der Simulation erlaubt, als Durchmesser in Pixel.
    2. Geben σ in Pixel für die Simulation der Zellgrößenverteilung für Rot, Grün und Blau-Zellen (aus Schritt 5.9).
    3. Überprüfen Sie die "Löschen" Box in der Unterabschnitt "Cells in Mask". Bei dieser Einstellung wird das Programm eine neue Position für eine Zelle ausgewählt, wenn sie mit mindestens einem Pixel mit einem Sperrgebiet der Maske überlappt. Markieren Sie das Kästchen "Vermeiden Zelle überlappen? ̶1; im Unterabschnitt "Zell Ausgrenzung".
    4. Geben Sie den zulässigen Mindestabstand zwischen den Zentren von zwei Zellen in Pixel.
       HINWEIS: Der Mindestabstand muss von den aufgezeichneten Bildern bestimmt werden. Falsch gemessene Mindestabstände werden zu verzerrten / Kunst Ergebnisse für den Vergleich der aufgezeichneten und simulierten Bildern führen.
    5. Stellen Sie die maximale Überlappungsbereich auf 100%, wenn die Überlappung durch den minimalen Abstand von Mitte zu Mitte definiert.
    6. Stellen Sie den Simulationstool zu 1.000 Wiederholungen.
    7. Aktivieren Sie das Feld "Autosave-Zellen?", Um die Koordinaten der simulierten Objekte für alle Wiederholungen jeder Bild der Charge als .rect Dateien (Text Format) speichern. Aktivieren Sie das Feld "Autosave Bild?", Um eine TIFF-Datei für jeden simulierten Bild zu speichern. Geben Sie einen gemeinsamen Tag für die gespeicherten Dateien.
       HINWEIS: Die "? Autosave-Zellen" Option reduziert Simulationslaufzeit und die Gesamtdatenmenge im Vergleich zu beim Speichern des tatsächlichen simulierten images. Die .rect Dateien speichern die Koordinaten der simulierten Zellen als Rechtecke und kann so in simulierte Bilder bei Bedarf umgesetzt werden.
11. Starten Sie die Simulation, indem Sie auf "Run Simulation".
    HINWEIS: Das Simulationstool generiert automatisch eine CSV-Datei für die 1000-Simulationen von jedem Bild, darunter die durchschnittliche Kontaktzahlen und Umgebung zählt für rote, grüne und blaue Zellen mit roten, grünen, blauen und Stromazellen für jeden Satz wiederholte Simulationen . Zusätzlich wird für alle diese Werte Durchschnittswerte der 1.000 Simulationen mit Standardabweichung (STD) und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) vorgesehen sind.
12. Bestimmen Sie die durchschnittliche Kontaktfrequenzen und Umgebung Frequenzen von einem Satz von 1000 simuliert Bilder. Dazu teilen Sie die durchschnittliche Kontakt und Umgebung zählt durch die aufgenommenen Zellzahl pro Bild. Vergleichen der Frequenzen zu den Ergebnissen des automatisierten Kolokalisation Analyse des aufgezeichneten Bildes.
13. Tragen Sie geeignete statistical Methoden abhängig von der Analyse ¹⁹ (für 7 haben wir ein zweiseitigen Wilcoxon-Test).

Ergebnisse

Schneid Kryoschnitte nichtentkalkter Knochen mit der Kawamoto Band-Methode ermöglicht schneiden den ganzen Knochen zu werden als intakte Abschnitt, mit dem Knochenmark des endostalen Region noch mit dem mineralisierten Knochen befestigt, die beide in der Diaphyse sowie in den Epiphysen Gebiete mit ihren hohe Dichte von trabekulären Knochen (Abbildung 1). Kernfärbung der Abschnitte zeigt, dass, obwohl kleine Risse in der Herstellung nicht vollständig vermieden werden können, die Struktur der Sinusoide un...

Diskussion

Trotz der Fortschritte in der modernen optischen Bildgebungsverfahren, die Analyse von histologischen Daten oft noch durch das Fehlen von geeigneten Quantifizierungs Werkzeuge und Methoden, oder durch vorgespannte Analysen, die auf einer kleinen Fläche von Interesse konzentrieren behindert. Die synergistische hier vorgestellte Ansatz kombiniert Bildanalyse für die gesamte Knochenmark Region, automatisierte Segmentierung und Objekterkennung von verschiedenen hämatopoetischen und Stroma-Zelltypen, die Co-Lokalisierung Ana...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycintrisulfatsalzhydrat, EU Gefahrencode: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml enthält: 50.000 I.E. Retinylpalmitat, 5.000 I.E. Cholecalciferol, 30 mg Tocopherylacetat, 100 mg Ascorbinsäure, 1 mg Sorbinsäure, 200 mg Polyoxyl 35 Rizinusöl, 0,5 mg Propylgallat
Transferpuffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml Penicillin/Streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetylhapten, konjugiert mit Hühner-Gammaglobulin Hühner-Gammaglobulin
(CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20%ige Paraformaldehyd-Lösung (EM-Qualität)	Science Services	15713	EU-Gefahrencodes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-Saccharose	Carl Roth	4621.1
Trockeneisaceton
	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU-Gefahrencodes: GHS02, GHS07
Hexan	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH EU-Gefahrencodes	: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek Kryoformen (Standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM-Einbettungsmedium	Section-Lab, JP
Kawamotos Kryosektions-Vorbereitungskit	Section-Lab, JP
Kawamoto's Kryofilm Typ 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome Blade MX35 Premier Plus, Low Profile	Thermo Scientific		3052835 L x B: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), Dicke: 0,25 mm (0,01") Polyklonaler
Kaninchen-Anti-RFP-Antikörper, biotinyliert	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Leben Technologien	S-32355
Ratte Anti-MBP	J. und N. Lee		erhältlich bei: J. und N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, U.S.A., Klon MT-14.7
Ziege Anti-Ratte-Alexa Fluor 647<	a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"> Life Technologies	A-21247
Ratte Anti-B220 - Alexa Fluor 594			Eigenproduktion und Kopplung (DRFZ), Klon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 von Life Technologies
Maus Anti-L1-Leichtkette - FITC			hergestellt und gekoppelt im eigenen Haus (DRFZ), Klon LS136
Ratte Anti-K-Leichtkette - FITC			hergestellt und gekoppelt im eigenen Haus (DRFZ), Klon 187.1
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluoreszierendes Eindeckmedium	DAKO	S3023
Deckgläser (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost Dias Gläser (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Konfokales Laserscanning-Mikroskop			mit Laserlinien von 405, 488, 561, 594, 633 nm und einer 20X/0,8 NA Luftobjektivlinse. Wir haben eine Zeiss LSM710 und Zen 2010 Version 6.0 Software verwendet.
Automatisierte Bildanalyse-Tools für Knochenmark	Wimasis, München		Das Zellkontakt-Tool und das Zell-Vicinity-Tool werden von Wimasis auf Anfrage zur Verfügung gestellt.
VC2012 Runtime	Microsoft		kostenloser Download
Simulationstool zur zufälligen Zellpositionierung			bei uns erhältlich, auf Anfrage
Bildanalysesoftware mit Bildsegmentierungsfunktionen			Wir haben Volocity (Perkin Elmer) zur Messung der Zellgrößenverteilung von hämatopoetischen Zelltypen im Knochenmark verwendet (Abbildung 5). Alternativen sind Definiens Image Analysis (Definiens) oder Cell Profiler (kostenloser Download)
Bildanalysesoftware für Fidschi			kostenloser Download. Fiji wurde von geschulten Ratern für die manuelle Zellzählung verwendet (Abbildung 3).